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CTB Biorreactores
CTB Biorreactores
BIOTECNOLOGIA
(FCEyN UBA )
Biotecnologa Industrial
Produccin industrial de Metabolitos
Biorreactores
Miryan Cassanello
PINMATE Dep. Industrias, FCEyN-UBA
E-mail: miryan@di.fcen.uba.ar
Alcoholes
cidos
orgnicos
Etanol
Saccharomyces cerevisiae
Butanol/acetone
Clostridium acetobutylicum
Acido ctrico
Aspergillus niger
230.000
Acido glucnico
Aspergillus niger
50.000
Acido lctico
Lactobacillus delbrueckii
20.000
Corynebacterium glutamicum
300.000
L-lisina
Brevibacterium flavum
30.000
L-fenilalanina
Corynebacterium glutamicum
2.000
L-arginina
Brevibacterium flavum
2.000
Penicilinas
Penicillium chrysogenum
40.000
Cefalosporinas
Cephalosporium acremonium
10.000
Tetraciclinas
Streptomyces aureofaciens
10.000
Antibiticos
Mercado
mundial
(ton/ao)
20 millones
2.000
Producto
Enzimas
Mercado mundial
(ton/ao)
Proteasas
Bacillus spp.
600
-Amilasa
Bacillus amyloliquefaciens
400
Glucoamilasa
Aspergillus niger
400
100
Pectinasa
Aspergillus niger
10
Xantanos
Xanthomonas campestris
Dextrano
Leuconostoc mesenteroides
200
Vitaminas
B12
Propionibacterium shermanii
10
Vacunas
Difteria
Corynebacterium diphterie
Ttanos
Clostridium tetani
Insulina
< 20 kg/ao
Interfern-2
10
Hormona de
crecimiento
Polmeros
Protenas
teraputicas
5.000
< 50 kg/ao
Pequea
Pequea
Ingeniera Qumica
Qumica
Biologa
Bioqumica
Biotecnologa AZUL:
Aplicacin en
organismos marinos
Biotecnologa ROJA:
Aplicacin en medicina
Biotecnologa
AZUL
Biotecnologa
ROJA
BIOTECNOLOGIA
Biotecnologa
VERDE
Biotecnologa VERDE:
Aplicacin en agroalimentos
Biotecnologa
BLANCA
Biotecnologa BLANCA (o industrial):
Aplicacin en la industria en general,
productos qumicos, nuevos materiales,
biocombustibles, etc.
BIOTECNOLOGIA
INDUSTRIAL
Objetivo de la
produccin
industrial de
clulas o de
microorganismos
Metabolitos
Primarios
Metabolitos
Secundarios
Metabolitos primarios
-Molculas generalmente sencillas, que participan de los caminos
metablicos esenciales. Son casi idnticos en todos los organismos.
-Son ms baratos y sencillos de producir, tienen bajo contenido de
actividad biolgica y frecuentemente son commodities
1. Componentes esenciales de las clulas/microorganismos:
protenas, cidos nuclicos, polisacridos (gelanos, xantanos) y
polisteres, cidos grasos (insaturados), esteroles.
2. Derivados del metabolismo intermedio: azcares (fructosa,
ribosa, sorbosa), cidos orgnicos (gluconato, cido lctico,
ctrico, actico, propinico, succnico, fumrico), alcoholes
(xilitol, etanol, glicerol, sorbitol, butanol), aminocidos (Lys,
Thr, Glu, Trp, Phe), vitaminas (B2, B12), nucletidos
saborizantes (cidos inocnico y guanlico), polisacridos y
polisteres de reserva.
Microorganismos productores: bacterias, levaduras y hongos
Metabolitos secundarios
-Molculas mas complejas, que participan de caminos metablicos
no-esenciales, pero confieren capacidades de supervivencia en
situaciones de stress.
-Son muy variados y su estructura es fuertemente dependiente de la
especie y variedad utilizada para su produccin. Se generan en
condiciones particulares y son ms valiosos y complicados de
producir alto contenido de actividad biolgica
-Generalmente son productos especiales (alto precio). Funcionan
en los organismos que los producen como:
1. Armas contra otros microorganismos (antibiticos, toxinas,
inhibidores enzimticos, pesticidas)
2. Factores de crecimiento (hormonas)
3. Ionforos
4. Agentes de interaccin microbiana
5. Efectores externos
PROCESOS BIOTECNOLOGICOS o
FERMENTACIONES
Procesos que se llevan a cabo en un bio-reactor mediante los cuales
se transforman los sustratos de un medio de cultivo (materias primas)
en metabolitos y/o en biomasa (productos) empleando para este fin
microorganismos, clulas o enzimas.
Biorreactor
o
Fermentador
Operaciones
unitarias
Operaciones
unitarias
Esterilizacin
Preparacin de
medios
Separacin
Purificacin
Tratamiento
de efluentes
Esterilizacin
Preparacin de
medios
Separacin
Purificacin
Tratamiento
de efluentes
Seleccin (screening)
En la seleccin del microorganismo/clula, se debe tener en cuenta:
1. La cepa a utilizar debe ser genticamente estable.
2. La velocidad de crecimiento debe ser alta.
3. La cepa debe estar libre de contaminantes.
4. Sus requerimientos nutricionales deben cubrirse con medios de
cultivo de costo reducido.
5. Deben ser de fcil conservacin por largos perodos de tiempo sin
prdida de sus caractersticas.
6. Debe realizar el proceso fermentativo completo en tiempo corto.
7. Si el objetivo es un producto, este debe ser de alto rendimiento y
de fcil recuperacin a partir del medio de cultivo.
mayor cantidad
productos
+
de biomasa
extracelulares
S + X
Crecimiento
nX
El crecimiento microbiano es un ejemplo de reaccin autocataltica. La velocidad de crecimiento est relacionada con la
concentracin de clulas.
Velocidad especfica neta de
crecimiento (h-1):
X: concentracin msica de clulas (g/L)
t: tiempo (h)
1 dX
neta
X dt
neta = g k d
Tambin se puede expresar la velocidad en funcin de la
concentracin de nmero de clulas en lugar de la concentracin
msica de las mismas. Si no se pueden medir las dos, se prefiere
la concentracin msica.
Formas de medir la concentracin de clulas
Se busca un mtodo rpido, fcil de seguir en lnea o de respuesta
rpida.
Directos
Mtodos
Indirectos
Sensible
> 10-12 gATP/L
1 dX
dX
neta t
g neta =
= neta dt X = X 0e
X dt
X
Tiempo necesario para duplicar la biomasa:
X = 2X 0
ln(2)
d =
neta
g neta = g k d
Puede ocurrir:
La concentracin msica de clulas (X) es constante pero baja el
nmero de clulas viables.
X baja por lisis de clulas. Puede aparecer un segundo perodo
de crecimiento, los productos de lisis o las clulas muertas
constituyen un sustrato alternativo (crecimiento crptico).
X constante pero su metabolismo es activo; cambia la regulacin
celular produciendo metabolitos secundarios.
1 dS
m=
X dt m
de productos
para crecimiento
para mantenimiento
X
P
Y
; YP/S =
=
X / O2
DO
S
YX /S = 1 0,4 g/g
g biomasa
g de C consumido
q P = g = YP / X
g = 0
Asociada
q P = g
Parcialmente asociada
q P = g +
Metabolitos primarios
No asociada
qP =
Metabolitos secundarios
La velocidad de
crecimiento
aproximadamente
se duplica cada
T = 10C
'g = A exp( E a / RT )
Ea 1020 kcal/mol
k d = A d exp( E d / RT )
Ed 6080 kcal/mol
Rango de
pH ptimo
El O2 se
introduce por
burbujeo y su
concentracin
depende de la
agitacin.
Velocidad de
OTR = k L a LG C*O C O b
transferencia:
2
2
Velocidad de consumo OUR = q X = g X
O2
YX / O
de oxgeno (OUR):
2
( ( ) ( ))
CO 2 + H 2 O
Crecimiento
microbiano y
respiracin
1/YH (kJ/g clula)
celulas
Combustin de
las clulas
Hc (kJ/g)
Ciclo entlpico
para calcular el
calor generado
combustion del
sustrato, H S ( kJ / g )
Sustrato + O 2 CO 2 + H 2 O
HS
YX /S
1
= H c +
YH
YH =
YX /S
HS YX /SH c
Reactor batch de
escala laboratorio
Reactor batch de
escala industrial
CH m O n + a O 2 + b NH 3 c CH O N + d H 2O + e CO 2
CHmOn representa un mol del carbohidrato empleado como sustrato
CHON representa un mol del material celular
La composicin del material celular depende del tipo de
organismo. Un mol de material biolgico es aquel que
contiene un tomogramo de C
% en masa seca
50
20
14
Na
Ca
0.5
Mg
0.5
Cl
0.5
Fe
0.2
Otros
0.3
Componentes minoritarios
no se tienen en cuenta en la
frmula mnima
CH m O n + a O 2 + b NH 3 c CH O N + d H 2O + e CO 2
Balances
elementales:
C:
H:
O:
N:
1= c + e
m + 3b = c + 2d
n + 2a = c + d + 2e
3b = c
i,sustratos i i = i,productos i i
i :coef .estequiometri cos ; i :grados de reduccion
S + X
nX
1 dX
neta g k d
X dt
neta: Velocidad especfica neta de crecimiento (h-1)
g: Velocidad especfica de crecimiento de biomasa (h-1)
MAYOR COMPLEJIDAD
No estructurados
Estructurados
Segregados
Segregados
No estructurados
Estructurados
No segregados
No segregados
Son ms
realistas, pero
son complejos y
demandantes de
tiempo de
clculo.
g(h-1)
g =
m S
Ks + S
S (M)
g(h-1)
g =
de crecimiento de biomasa
g = m cuando S >> K s
m S
Ks + S
g = 12 m
cuando S = K s
S (M)
Monod da buenos resultados para cultivos con baja velocidad de
crecimiento y baja densidad de clulas.
Para cultivos concentrados se usan expresiones similares,
modificando Ks:
g =
m S
K S S0 + S
0
g =
m S
K s + K s S0 + S
1
tc = tm +
ln
neta X 0
rb =
YX / SS0
X0 + t m
kg
m 3s
Por qu?
En muchos casos no interesa el producto asociado a crecimiento;
el crecimiento de las clulas puede incluso inhibir la produccin
del producto deseado. En esos casos el producto deseado se genera
solo con velocidades de dilucin muy bajas, muy por debajo de la
que lleva a la ptima productividad de biomasa.
Para produccin de metabolitos secundarios, la productividad
en un batch puede superar significativamente a la de un
quimiostato.
Por qu?
Otro factor a tener en cuenta es la operabilidad y la confiabilidad
de la operacin. Los reactores batch conducen a productos con
mucha variabilidad genera problemas en las etapas de
purificacin. Sin embargo en los sistemas continuos una falla
mecnica o de control de alguna variable de operacin o de la
esterilizacin del proceso puede conducir a problemas severos.
Las consecuencias de una falla de operacin son mas graves
en un sistema continuo y las prdidas mayores.
L(+G,S)
L(+G,S)
Fv
S0, X0, P0
Burbujeo
de gas
Fv
S, X, P
Las concentraciones a la
salida del reactor son
iguales a las del interior
por la hiptesis de
mezclado perfecto
Volumen de lquido =
volumen de reactor = V
= al V.C. con +
del V.C. con +
los productos dentro del V.C. los reactivos dentro del V.C.
= al V.C. con +
del V.C. con +
los productos dentro del V.C. los reactivos dentro del V.C.
Fv
S0, X0, P0
Fv
S, X, P
FV X = FV X 0 + V neta X
FV X = FV X 0 + V g k d X
Gas
DX = DX 0 + g k d X
DX = DX 0 + g k d X
D = g
D = g =
m S
Ks + S
los productos dentro del V.C. los reactivos dentro del V.C.
FVS
1
1
+ Vg X M + Vq P X
YP /S
YX /S
Formacin de biomasa
FVS0
Formacin de producto
D S0 S
= X
YXM/S
+ X
qP
YP /S
X = YXM/S S0 S
D = g =
mS
Ks +S
S=
DK s
m D
D
Ks
M
DX = YX /S DS0
D
m
D op ( X )
Ks
= m 1
+
K
S
s
0
DX )op
D op K s
= YXM/SD op S0
D
m
op
DX )op
Ks
M
= YX /S m 1
+
K
S
s
0
S + K K K +S
s
s
s
0
0
))
0.5
1
3
0.4
0.12
0.24
0.31
0.43
0.53
0.6
0.66
0.69
0.71
0.73
S0
0.8
X (kg/m )
0.3
0.6
0.2
0.4
0.013
0.033
0.04
0.064
0.102
0.122
0.153
0.17
0.221
0.21
X (kg/m3)
0.427
0.434
0.417
0.438
0.422
0.427
0.434
0.422
0.43
0.39
0.352
DX
3
0.1
0.2
S (kg/m )
0
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
-1
D (h )
(kg/h.m
0.3)
0.2
0.1
0
0
0.2
0.4
-1
0.6 D (h0.8
)
Fv
S0,X0,P0
Fv
S1,cX1,P1
Gas
: relacin de reciclo
basada en caudales
volumtricos.
Fv(1+)
c: factor de concentracin
S1,X1,P1
relacin de la
concentracin de
clulas en la corriente
Fv
de reciclo sobre la que
S1,X2,P1
sale del reactor
Balances de biomasa :
Masa que Masa que Masa Masa Masa
sale del VC entra al VC consumida generada acumulada
con los con los + dentro del dentro del = dentro del
productos reactivos V.C. V.C. V.C.
(1+ ) FV X1
(FV X 0 + FVcX1 )
fresca
V neta X1 = 0
reciclo
En EE: dX1/dt = 0
y si se alimenta medio
estril X0=0
Fv
S1,cX1,P1
neta = D(1+ c )
Gas
Fv
S0,X0,P0
Fv(1+)
S1,X1,P1
Fv
S1,X2,P1
Fv
S0,X0,P0
Fv
S1,cX1,P1
Fv(1+)
S1,X1,P1
Fv
S1,X2,P1
Gas
neta < D
Cuando hay reciclo, el
quimiostato puede operar con
una velocidad de dilucin
mayor que la de crecimiento
= al V.C. con +
del V.C. con +
los productos dentro del V.C. los reactivos dentro del V.C.
1
1
(1+ )FVS1 + Vg X1 M + Vq P X1
= FVS0 + FVS1
YP /S
YX /S
Formacin de biomasa
Formacin de producto
BM sustrato limitante
(en EE y en ausencia de productos extracelulares):
1
1
(1+ )FVS1 + Vg X1 M + Vq P X1
= FVS0 + FVS1
YP /S
YX /S
1
V g X1 M = FV S0 + S1 (1+ )FVS1
YX /S
X1 =
YXM/S S0 S1
)
X1 =
YXM/S S0 S1
1+ (1- c )
Si es vlida Monod
y para kd=0
S=
m [1+ (1-c)]D
X1,cr
X1,sr
g =
mS
Ks +S
S
X1 =
0
[1+ (1-c)]
m [1+ (1- c)]D
YXM/S
Velocidad de
generacin de
biomasa
Fv
S0,X0,P0
Fv
S1,cX1,P1
Fv(1+)
S1,X1,P1
c = 2 ; = 0.5
V
con reciclo
sin reciclo
Gas
Fv
S1,X2,P1
Fv,S0,X0
Primer quimiostato
S1 =
Fv,X2,S2
Fv,X1,S1
K s D1
m D1
X1 = YXM/S S0 S1
X1
S1
X2
S2
V1
V2
BM de biomasa FV X1 FV X 2 + V2 neta , 2 X 2 = V2
dX 2
dt
= 0 en EE
X1
X 2 X1 = neta , 2 X 2 neta , 2 = D 2 1
X
V2
2
FV
Como X1 < X2
neta,2 < D2
V0
X0,S0,P0
1)Carga
Vf
Xf,Sf,Pf
3)Recuperacin
del producto
X,S,P
2)Realimentacin
X /S
(0 )
dX
dX FV
X dV
= X 0 + neta X
= DX 0 + X neta D
X neta D
dt V
V dt
dt
d(XV )
Variacin de las
concentraciones de
biomasa, sustrato y
producto, y de la
velocidad de
crecimiento y volumen
del cultivo en funcin
del tiempo, para el
primer ciclo de un
reactor alimentado
(fed-batch):
(h-1)
V (mL)
1000
X (g/L)
P (g/L)
0.6
V (mL)
800
600
0.4
(h )
-1
400
0.2
200
P (g/L)
X (g/L)
0
0
0.5
1.5
t 2(h)
H/D~36
Esquema de una
columna de burbujeo
H/D~12
Fermentadores de
escala piloto
V ~ 100-1000 litros
Biorreactor de
escala piloto
Esquema de un tanque
agitado de mayor escala
Esquema de un fermentador
tipo tanque agitado de escala
industrial (100m3).
H ~ 15 m de alto
D ~ 4,2 m de dimetro
Tiene lneas de vapor
para realizar la
esterilizacin in situ de
las vlvulas, caeras y
sellos. Se debe esterilizar
tambin el aire que
ingresa por filtracin o
por calentamiento.
Biorreactor de
escala industrial
Interior de un
tanque agitado
vrtice
300 rpm
450 rpm
750 rpm
Reactor agitado en
suspensin de escala
banco: 20cm de
dimetro y de alto
(volumen ~ 8L)
Columnas de burbujeo
Regmenes de flujo en columnas de
burbujeo: depende del caudal de gas y del
distribuidor que se emplee
Air-lift con
insercin de
aire en el
tubo central
Reactor air-lift de
laboratorio con entrada de
aire en el anillo circular
Zona donde se produce la
separacin entre el gas que se
libera hacia el exterior del
reactor y el lquido que recircula
Riser: zona donde se hace la
inyeccin de aire, el flujo es
ascendente y contiene burbujas
Downcomer: zona donde el lquido
desciende, a lo sumo tiene pequeas
burbujas disueltas
Escala
banco
(0,2 x 2)m
Shear Stress
Kinetic Energy
Airlifts de forma
triangular para el
cultivo de algas
(planta piloto de
cogeneracin de
energa del MIT)
Columnas de burbujeo
rellenas
Estrategias de escalado:
-Multiplicacin
-Reglas de uso
-Anlisis del rgimen
y escalado hacia menor
tamao
La multiplicacin implica
replicar muchas veces el
resultado que se obtiene
en un reactor de escala
relativamente pequea, en
lugar de llevar a cabo el
proceso en un reactor de
mayor tamao.
Produccin de antibitico
Drogas medicinales
% de uso en la industria
Criterio de escalado
30
Potencia/Volumen
30
kLaLG
20
20
Concentracin de oxgeno
La concentracin de
oxgeno es diferente en
distintas zonas del
reactor. Se puede simular
considerando varios
reactores con distinta
alimentacin de oxgeno