MATERIALES Y MTODOS

1.1.1. Material
o Cajas Petri
o Tubos de ensaye de 20 mL
o Matraces Erlenmeyer de 350ml y 100 mL
o Vaso de precipitados de 200ml
o Tubos eppendorf
o Charolas de peso seco
o Tubos falcon de 15ml
o Celdas para espectrofotometro
o Portaobjetos
o Jeringa de 20 ml

1.1.2. Equipos:
o Espectrofotometro
o Micropipetas (20-200L, 100-1000L)
o Bao de agua caliente
o Bao de agu a fra
o Microscopio ptico
o Autoclave (olla)
o Incubadora
o Balanza analtica
o Centrfuga
o Campana de flujo laminar
o Biorreactor New Brunswick Scientific modelo Bioflo II de 5L

1.1.3. Reactivos:
o Solucin salina istonica
o Reactivo de DNS
o Reactivo de Bradford
o Sacarosa
o Extracto de levadura
o KH2PO4
o (NH4)2SO4
o MgSO4
o Kit de Tincin de gram

1.1.4. Material Biolgico:

o Saccharomyces cerevisae

1.2.
Metodologa
El presente trabajo se dividio en tres etapas experimentales:
1) Preparacin de medio, material para la realizacin de la prtica y
esterilizacin del reactor.
2) Inoculacin al biorreactor,

realizacin

de

cintica

peso

seco,

determinacin de pH
3) Determinacin de pH, Peso Seco, Azcares Reductores, Actividad
enzimtica , Bradford y tincin de Gram
1.2.1.Preparacin de material, reactivos, medio y esterilizacin
Para este procedimiento se prepar 3.5 L de medio para el biorreactor, en el cual
se mezclarn los siguientes compuestos: Sacarosa, 30g; Extracto de levadura, 1g;
KH2PO4:,5g; (NH4)2SO4, 2g; MgSO4 7H2O, 0.4g. La mezcla se mantuvo con
agitacin constante para homogeneizar, despus en matraces de 350mL se
separ medio tanto para el biorreactor como el inculo, los cuales fueron
debidamente etiquetados para su esterilizacin. El biorreactor se arm con sus
diferentes componentes para colocarlo en su lugar correspondiente y as poder
ubicar los sitios para toma de muestra. Se volvi a sacar el biorreactor para
colocar el volumen de medio corrspondinte y se arm nuevamente. Se prepar
para la esterilizacin en el cual se cubrieron las membranas con algodn y papel
aluminio,

las

mangueras

tenan

las

llaves

correpondintes

para

evitar

contaminacin, en los diferentes sitios de toma se colocarn tapones de algodn

con recubrimiento de aluminio, los cuales tenian sus tapones correspondientes, se
coloc un tubo de ensaye en el sitio de toma de muestra para su esterilizacin.
Se pesaron las charolas corresppndientes para peso seco. Los tubos de ensaye
para las diferentes muestras se colocaron en un bote para su esterilizacin.
Cuando se tuv el material a utilizar se sometio a esterilizacin.
Posteiormente se volvio a colocar el biorreactor en su lugar y se puso a funcionar.
1.2.2.Inoculacin al biorreactor, realizacin de cintica y peso seco,
determinacin de pH
En la segunda sesin se tom una muestra sin inculo para conocer si el medio
estaba contaminado o no; con dos lmparas de alcohol, las cuales se colocaron

cerca de la toma de muestra para evitar contaminacin se abri la llave del puerto
de muestreo y se tom la muestra haciendo vaci con la jeringa, se regres el aire
de la jeringa se cerr la llave del puerto, se sac el tubo con suma precacuin
para evitar contaminacin, se flame con las lmparasy se coloc un segundo
tubo estril. Posteriormente se coloc el inculo; en un matraz erlenmeyer se
encontraba el inculo (200mL), se colocaron dos lmparas de alcohol cerca del
biorreactor para evitar contaminacin, con un embudo posteriormente esterilizado,
se coloc el inculo en un puerto del biorreactor. Despus se prendi la bomba
para hubiera aireacin. Se tom una muestra; con dos lmparas de alcohol, las
cuales se colocaron cerca de la toma de muestra para evitar contaminacin se
abri la llave del puerto de muestreo y se tom la muestra haciendo vaci con la
jeringa, se regres el aire de la jeringa se cerr la llave del puerto, se sac el tubo
con suma precacuin para evitar contaminacin, se flame con las lmparasy se
coloc un segundo tubo estril. Se etiquetaron los tubos, y en la campana laminar
para evitar contaminacin en los tubos eppendorf con una micropipeta de 1000L
se coloc 1 ml en cada tubo para realizar DNS, azcares reductores y
determinacin de protena, se tom 1 ml para determinar D.O (600nm) y cuenta.
Se fueron tomando muestras cada dos horas desde las 8:30am que tom la
primera hasta las 8:00pm, adems de se tom una muestra 77 horas despus.
Con cada muestra se determin el pH con tiras reactivas, adems de que se se
determin la absobancia de cada muestra. Todas las muestras se guardaron el
refrigerador para realizar las dems pruebas.
Para obtener el pH exacto de cada muestra se utiliz e potencimetro.
Posteriormente se separ 13 mL en tubos falcn y se centrifugaron las muestras,
se separ el sobrenadante en otro tubo falcn. La pastilla celular se suspendi en
1ml de solucin salina y se coloc en la charola anteiormente rotulada, esto se
realiz con cada muestra. Las charolas se llevarn a secar a 60C en la estufa, las
cuales se colocaron con pinzas para evitar tocarlas con las manos.

1.2.3 Determinacin de Azcares Reductores, Actividad enzimtica ,

Bradford y tincin de Gram

Para determinar la concentracin de protena se utiliz el mtodo de Bradford el

cual se realiz por triplicado, en celdas se colocaron 0.250 ml de cada muestra y
0.750 ml de bradford, se homogeniz y se determin la absorbancia con el
espectrofotmetro a una longitud de onda de 595nm.
La actividad enzimatica se determin preparando 3 tubos eppendorf con 900L de
solucion de sacarosa 3% de buffer de acetatos, por cada tubo de reaccion se
prepararon 2 tubos eppendorf con 0.1mL de reactivo de DNS, a los tubos con la
solucion de sacarosa al 3% se les aadio 100L de sobrenadante de cultivo y se
dejo reaccionar por 3 min, una vez transcurrido el tiempo de reaccion se tomo una
alicuota de 0.1mL y se traslado a un tubo con DNS. Con todas las muestras
tratadas se colocaron en un flotador y se calentaron en bao mara durante 5
minutos, transcurrido este tiempo de enfriaron y se colocarn en las celdas y se
leyeron en el espectrofotmetro a 540 nm para obtener la absorbancia.
Para determinar azcares reductores se determin preparando 2 tubos eppendorf
con 900L de solucion de sacarosa 3% de buffer de acetatos por cada tubo de
reaccion se prepararon 2 tubos eppendorf con 0.1mL de reactivo de DNS, a los
tubos con la solucion de sacarosa al 3% se les aadio 100L de sobrenadante de
cultivo y se dejo reaccionar por 3 min, una vez transcurrido el tiempo de reaccion
se tomo una alicuota de 0.1mL y se traslado a un tubo con DNS. Con todas las
muestras tratadas se colocaron en un flotador y se calentaron en bao mara
durante 5 minutos, transcurrido este tiempo de enfriaron y se colocarn en las
celdas y se leyeron en el espectrofotmetro a 540 nm para obtener la absorbancia.
Para realizar tincin de Gram se utilizaron solo tres muestras, al inicio, medio y al
final. Con mecheros se obtuvo un rea libre de contaminacin, se esteriliz el asa
bacteriolgica y coloc un poco de muestra en un portaobjetos, se deja secar o se
fija con calor, despus en nuestro puente de tincin se coloc el portaobjetos y se
coloc azul violeta o cristal violeta y se espero 1 minuto, se enjuag con agua no
directamente sobre la muestra, se agreg lugol y se espero 1 minuto
aproximadamente, se agreg alcohol acetona y se esper entre 5 y 30 segundos,
se enjuag con agua se agreg safranina y se espero 1 minuto, se enjuag con
agua, se dej secar y despus se observ en el microscopio.