MUESTRA DE CLCULOS

Platos tericos: Donde: tr= Tiempo de retencin y w= Ancho de base del

pico

.
Patrn A (Pico Acetaminofen 275 nm):

Patrn A (Pico Acetaminofen 254 nm):

Resolucin: Donde: tr1= Tiempo de retencin Acetaminofen, tr2= tiempo

de retencin cafena w= correspondiente

Patrn A 275 nm:

Patrn A 254 nm:

Tiempo de retencin neto o relativo: Donde: tr=tiempo de retencin, tm=

tiempo muerto

Patrn A (pico Acetaminofen 275 nm ):

Patrn A (pico Acetaminofen 254 nm ):

ANALISIS CUANTITATIVO
Solucin estndar interno: 6 mcg
Solucin de Cafena: Peso 0,0126 99% Pureza

Solucin de Acetaminofen: Peso 0,0125

Soluciones curva de calibracin:

Concentracin de Acetaminofen en Punto A:

Concentracin de Cafena en Punto A:

Concentracin de patrn interno en Punto A:

Punto

A
B

Volumen
tomado de
S.M de
Acetaminofen
mL
3
2,5

Concentracin
De
Acetaminofen
Final mcg/mL
150
125

Volumen
tomado de
S.M. de
cafena
mL
3
2,5

Concentracin
final de
Cafena mcg/
mL

Concentracin
de Estndar
primario
mcg/mL

19,5
16.25

0,6
0,6

C
2
100
2
13
0,6
D
1,5
75
1,5
9,75
0,6
E
1
50
1
6,5
0,6
Tabla1. Datos de concentracin para curva de calibracin de cafena y Acetaminofen.
RESULTADOS
Tiempo de rea
Concentracin rea
Retencin Acetaminofen Acetaminofen Patrn
(min)
(mm2)
(mcg/ml)
Interno

rea
Ac/rea PI

0,7
1841,02051
150
3.656
0,503618614
0,696
2275,96167
125
5826,6958 0,390609318
0,699
891,56439
100
2834,50098 0,314540159
0,698
1085,18689
75
4062,9187 0,267095399
0,695
876,41034
50
4975,82432 0,176133698
Tabla 2. Resultados derivados del cromatograma para la curva de calibracin de Acetaminofen,
mtodo de patrn interno.

0.6

Area Acetaminofen/Area PI

0.5
0.4

y = 0.0031x + 0.019
R = 0.9824

0.3

Calibracion Acetaminofen

0.2
0.1
0

-50

0
50
100
150
-0.1
Concentracion Acetaminofen (ug/ml)

200

Grafica 1. Curva de calibracin para Acetaminofen, mtodo de patrn interno

Tiempo de rea Cafena
Retencin (mm2)
(min)
1,111
1,107
1,107
1,108

918,13684
1239,69568
524,62006
535,83478

Concentracin rea
rea
(mcg/ml)
Patrn
Caf/rea PI
Interno
(mm2)
19,5
3.656
0,25116005
16,25
5826,6958 0,212761353
13
2834,50098 0,185083746
9,75
4062,9187 0,131884199

1,104
479,69385
6,5
4975,82432 0,096404901
Tabla 3. . Resultados derivados de los cromatogramas para la curva de calibracin de cafena,
mtodo de patrn interno.

0.3

Area Cafeina/Area PI

0.25
y = 0.012x + 0.0193
R = 0.992

0.2
0.15

Calibracion Cafeina
0.1
0.05
0

-5

10
mcg/mL

15

20

25

Grafica 2. Curva de calibracin para cafena, mtodo de patrn interno

MUESTRA DE CALCULO DE LA CONCENTRACION DE FARMACOS EN AL

MUESTRA C--Anlisis-

TEORICO ACETAMINOFEN

Peso Tableta: 0,7042 g =704,2 mg

Cantidad declarada de Acetaminofen: 500 mg
Peso Tomado de Acetaminofen: 12,5 mg
Peso muestra: 0,0176 g = 17,60 mg - Exacto

Concentracin Terica De Acetaminofen

EXPERIMENTAL ACETAMINOFEN

Muestra problema C:
rea Acetaminofen: 514.16016
rea P. I.: 1333.30017
Acetaminofen/A. Patrn I.: 0, 3856297
INTERPOLANDO EN LA GRAFICA 1.
Concentracin Acetaminofen:

Cantidad De Acetaminofen:

Cantidad total de activo en tableta:

Porcentaje
(592,168 mg /500 mg) x 100 = 118,43%

CONCENTRACIN TEORICA DE CAFENA

Peso Tableta
704,2 mg
Peso Cafena en Tableta
65 mg
Peso Tomado de la Tableta 17,60 mg
Peso Tomado de Cafena
2,28 mg
Concentracin Cafena
18,24 mcg/mL
Tabla 3. Resumen de los clculos tericos para cafena.
CONCENTRACIN EXPERIMENTAL DE CAFENA
rea Cafena
210,94897
rea PI
1333.30017
rea Caf/rea PI
0,158215
Concentracin Cafena
11,57 mcg/mL
Tabla 3. Resumen de los clculos experimentales para cafena.
3

Devolvindose en la Dilucin
Concentracin de Cafena
11,57 mcg/mL
Masa Cafena en 17,06 mg
1,44 mg
Masa en Tableta
59,69 mg
Porcentaje de Cafena
91,84 %
Tabla 4. Resumen de los resultados obtenidos para la valoracin de cafena de manera
experimental.

PATRON EXTERNO:
Clculos y resultados:
Para realizar la curva de calibracin, se utilizaron diferentes concentraciones de los estndares, para ello
se realizaron las diluciones correspondientes:
Muestra de clculo para la concentracin del estndar de acetaminofn:
Peso: 12.6 mg
Pureza 99%

Muestra
ml para la segunda dilucin
F
3
G
2.5
H
2
I
1.5
J
1
Tabla N1: concentracin de las muestras de estndar para acetaminofn.

concentracin

Muestra de clculo para la concentracin del estndar de cafena:

Peso: 12.6 mg
Pureza 99%

Muestra
F
G

ml para la tercera dilucin

3
2.5

concentracin

H
2
I
1.5
J
1
Tabla N2: concentracin de las muestras de estndar para cafena.
Con las concentraciones reportadas anteriormente, se trabajo para hacer el anlisis pro medio de
HPLC, arrojando los siguientes resultados:
Muestra F = 150g/ml acetaminofen y 19.5 g/ml cafena

Cromatograma N 1 : muestra F
Muestra G = 125g/ml acetaminofen y 16.25 g/ml cafena

Cromatograma N2: muestra G

Muestra H = 100g/ml acetaminofen y 13 g/ml cafena

Cromatograma N 3: muestra H
Muestra I= 75g/ml acetaminofen y 9075 g/ml cafena

Cromatograma N4: muestra I

Muestra J= 50g/ml acetaminofen y 6.5 g/ml cafeina

Cromatograma N 5 : muestra J
Con los datos arrojados por el software para HPLC, se obtiene el area para los picos tanto de
acetaminofen como de cafena, con ello se puede hacer la curva de calibracin para acetaminofen y
tambin para cafena.
rea
Acetaminofen Concentracin
(mm2)
Acetaminofen (ug/ml)
F
1982,7487
150
G
2410,9519
125
H
1742,86169
100
I
1172,70032
75
J
1147,71582
50
0
0
Tabla N3: datos para realizar la curva de calibracin para el acetaminofen
Muestra

Curva de calibracin acetaminofn

3000

Area Acetaminofen

2500
2000
1500
Linear (Series1)
1000
y = 16.327x
R = 0.8652

500
0
0

50

100

150

200

Concentracion Acetaminofen (ug/ml)

Grfica 1: curva de calibracin para el acetaminofen

Concentracin
rea Cafena Cafena
Muestra
(mm2)
(ug/ml)
F
1033,59949
19,5
G
1257,69946
16,25
H
879,6806
13
I
628,96246
9,75
J
631,86249
6,5
0
0
Tabla N4: datos para realizar la curva de calibracin para la cafena

curva de calibracin para cafeina

1400

Area Cafeina

1200
1000
800
600

Linear (Series1)

400
200
0
0

10

15

20

25

y = 65.502x
R = 0.8518

Concentracion Cafeina (ug/ml)

Grafica 2: curva de calibracin para cafena

Tratamiento de la muestra problema:
Para analizar el contenido de una tableta de Dolex Forte, que contiene acetaminofen y cafena, se
utilizaron los datos de MP4:
Peso de la tableta: 693.5 mg
Cantidad de tableta utilizada: 17.4 mg ( 12.5mg acetaminofn)

Cromatograma N 6: muestra problema 4.

frmaco
Acetaminofen
cafena

rea (mm2)
541.56
239.56

Para hallar la concentracin de acetaminofn en la tableta se despeja la ecuacin resultante de

las curvas de calibracin:

Y= 16.327X
X= Y/16.327
X= 541.56/16.327
X= 33,17 g/ml de acetaminofn

Para hallar la concentracin de cafena en la tableta se despeja la ecuacin resultante de las

curvas de calibracin:

Y= 65,502X

X= Y/65,502
X= 239.56/65.502
X= 3,66 g/ml de cafena
Muestra de clculo cantidad de acetaminofn en la tableta:

de acetaminofen en la tableta

165.4 mg

de acetaminofen en la tableta

Cantidad de cafena = 0,4575 mg

Cantidad de cafena en la tableta= 18.23 mg
Porcentaje de cafena en la tableta = 3.65%
CALCULO DE LOS PARAMETROS CROMATOGRAFICOS:

Platos tericos (N)

tr= Tiempo de retencin

w= Ancho de base del pico
Acetaminofen:

muestra
problema
G
H
I
J
F
promedio N

Tiempo de
Retencin (min) ancho del pico
0,717
0,699
0,695
0,695
0,695
0,695

N
0,044
0,0639
0,0735
0,0741
0,0737
0,0731

8497,338843
3829,152064
2861,178213
2815,030934
2845,6705
2892,576367
3956,824487

Cafena

muestra
F
G
H
I
J
problema
promedio N

Tiempo de
Retencin (min) ancho del pico
1,104
1,112
1,105
1,105
1,106
1

N
0,078
0,0689
0,0782
0,0788
0,0783
0,0507

6410,60355
8335,297575
6389,413989
6292,483702
6384,644318
15896,11319
8284,759388

Tiempo de retencin ajustado:

tr-tm=t
0.717-0,57= 0,147

tr=tiempo de retencin
tm= tiempo muerto
Acetaminofen
:

muestra
F
G
H
I
J
problema

Tiempo de
Retencin (min) tiempo muerto
0,717
0,699
0,695
0,695
0,695
0,695

0,57
0,472
0,473
0,486
0,483
0,472

tiempo de retencin ajustado

0,147
0,227
0,222
0,209
0,212
0,223

0,57
0,472
0,473
0,486
0,483
0,472

tiempo de retencin ajustado

0,534
0,64
0,632
0,619
0,623
0,658

Cafena:

muestra
F
G
H
I
J
problema

Tiempo de
Retencin (min) tiempo muerto
1,104
1,112
1,105
1,105
1,106
1

Resolucin:

tr1= Tiempo de retencin acetaminofn

tr2= tiempo de retencin cafena
w= correspondiente

Retencin relativa:
Rr= t2/t1
Rr= 1,104/0,717

muestra
F
G
H
I
J
problema
promedio

Tiempo de
Retencin
Tiempo de Retencin
(min)cafena
(min)acetaminofen
retencin relativa
1,104
0,717
1,112
0,699
1,105
0,695
1,105
0,695
1,106
0,695
1
0,695
promedio

1,539748954
1,590844063
1,589928058
1,589928058
1,591366906
1,625899281
1,587952553

ANALISIS DE RESULTADOS
En el desarrollo de la practica se encontraron varios inconvenientes que no nos permiten
obtener certeza y confianza con en los resultados obtenidos, nicamente la determinacin de la
curva de calibracin fue la ms confiable, an as esta falla en algunos puntos ya que el R 2 no
dice que no es completamente lineal, se desconocen cules son dichos puntos pero no es
conveniente quitar datos ni puntos, lo ms apropiado seria para este caso tener la posibilidad
de desarrollar replicas -mnimo 3- para as poder comparar y escoger la ms apropiada, la que
presente menos desviacin o hacer un promedio de los resultados de dichas replicas. Por otro
lado si la cantidad de puntos fuera mayor tambin es posible realizar un tratamiento estadstico
para corregir los valores que se desvan y obtener una mejor curva de calibracin, pero por
falta de tiempo no es posible desarrollar ninguno de estos mtodos.
Los problemas que se observaron fueron experimentales y no de mtodo, an siendo este tan
sencillo, el primer inconveniente fue la fase mvil, solucin que estuvo mal preparada, pero
esto se soluciono y se realizo la cromatografa, se obtuvieron los cromatogramas de de todas
las muestras, pero en las muestras problemas no se observan los picos del patrn primario, tal
vez porque no se agregaron a la solucin que se llevo al cromatograma o porque la
concentracin no fue la apropiada, ya que se observan pequeos pico en los tiempos de
retencin propios del patrn interno, acido benzoico.
Con lo cual no es posible determinar la relacin rea de analito/rea de patrn interno y
tampoco interpolar para hallar la concentracin de dichas muestras. Entonces dicho objetivo
de la prctica no se cumplira. Con la intencin de comprender mejor la informacin que
podramos obtener de una cromatografa de HPLC y continuar con el tratamiento de datos,
tomamos una muestra problema preparada en otro grupo, pues es similar en la preparacin de
todas las, aunque claro las condiciones diferirn, pero la intencin es comprender y tratar de
obtener conclusiones para aprender. De esta manera se interpolo en las graficas, hallando las
concentraciones de cada activo y la masa en la tableta, se observa que la muestra problema
tiene concentraciones de ambos activos que entran en el rango de la curva de calibracin, pero
para el Acetaminofen la concentracin es mucho mayor (
) a la esperada
tericamente (100 mcg/mL), por lo cual se obtiene un porcentaje final mayor (118,43 %) al
especificado por la farmacopea la cual especifica que no debe ser mayo al 110 %, entonces se
podra asegurar que el activo Acetaminofen no cumple. Por otro lado la cafena tiene una
concentracin en el rango, 11,57 mcg/mL y mediante el tratamiento matemtico se obtiene un
porcentaje igual a 91,84 % que se encuentra en el intervalo que sugiere la farmacopea que esta
debe ser no menos del 90 % y no ms del 110 %, entonces podramos asegurar que se
encuentra en el rango y cumple la norma que aconseja la farmacopea. Solo se desarrollo el
anlisis cuantitativo por medio de la integracin automtica, utilizando las reas, los mtodos
manuales de integracin no se utilizaron. Sus tiempos de salida dependen del nmero de
interacciones, debidas a la afinidad con las fases
La cromatografa que se hizo fue de fase reversa en la cual la polaridad de la fase mvil es
mucho mayor a la de fase estacionaria, esta ultima era una columna rellena con el material tipo
L1 macropartculas de octidecilsilano, slice poroso de baja polaridad con lo cual se puede
evidenciar una mejor separacin, ya que se facilitan los procesos de absorcin y desorcion
fundamentos de la cromatografa. Se desarrolla la deteccin a 275 nm como sugerencia de la
farmacopea aunque se tambin se desarrolla a 254 nm para evidenciar los cambios en los

parmetros cromatograficos los cuales cambian con las condiciones operativas. Se observa que
el nmero de platos tericos disminuyen con la disminucin de la longitud de onda igualmente
la resolucin.
Para el el anlisis de las tabletas de acetaminofn y cafena, por el mtodo externo, se debieron
trabajar muestras de patrn estndar para cada frmaco, para realizar las curvas de calibracin y
as posteriormente determinar el contenido de acetaminofn y cafena de una muestra
problema.
Al analizar las curvas de calibracin obtenidas se observa que no se obtuvo la linealizacin
esperada, esto se refleja en los resultados del R2 (0,865 para acetaminofn y 0,85 para cafena).
Con estos resultados obtenidos, se puede inducir que la prctica realizada pudo haber tenido
errores experimentales, por ejemplo el peso inadecuado de los compuestos, o diluciones mal
realizadas.
Segn los datos obtenidos mediante la curva de calibracin, para la muestra 4 las cantidades
calculadas de acetaminofn y cafena en la tableta no cumplen con las especificaciones de la
farmacopea, segn las cuales la cantidad de acetaminofn y cafena deben estar entre no menos
de 90% y no mas de 110%. Las cantidades encontradas segn el anlisis fueron de 33,08% de
acetaminofn y 3,65% de cafena. Estos resultados estn muy por debajo de lo esperado, pro
una parte se puede decir, que las tabletas no cumplen con la especificacin requerida, pero
tambin hay que tener en cuenta los posibles errores experimentales cometidos por las
personas que prepararon esta muestra.
Al realizar el clculo del nmero de platos tericos para los dos frmacos se observo que para
la cafena este fue mayor (8285 frente a 3957 del acetaminofn). Este resultado es de esperarse
debido a las caractersticas estructurales de los dos frmacos, acetaminofn es mas polar que
cafena, y debido a que esta cromatografa es en fase reversa, se espera que el compuesto
menos polar sea mas retenido que el mas polar, as lo demuestran los cromatogramas, ya que
acetaminofn eluye primero que cafena. Mientras mas tiempo este un analito en contacto con
la fase mvil y la fase estacionaria, mayores sern los equilibrios que se presentan de
intercambio entre la fose mvil y la fase estacionaria para un determinado analito y al ser la
cafena menos polar podr ser mas retenida por la fase estacionaria que tambin es de carcter
apolar.
Respecto a la resolucin de los cromatogramas se puede decir que fue adecuada ya que
permiti satisfactoriamente la elucin de los dos compuestos en un tiempo de retencin
ptimo.
Todas las muestras fueron analizadas mediante un equipo de cromatografa lquida de alta
resolucin que utiliza inyeccin automtica, el detectores de fotodiodos (permite el analsis UV
a diferentes longitudes de onda) y sistema de bombeo reciproco.. la fase estacionaria es slice
porosa C18.

CONCLUSIONES
Se cuantifico mediante patrn interno y externo las concentraciones de cafena y Acetaminofen
en un producto terminado, pero este clculos es supuesto y no es posible comparar los
resultados debido a inconvenientes en la preparacin de las muestras, solo se ejemplifica el
tratamiento correcto de la informacin derivada de un cromatograma.
Se desarrollo la cuantificacin por integracin automtica solamente, aunque claro se conocen
los otros mtodos como la triangulacin y mediante el rea media del pico, no se desarrollaron
los clculos por lo problemas experimentales de la practica.
En el mtodo que incluye patrn externo se disminuyen los errores asociados a la inyeccin,
por lo cual la precisin y exactitud de este mtodo es mayor.
La tableta analizada (mp4) no cumple con la cantidad requerida segn las especificaciones de la
farmacopea.Segn los parmetros farmacocinticos analizados, as como mediante la
observacin de los cromatogramas, se ve que el acetaminofen es el compuesto que eluye
primero debido a su ms alta polaridad, teniendo en cuenta que se trabajo en fase reversa, as el
nmero de paltos tericos y el tiempo de retencin para la cafena es mayor.

BIBLIOGRAFIA
1) REMINGTON. Farmacia, Edicin 20, Editorial mdica Panamericana, Tomo 1. p.p:
686, 691
2) Douglas A. Skoog, Stanley R. Crouch, F. James Holler, Principios de Analisis
Instrumental, Cengage Learning Editores, p. 823

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

FARMACIA
Practica de HPLC
Sol ngel Solano 124876
William Orozco Toro 124931
OBJETIVOS

Cuantificar los principios activos en una tableta de Dolex forte, cafena y Acetaminofen ,
mediante el uso de la cromatografa de HPLC.

Determinar los parmetros cromatograficos Platos tericos, resolucin - mediante el

anlisis de los cromatogramas y de esta manera inferir sobre la eficiencia y y sensibilidad
del equipo.

Caracteristicas de la cromatografia:
HPLC TIPO Reversa: La fase movil tiene una alta polaridad.
Fase Mvil
Agua:Metanol: Acido acetico -69:28:3Fase Estacionaria Octadecilsilano unido qumicamente a slice porosa
macropartculas cermica s, de 3 m a 10 m de dimetro, o una
varilla silcea porosa
Velocidad de
2 mL/min
Flujo
Volumen de
10 mcL
Inyeccin
Tiempos de
0.3 acetaminofen
retencin teorico 0.5 cafena
1.0 Acido benzoico
Longitud de
275 aconsejado por la farmacopea
Onda de
deteccin
CARACTERISTICAS DE LAS SUSTANCIAS
ACETAMINOFEN: Es un frmaco con propiedades analgsicas, sin propiedades
antiinflamatorias clnicamente significativas. Acta inhibiendo la sntesis de prostaglandinas,
mediadores celulares responsables de la aparicin del dolor. Adems, tiene
efectos antipirticos.
Se
presenta
habitualmente
en
forma
de cpsulas, comprimidos, supositorios o gotas de administracin ora
Nombre IUPAC: N-(4 hidroxifenil)etanamida

Peso molecular: 151,17 g/mol

Frmula qumica: C8H9NO2
Solubilidad 1: 1,4 g/100mL agua 20C. Soluble en etanol, Metanol, dimetilformamida.
Punto de fusin: 169 C
Caractersticas: polvo blanco cristalino inodoro
Figura N1 Estructura Acetaminofen

CAFENA: Es un alcaloide del grupo de las xantinas, slido cristalino, blanco y de sabor
amargo, que acta como una droga psicoactiva y estimulante. La cafena, es un estimulante
metablico y del sistema nervioso central, y es usada tanto recreacionalmente como
mdicamente para reducir la fatiga fsica y restaurar el estado de alerta mental en los casos que
exista una inusual debilidad o aletargamiento.
Nombre IUPAC: 1,3,7-trimetil- 1H-purina- 2,6(3H,7H)-diona 1,3,7-trimetilxantina
Peso molecular: 194,19 g/mol
Frmula qumica: C8H10N4O2
Solubilidad 1: 2,17 g/100mL agua 25C y 67 g/100 mL a 100 C
Punto de fusin: 226,85 C
Caractersticas: agujas blancas o polvo sin olor.