TEMA 5

IDENTIFICACIN DE
SECUENCIAS ESPECFICAS

Mnica Bullejos

TEMA 5 IDENTIFICACIN DE SECUENCIAS ESPECFICAS

OBJETIVOS
-

Saber detectar molculas de AANN con una secuencia

concreta a p
partir de un g
grupo
p heterogneo
g
de molculas,
independientemente de cual sea el material de partida.
Conocer distintos mtodos de transferencia de AANN a un
soporte slido en funcin del material de partida.
Ser capaces de generar sondas marcadas (ADNcs, ADNcd,
ARN) tanto en fro como en caliente.
ARN),
caliente
Saber cmo se pone de manifiesto la presencia de una sonda
marcada (fra o caliente) que ha hibridado con su secuencia
complementaria.

Mnica Bullejos Gentica Aplicada TEMA 5 / 2

TEMA 5 IDENTIFICACIN DE SECUENCIAS ESPECFICAS

OBJETIVO 1
SABER DETECTAR MOLCULAS DE AANN CON UNA
SECUENCIA CONCRETA A PARTIR DE UN GRUPO
HETEROGNEO DE MOLCULAS,
INDEPENDIENTEMENTE DE CUAL SEA EL MATERIAL DE
PARTIDA

Mnica Bullejos Gentica Aplicada TEMA 5 / 3

1. INTRODUCCIN

PROBLEMA

Deteccin de una secuencia CONCRETA entre

un

grupo

de

molculas

de

AANN

con

secuencias diversas

Mnica Bullejos Gentica Aplicada TEMA 5 / 4

1. INTRODUCCIN

MATERIAL DE PARTIDA

A. ADN o ARN en solucin

B. Colonias (en bacterias) o
calvas (en fagos)
C Cromosomas metafsicos
C.
D. Geles de agarosa
E. ARN tejidos enteros
F. ARN en cortes

Mnica Bullejos Gentica Aplicada TEMA 5 / 5

1. INTRODUCCIN

PASOS A SEGUIR

1. Transferencia de AANN (cs) a soporte slido

(cuando sea necesario)
2. Obtencin de sondas marcadas
3. Hibridacin
4 Revelado
4.

Mnica Bullejos Gentica Aplicada TEMA 5 / 6

2. TRANSFERENCIA A SOPORTE SLIDO

AANN en forma de cadena simple

No es necesario ningn tratamiento

AANN en forma de cadena doble

Desnaturalizar antes de la transferencia

Desnaturalizar despus de la transferencia

Mnica Bullejos Gentica Aplicada TEMA 5 / 7

TEMA 5 IDENTIFICACIN DE SECUENCIAS ESPECFICAS

OBJETIVO 2
CONOCER DISTINTOS MTODOS DE TRANSFERENCIA
DE AANN A UN SOPORTE SLIDO EN FUNCIN DEL
MATERIAL DE PARTIDA

Mnica Bullejos Gentica Aplicada TEMA 5 / 8

2. TRANSFERENCIA A SOPORTE SLIDO

A. ADN o ARN en solucin

Dot-blot
Slot-blot

Desnaturalizacin antes de la transferencia

Mnica Bullejos Gentica Aplicada TEMA 5 / 9

2. TRANSFERENCIA A SOPORTE SLIDO

B. ADN en bacterias (colonias) o fagos (calvas)

Desnaturalizacin despus de la transferencia

Mnica Bullejos Gentica Aplicada TEMA 5 / 10

2. TRANSFERENCIA A SOPORTE SLIDO

C. ADN en cromosomas metafsicos

Desnaturalizacin despus de la transferencia

Mnica Bullejos Gentica Aplicada TEMA 5 / 11

2. TRANSFERENCIA A SOPORTE SLIDO

D. ADN o ARN en geles de agarosa

Desnaturalizacin antes de la transferencia

TIPOS DE TRANSFERENCIA SEGN TIPO DE AANN

ADN: Southern blot

ARN: Northern blot
Protenas: Western blot

Mnica Bullejos Gentica Aplicada TEMA 5 / 12

2. TRANSFERENCIA A SOPORTE SLIDO

D. ADN o ARN en geles de agarosa

*
Gel agarosa

Membrana de nylon

TIPOS DE TRANSFERENCIA SEGN MECANISMO

Capilaridad
Vaco
Electrotransferencia
El t t
f
i
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2. TRANSFERENCIA A SOPORTE SLIDO

Transferencia por capilaridad

1 Kg

Soporte de vidrio

Papel absorbente

Solucin
de
transferencia
Soporte

Papel de filtro
Membrana nylon
Gel agarosa con ADN
Papel de filtro
Contenedor

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2. TRANSFERENCIA A SOPORTE SLIDO

Mnica Bullejos Gentica Aplicada TEMA 5 / 15

2. TRANSFERENCIA A SOPORTE SLIDO

Transferencia por vaco

Sol. de transferencia
Gel agarosa + ADN
Mscara impermeable
Membrana nylon
Material poroso
Cmara de vaco

Vaco

Mnica Bullejos Gentica Aplicada TEMA 5 / 16

2. TRANSFERENCIA A SOPORTE SLIDO

Electro-transferencia

Voltaje

+
Sol. de transferencia
Membrana nylon
Gel agarosa + ADN

Papel de filtro
Material poroso
Cassette
Cubeta electroforesis
vertical

Mnica Bullejos Gentica Aplicada TEMA 5 / 17

2. TRANSFERENCIA A SOPORTE SLIDO

RESUMEN

DOT-BLOT
O
O

TRANSFERENCIA DE COLONIAS

EXTENSIN DE METAFASES SOBRE PORTA

TRANSFERENCIA A MEMBRANA
SOUTHERN
NORTHERN
WESTERN
CORTES (TEJIDO)
TEJIDOS COMPLETOS
Mnica Bullejos Gentica Aplicada TEMA 5 / 18

3. OBTENCIN DE LA SONDA

Qu es una sonda?

Molcula de ADN o ARN, de cadena doble o

simple,
i l

marcada,
d

con

secuencia
i

complementaria
p
a la secuencia q
que q
queremos
detectar

Mnica Bullejos Gentica Aplicada TEMA 5 / 19

TEMA 5 IDENTIFICACIN DE SECUENCIAS ESPECFICAS

OBJETIVO 3
SER CAPACES DE GENERAR SONDAS MARCADAS
(ADNcs ADNcd,
(ADNcs,
ADNcd ARN)
ARN), TANTO EN FRO COMO EN
CALIENTE

Mnica Bullejos Gentica Aplicada TEMA 5 / 20

3. OBTENCIN DE LA SONDA

Tipos de marcaje

- CALIENTE: Radioactividad
([32P]-dNTP)
- FRO: Antgeno
(digoxigenina, biotina, fluoresceina)

Mnica Bullejos Gentica Aplicada TEMA 5 / 21

3. OBTENCIN DE LA SONDA

Mtodos de marcaje

A.

Traslado de la muesca (Nick-translation)

B.

Primado al azar (Random priming)

C.

Adicin

de

colas

marcadas

en

3
3

(Oligonucleotide tailing)
D
D.

M
Marcaje
j en 3 (3-End-filling)
(3 E d filli )

E.

Marcaje en 5 (5-End-labeling)

F.

Marcaje por PCR

G. Marcaje
G
a caje po
por transcripcin
a sc pc in vitro
to
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3. OBTENCIN DE LA SONDA
MARCAJE DE LA SONDA - MTODOS

Traslado de la muesca ((Nick-translation)

Nick-translation )

Primado al azar (Random priming)

Adicin de colas marcadas en 3 (Oligonucleotide tailing)

Marcaje en 3 (3-End-filling)

Marcaje en 5 (5-End-labeling)

Marcaje por PCR

Marcaje por transcripcin in vitro - Ribosondas

MARCAJE DE LA SONDA - MOLCULA

[32P]-dNTP (Radioactividad) - Autoradiografa
digoxigenina, biotina, fluoresceina (Antgeno) - Revelado inmunolgico

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3. OBTENCIN DE LA SONDA

A. Traslado de la muesca (Nick-translation)

Mnica Bullejos Gentica Aplicada TEMA 5 / 24

3. OBTENCIN DE LA SONDA

B. Primado al azar (Random priming)

Mnica Bullejos Gentica Aplicada TEMA 5 / 25

3. OBTENCIN DE LA SONDA
C. Adicin de colas marcadas en 3
(Oligonucleotide tailing)

Mnica Bullejos Gentica Aplicada TEMA 5 / 26

3. OBTENCIN DE LA SONDA

D. Marcaje en 3 (3-End-filling)

Mnica Bullejos Gentica Aplicada TEMA 5 / 27

3. OBTENCIN DE LA SONDA

E. Marcaje en 5 (5-End-labeling)

Mnica Bullejos Gentica Aplicada TEMA 5 / 28

3. OBTENCIN DE LA SONDA
F. Marcaje por PCR

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3. OBTENCIN DE LA SONDA

G. Marcaje por transcripcin in vitro (ARN)

Mnica Bullejos Gentica Aplicada TEMA 5 / 30

3. OBTENCIN DE LA SONDA

G. Marcaje por transcripcin in vitro (ARN)

ARN*
PROMOTOR

SECUENCIA A MARCAR

+ ARN polimerasa (SP6, T3 T7)

+ NTPs marcados

Mnica Bullejos Gentica Aplicada TEMA 5 / 31

3. OBTENCIN DE LA SONDA

H. Marcaje usando poli-A polimerasa (ARN)

5
5

3
3
ARN

AAAAAAAAAAAA
**********************

+ POLI-A POLIMERASA
+ ATP*

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4. HIBRIDACIN

Sonda ((cs)) + AANN ((cs)) fijado

j
a un soporte
p
slido

Factores que afectan a la hibridacin

- Temperatura
- Fuerza inica del medio
- Concentracin de sonda
- Bloqueo

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4. HIBRIDACIN

Pasos del proceso

- Pre-hibridacin: bloqueo de sitios de unin inespecficos

- Hibridacin: unin entre secuencias complementarias
- Lavados: eliminacin de sonda no unida a secuencias
especficas
p

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TEMA 5 IDENTIFICACIN DE SECUENCIAS ESPECFICAS

OBJETIVO 4
SABER CMO SE PONE DE MANIFIESTO LA PRESENCIA
DE UNA SONDA MARCADA (FRA O CALIENTE) QUE HA
HIBRIDADO CON SU SECUENCIA COMPLEMENTARIA
INMOVILIZADA SOBRE UN SOPORTE SLIDO

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5. REVELADO

Para sondas calientes

Deteccin de la sonda:
- Directa: contador radioactividad
- Indirecta: mediante AUTORRADIOGRAFA

Para sondas fras

Deteccin de la sonda:
- Indirecta:

Mediante revelado inmunolgico

Mediante impresin de pelcula sensible
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5. REVELADO

Revelado inmunolgico

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5. REVELADO

Revelado inmunolgico

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5. REVELADO

Revelado inmunolgico: Sonda marcada con digoxigenina

Mnica Bullejos Gentica Aplicada TEMA 5 / 39

5. REVELADO

Revelado inmunolgico: Sonda marcada con digoxigenina

C S

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5. REVELADO

Revelado inmunolgico: Sonda marcada con biotina

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5. REVELADO

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5. REVELADO

Resultado del revelado inmunolgico:

AANN inicialmente en solucin (Dot Blot)

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5. REVELADO

Resultado del revelado inmunolgico:

ADN dentro de bacterias o fagos (colony/plaque lift)

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5. REVELADO

R
Resultado
lt d del
d l revelado
l d inmunolgico:
i
l i
ADN sobre cromosomas (FISH)

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5. REVELADO

Resultado del revelado inmunolgico:

AANN inicialmente en gel (ADN - Southern Blot)

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5. REVELADO

Resultado del revelado inmunolgico:

ARN en tejidos enteros (wholemount)

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5. REVELADO

Resultado del
revelado
inmunolgico:
g
ARN en cortes

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6. RESUMEN SOUTHERN-BLOT

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TEMA 5 IDENTIFICACIN DE SECUENCIAS ESPECFICAS

OBJETIVOS
-

Saber cmo se detectan molculas de AANN con una

secuencia concreta a p
partir de un g
grupo
p heterogneo
g
de
molculas, independientemente de cual sea el material de
partida.
Conocer distintos mtodos de transferencia de AANN a un
soporte slido en funcin del material de partida.
Ser capaces de generar sondas marcadas (ADNcs,
(ADNcs ADNcd,
ADNcd
ARN), tanto en fro como en caliente.
Saber cmo se pone de manifiesto la presencia de una sonda
marcada (fra o caliente) que ha hibridado con su secuencia
complementaria inmovilizada sobre un soporte slido.

Mnica Bullejos Gentica Aplicada TEMA 5 / 50

TEMA 5 IDENTIFICACIN DE SECUENCIAS ESPECFICAS

BIBLIOGRAFA

INGENIERA GENTICA (2002, 1 ED.)

Vol I: Preparacin, anlisis, manipulacin y clonaje de DNA. (ISBN: 84-7738-964-0)
AUTORES: J. Perera, A. Tormo y JL. Garca
EDITORIAL: SNTESIS
Lengua: Espaol
ISBN: 84-7738-966-7

PRINCIPLES OF GENE MANIPULATION AND GENOMICS. (2006, 7 ED.)

AUTORES: S.B. Primrose and R.M. Twyman.
EDITORIAL: Blackwell Science
Lengua: INGLS
ISBN: 1-4051-3544-1
http://www.blackwell-science.com/primrose

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TEMA 5 IDENTIFICACIN DE SECUENCIAS ESPECFICAS

OTROS LIBROS DE TEXTO

RECOMBINANT DNA: GENES AND GENOMES A SHORT
COURSE (2006, 3 ED.)
AUTORES: J.D. Watson, A.A. Caudy,
y R.M. Myers,
y
J.A. Witkowski
EDITORIAL: Cold Spring Harbour Press and Freeman
Lengua: INGLS
ISBN: 0
0-7167-2866-4
7167 2866 4

GENE CLONING AND DNA

ANALYSIS, AN INTRODUCTION
(2006, 5 ED.)
AUTORES: T.A
T A Brown
EDITORIAL: Blackwell Science
Lengua: INGLS
ISBN: 978-1-4051-1121-8

ANALYSIS OF GENES AND

GENOMES (2004, 1 ED.)
AUTORES: Richard J Reece
EDITORIAL: Wiley
Lengua: INGLS
ISBN: 0-470-84380-2

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TEMA 5 IDENTIFICACIN DE SECUENCIAS ESPECFICAS

OTROS LIBROS DE TEXTO

UNDERSTANDING DNA AND GENE CLONING. A GUIDE
FOR THE CURIOUS (2004)
AUTORES: Karl Drlica
EDITORIAL: Wiley
Lengua: INGLS
ISBN: 0471-43416-7
0471 43416 7

FROM GENES TO GENOMES. CONCEPTS AND APPLICATIONS

OF DNA TECHNOLOGY (2007)
AUTORES: J.W. Dale y M. von Schantz
EDITORIAL: Wiley
Lengua: INGLS
ISBN: 978-0-470-01733-3

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