Biologa molecular del cncer colorrectal.

La biologa molecular del cncer colorrectal (CCR) abarca una amplsima

variedad de aspectos que van desde la conocida teora de las etapas mltiples
del desarrollo del tumor y los sndromes hereditarios hasta la aplicacin al tra
tamiento de determinantes moleculares de sensibilidad y resistencia a
citostticos. En el cncer hereditario cabe destacar las dos vas de la herencia,
la va supresora mediada por el gen supresor APC de la poliposis mltiple
familiar y la va mutadora mediada por la mutacin en genes reparadores y
conocida como sndrome de Lynch. No cabe duda del inters de los aspectos de
la carcinognesis y la herencia, pero donde mayor importancia alcanza la
biologa molecular del CCR en el momento actual es en su aportacin al
pronstico y tratamiento de los pacientes. Genes tan importantes como el
oncogn k-ras nos proporcionarn informacin pronstica sobre la agresividad
y capacidad de recada y metstasis, informacin que podemos completar con
el anlisis de la inestabilidad allica (chromosomyc imbalance) en
determinados cromosomas como 8p y 18q, y tambin con la determinacin de
los ttulos de expresin de timidilato sintetasa. A nuestro entender, todava es
ms importante la aportacin que hace al tratamiento el anlisis de la
expresin de genes implicados en los mecanismos de reparacin del ADN,
como ERCC1, y en los mecanismos de accin de citostticos y el conocimiento
de determinados polimorfismos genticos tales como TS, UGT1A1, XRCC1, XPD,
que van a modificar la sensibilidad o resistencia a determinados frmacos y
que sern tratados ampliamente en esta revisin.
Introduccin
La biologa molecular del cncer colorrectal (CCR) abarca una amplsima
variedad de aspectos que van desde la carcinognesis del tumor hasta la
aplicacin al tratamiento de esta neoplasia. Es de sobra conocida la teora de
las etapas mltiples del desarrollo del tumor desde el plipo hasta el cncer
invasivo debido a la acumulacin de alteraciones genticas, metilaciones,
mutaciones, deleciones, que se inician en la mutacin del gen APC de la
poliposis mltiple familiar, igual en el cncer hereditario ligado a la poliposis,
caso en el que se nace con un alelo mutado, como en el cncer de colon y
recto espordico, en el que la mutacin se adquiere durante la vida para los
dos alelos. En este caso el gen responsable, APC, es un gen supresor, mientras
que en el caso del otro sndrome hereditario, el sndrome de Lynch, el cncer
de colon hereditario no ligado a la poliposis, est relacionado con la mutacin
de un gen de una familia de genes reparadores de los que los ms frecuentes
son el MSH2 y MLH1. El conjunto de cnceres hereditarios representa menos
del 15% de los cnceres de colon y recto, siendo el tipo APC menor del 2% (fig.
1). Otro gen de gran importancia es el oncogn k-ras. Las mutaciones de este
oncogn estimulador del crecimiento son de relevante importancia en el
desarrollo del carcter invasivo del CCR e imprimen adems distintos grados

de agresividad al tumor que, como veremos, tienen valor pronstico.

Finalmente, los diferentes genes implicados en la reparacin del ADN, as como
otros relacionados con el metabolismo o las dianas de los diferentes frmacos
citostticos activos en el CCR, son actualmente de mximo inters ante las
posibilidades que abren para poder seleccionar el tratamiento para cada
paciente. La determinacin en el tumor de los ttulos de expresin de estos
genes o la determinacin en suero de determinados polimorfismos presentes
en algunos de ellos permite tener una aproximacin a la sensibilidad o
resistencia que va a presentar el paciente (el tumor) a determinado
tratamiento. Es evidente la imposibilidad de tratar todos estos temas con
profundidad en el corto espacio de que se dispone en un captulo de revisin,
por lo que, dada la trascendental importancia que puede tener la seleccin del
tratamiento y que, por otra parte, es un tema menos conocido, y en pleno
desarrollo, vamos a centrar nuestro captulo en los datos de biologa molecular
y el pronstico y tratamiento de los pacientes afectados de CCR.
Biologa molecular y tratamiento adyuvante
Si bien el tratamiento adyuvante del estadio III est perfectamente establecido,
no existen datos definitivos sobre la indicacin de tratamiento en el estadio II
de colon y todava menos en el I. El estudio de determinados genes aporta
datos sobre el pronstico de este grupo de pacientes, que permiten seleccionar
el subgrupo de riesgo que debera ser tratado en rgimen adyuvante.
En 1998 se publicaron ya los resultados referentes al valor pronstico de las
mutaciones del gen k-ras que se analizan en un gran metaanlisis en el estudio
RASCAL1. Este estudio incluye a 2.721 pacientes procedentes de 22 trabajos
de 13 pases diferentes, lo que lo convierte en una muestra ampliamente
representativa. Los resultados de este metaanlisis demuestran un riesgo de
recurrencia y muerte significativamente ms alto para los pacientes que
presentan mutaciones del k-ras. Para la existencia de cualquier mutacin el
riesgo de recurrencia presenta una significacin de p = 0,001 y de p = 0,004
para el riesgo de muerte. La mutacin especfica de la valina en el codn 12
empeora el pronstico respecto a otras mutaciones tambin de manera
significativa (p < 0,007). En nuestra experiencia, aunque existe diferencia, sta
no llega a ser significativa (p = 0,07) para cualquier mutacin, aunque s existe
diferencia significativa para el estadio II respecto a no tener mutacin o tener
mutacin en asprtico o serina (p = 0,03)2. Tambin el desequilibrio
cromosmico, las prdidas de heterocigosidad (LOH) en 18q, ha demostrado
ser un factor diferencial en diversos estudios. Los tres con mayor nmero de
pacientes demuestran, aunque con porcentajes de LOH diferentes, que la LOH
en el estadio II empeora la supervivencia a los 5 aos de manera significativa35. Recientemente se ha publicado un estudio de gran trascendencia6 en el que
se analiza el desequilibrio cromosmico (allelic imbalance) en 8p y 18q. El
estudio incluye a 180 pacientes sin afectacin ganglionar ni metstasis en el

momento de la ciruga; por tanto, en estadios I y II de cncer de colon. Se

analiza el desequilibrio allico de los cromosomas 8p y 18q mediante SNP
(single-nucleotide polymorphism) y se clasifica a los pacientes segn presenten
desequilibrio en ninguno, uno o ambos constituyendo los grupos L (dos
desequilibrios), L/R (un desequilibrio) y R (ningn desequilibrio). La
supervivencia libre de enfermedad a los 5 aos es significativamente peor para
los pacientes con desequilibrio cromosmico (del 58% para los pacientes del
grupo L, del 74% para el grupo L/R y del 100% para los pacientes del grupo R;
p < 0,0001) (tabla 1). Es de destacar que los pacientes en estadio I del grupo L
tienen un pronstico peor que los pacientes en estadio II del grupo R y se
concluye que, en los pacientes sin metstasis, el desequilibrio cromosmico es
mejor predictor pronstico que la clasificacin anatomopatolgica. A nuestro
entender, este estudio da la clave para seleccionar qu pacientes en estadio I o
II de cncer de colon deben ser tratados con quimioterapia adyuvante, aunque
desgraciadamente esto est todava lejos de ser introducido en la prctica
habitual. Otro aspecto es el de la seleccin del tratamiento ms adecuado. Los
ttulos de expresin de la timidilato sintasa (TS) se han sealado desde hace
aos como un factor de mal pronstico en el CCR y recientemente se ha
demostrado su efecto sobre la sensibilidad a 5-FU. Ms adelante veremos cmo
afecta este factor en la seleccin del tratamiento de los pacientes afectados de
CCR metasttico. Su influencia pronstica en los pacientes tratados con
intencin curativa y sometidos a tratamiento adyuvante est demostrada.
Citamos dos artculos de reciente publicacin que vienen a ilustrar el estado
actual del tema. Uno con relacin al cncer de recto analiza la importancia del
polimorfismo del gen de la TS (vase en el apartado dedicado al cncer
metasttico) en el downstaging del cncer de recto tratado con
quimiorradioterapia preoperatoria basada en 5-FU, y el otro investiga el valor
pronstico de los ttulos de TS en pacientes tratados con quimioterapia
adyuvante tambin basada en 5-FU. En el primer estudio, que incluye a 65
pacientes, se demuestra que los valores altos de TS hacen que el tratamiento
preoperatorio no consiga bajar el estadio de la enfermedad (22 frente al 60%),
demostrando resistencia a 5-FU7 . El segundo estudio incluye a 862 pacientes
afectados de CCR en estadios B y C de Dukes procedentes de ensayos de
quimioterapia adyuvante basada en 5-FU. Los ttulos de TS se determinaron por
inmunohistoqumica en las muestras de tejido de los tumores. Los resultados
demuestran un mejor pronstico global para los pacientes con valores bajos de
TS y se mantiene para los pacientes tratados con ciruga sola (p < 0,001 para
el intervalo libre y p = 0,001 para la supervivencia a los 5 aos)8. Hoy por hoy
el tratamiento adyuvante del cncer de colon es estndar y uniforme para
todos los pacientes con el esquema de la Clnica Mayo de 5-FU bolos con
modulacin bioqumica con cido folnico. La superioridad de la
poliquimioterapia en el cncer avanzado ha de demostrarse tambin en los
estudios de quimioterapia adyuvante actualmente en curso. Si esto es as, la
seleccin del tratamiento sobre la base de determinantes moleculares

individuales que desarrollaremos a continuacin ser tambin aplicable al

tratamiento adyuvante.
Biologa molecular y tratamiento individualizado en la enfermedad metastsica
En los ltimos 15 aos se ha producido un gran avance en el tratamiento del
CCR, debido fundamentalmente a tres puntos clave en el desarrollo de la
quimioterapia en este tumor: la introduccin de la modulacin bioqumica; la
infusin continua (IC) con altas dosis de 5-FU y la demostracin de su
superioridad frente al bolos, y sobre todo la introduccin de nuevos agentes
activos en este tumor, bsicamente el oxaliplatino (OXA) y el CPT-11, que han
permitido la introduccin de la poliquimioterapia y de la segunda lnea de
tratamiento. Dejando aparte los excelentes resultados de la ciruga de las
metstasis hepticas, en los pacientes con enfermedad diseminada no
resecable podemos hablar actualmente de un 40-50% de respuestas con otro
tanto de estabilizaciones y una supervivencia de 16-22 meses de mediana con
cualquiera de los esquemas de combinacin de IC de 5-FU, ya sea con OXA o
CPT-11. La optimizacin del tratamiento para mejorar estos resultados es difcil,
y en este sentido la posibilidad de seleccionar el tratamiento segn las
caractersticas del paciente es de gran inters. En la figura 2 se esquematizan
los mecanismos de accin de 5-FU, OXA y CPT-11 con las vas metablicas ms
importantes y los genes implicados en ellas. En el caso del 5-FU el mecanismo
ms relevante es la inhibicin de la TS y en ello estn implicadas la propia TS y
la dihidropirimidina deshidrogenasa (DPD), que acta en la catabolizacin de
las pirimidinas y es la causa del 85% de la desactivacin del metabolito activo
de 5-FU (FdUMP). Otras enzimas como la dihidrofolatorreductasa (DHFR) o la
timidinfosforilasa (TP) tambin intervienen en la actividad de 5-FU. Variaciones
en la expresin o actividad de los genes relacionados originarn distinta
respuesta a 5-FU y a los agentes inhibidores de la TS en general. El CPT-11 es
un inhibidor de topoisomerasa I (TOPO-I). Su accin la realiza mediante su
activacin a un metabolito activo, el SN-38. SN-38, a su vez, se inactiva por
glucorunidacin mediante la accin de la UGT1A1, de la familia de las UDPglucoronosiltransferasas (UGT), encargadas de la metabolizacin de la mayora
de los frmacos. Un dficit de UGT1A1 conduce a una disminucin en la
inactivacin de SN-38 y, por tanto, a una exposicin ms prolongada, lo que
lleva a una respuesta distinta de la accin de CPT-11, bsicamente un
incremento de toxicidad, como veremos ms adelante. El OXA, como todos los
derivados platinados, acta en el ADN produciendo aductos que impedirn la
duplicacin. En este caso van a competir todas las vas de reparacin de ADN a
travs de la activacin de diversos genes: el ERCC1 (excision repair
crosscomplementing 1), que acta por la va del NER (nucleotide excision
repair) y que constituye el eje de la preservacin de ADN ante el ataque de los
derivados platinados y cualquier otro agente txico; el XPD (xeroderma
pigmentosum clase D) o ERCC2 y XPF son de gran inters; el XRCC1, que acta
por la va del BER (base excision repair) y que se relaciona muy directamente

con la actividad de OXA, y el XRCC3, que acta en la va de DSBR (double

strand break repair). Todos ellos van a actuar reparando el dao inducido por
los agentes txicos e induciendo la apoptosis celular si no son capaces de
repararlo. Una alteracin en su funcionamiento lleva a una mayor actividad del
agente txico, los derivados platinados en el caso que nos ocupa. Se sabe que
los individuos con dficit en los sistemas de reparacin de la ADN son ms
susceptibles a padecer cncer mientras que, cuando lo padecen, son ms
sensibles al tratamiento. Todos estos genes conforman un conjunto de factores
que modifican la actividad de los citostticos activos en el CCR.
Determinantes individuales de sensibilidad/toxicidad o resistencia a citostticos
en el cncer colorrectal
En el apartado anterior hemos descrito las vas ms importantes por las que
actan los citostticos con indicacin en el CCR y los genes implicados en ellas.
Con ello podemos configurar una serie de factores genticos o moleculares que
pueden permitir una seleccin del frmaco con ms actividad de manera
individualizada para cada paciente en razn del estado de dichos genes. Para
ello disponemos del anlisis de la expresin de genes y de la determinacin de
los llamados polimorfismos gen- ticos. Un polimorfismo gentico consiste en
una variante gentica frecuente en la poblacin (> 1%) que, a diferencia de la
mutacin, que es muy poco frecuente (< 1%), no constituye patologa, pero
puede modificar la funcin de la protena para la que el gen est codificando.
La existencia de polimorfismos genticos en los genes implicados en la
actividad de 5-FU y otros inhibidores de la TS, el CPT-11 y el OXA abre un
interesante campo para la seleccin del tratamiento. As, se puede distinguir
dos tipos de determinantes individuales relacionados espec- ficamente con los
citostticos en el CCR: la sobreexpresin de determinados genes y la existencia
de polimorfismos genticos (tabla 2). Expresin de genes. La relacin entre los
ttulos de expresin de la TS tumoral y la respuesta al tratamiento con 5-FU ha
sido ampliamente demostrada. Lenz et al9 demostraron en 57 pacientes
afectados de adenocarcinoma gstrico que la respuesta al tratamiento con 5FU y la supervivencia estn relacionadas con los ttulos de expresin del ARNm
de la TS. La mediana del ARNm de la TS en los tumores de pacientes que
respondan era de 2,3 103, mientras que en enfermos que no respondan la
mediana era de 6,8 103, diferencia que era estadsticamente significativa.
Estos mismos autores han estudiado los valores de ARNm de la TS en el CCR
avanzado en tratamiento de infusin continua de 5-FU demostrando, al igual
que en el caso anterior, la relacin entre los ttulos de expresin y la respuesta
al tratamiento10,11. Otros estudios se han centrado en el grado de actividad y
expresin del gen dihidropirimidina deshidrogenasa (DPD). En un estudio
realizado por el grupo de Lenz12 se analizaron al mismo tiempo los valores del
ARNm de la TS y DPD en enfermos afectados de neoplasia colorrectal. Se
demostr que todos los que respondieron al tratamiento con 5-FU presentaban
ttulos bajos de TS o DPD, de manera que estos dos factores tienen un valor

predictivo de respuesta a este tipo de tratamiento. Tambin es de gran

importancia la demostracin del incremento de la toxicidad a 5-FU generado
por el dficit de DPD y que explica los casos de toxicidad grave con la
administracin de este frmaco13. La expresin de ERCC1 est en relacin con
la respuesta al tratamiento con derivados platinados como el OXA. Ya se ha
comentado la importancia que tiene este gen en la reparacin del dao
inducido al ADN. La resistencia al cisplatino originada por la sobreexpresin de
este gen ya fue demostrada en cncer gstrico por el grupo de Lenz14. En un
reciente trabajo, tambin del mismo grupo15, se analiza la expresin de ERCC1
y TS, as como la respuesta al tratamiento en 50 pacientes afectados de CCR
metasttico tratados con 5-FU y OXA en segunda lnea de tratamiento al fallo a
5-FU + CPT-11. Se demuestra que los valores bajos de TS van ligados a una
mejor respuesta y supervivencia, con un 75% de respuesta objetiva (RO) frente
al 25% (p = 0,02) y 10,2 frente a 1,5 meses de supervivencia mediana (p <
0,001). Respecto a ERCC1 se demuestra diferencia nicamente en la
supervivencia, que es superponible a la obtenida segn la TS (p < 0,001).
Cuando se realiza el anlisis combinando de los dos factores moleculares,
existe diferencia significativa en la supervivencia respecto a tener los dos bajos
frente a las otras posibles combinaciones. Polimorfismos genticos. Los
polimorfismos genticos son, como ya se ha dicho, variaciones en la estructura
del gen, generalmente en la zona promotora. Se trata de variaciones
germinales y, por tanto, forman parte de la estructura gentica del individuo,
de manera que no se modifican a lo largo de la vida ni por efecto de los
tratamientos. Al ser cambios en el ADN genmico, su anlisis se puede realizar
a partir de una muestra de sangre con extraccin de ADN de los linfocitos, lo
que simplifica muchsimo la metodologa de la obtencin de muestras y se
desprende de la necesidad de realizar biopsias. En la mayora de los casos se
correlacionan con la expresin del gen y sobre todo con la conservacin de la
funcin o no de la protena. Es por ello que consideramos que representan un
campo de sumo inters en el camino de la seleccin del tratamiento por
paciente. Polimorfismos de TS. El gen de la TS presenta un polimorfismo en la
zona promotora consistente en doble o triple tndem de repeticin de 28 pares
de bases. Los individuos pueden tener doble repeticin en los dos alelos y ser
homocigotos para dos repeticiones; triple repeticin en los dos alelos y ser
homocigotos para tres repeticiones, o tener dos y tres repeticiones y ser
heterocigotos. Dado el elevado nmero de repeticiones que hacen que el peso
molecular (PM) sea notablemente distinto, la separacin de las distintas formas
de polimorfismo se puede hacer mediante electroforesis (fig. 3). Estudios in
vitro han demostrado que la triple repeticin en los dos alelos comporta valores
de hasta 2,6 ms altos de TS que para los homocigotos para dos
repeticiones16. Segn el polimorfismo de la TS, pues, los pacientes
homocigotos para dos repeticiones seran ms sensibles a 5-FU, mientras que
los homocigotos para tres repeticiones seran resistentes. Este hecho se ha
demostrado en estudios clnicos. Tambin el grupo de Lenz desarroll un

estudio cuyos resultados17,18 prueban que, in vivo, las concentraciones de TS

para los pacientes homocigotos para tres repeticiones (3/3) alcanzan cifras 3,6
veces superiores a las de los homocigotos para dos repeticiones (2/2). Esto se
traduce en un ndice de respuestas del 9% para los 3/3 frente al 50% para los
2/2; las respuestas para los heterocigotos es de 15% (p = 0,04). Estos
resultados son similares a los de Marsh et al, quienes con 24 pacientes refieren
fallo de respuesta en el 40% de los 3/3 frente al 22% para los 2/2, con
diferencia tambin en la supervivencia de dos meses sin alcanzar diferencias
significativas19. El mismo grupo analiza la relacin del polimorfismo de la TS y
la respuesta al tratamiento con otro inhibidor de la TS, la capecitabina, en 22
pacientes y obtienen un 80% de respuestas para los 2/2 y tan slo el 14% para
los 3/3 (p = 0,02)20. En nuestra experiencia en un grupo de pacientes que
recibieron tratamiento de segunda lnea con 5-FU + CPT-11, no encontramos
diferencias en la respuesta al tratamiento respecto al polimorfismo de TS con
tres respuestas y una progresin para los 3/3 y una respuesta y una progresin
para los 2/2 en un total de 5 respuestas de los 21 pacientes (24%)21. Al
tratarse de segunda lnea de tratamiento y poliquimioterapia es posible que el
factor molecular con relacin a la respuesta a 5- FU pierda potencia. De los
resultados obtenidos hasta ahora, el polimorfismo del gen de la TS parece
asociado a la respuesta al tratamiento con 5-FU de manera significativa.
Polimorfismo de UGT1A1. Como ya se ha dicho, CPT- 11 se metaboliza a SN-38
para actuar inhibiendo a TOPO-I. El SN-38 es desactivado por glucorunidacin y
excrecin por accin de UGT1A1. El dficit en la actividad de UGT1A1 ir ligado
a una mayor exposicin de SN-38. Se ha descrito tambin un polimorfismo en
la zona promotora, la regin llamada TATA box del gen de UGT1A1. Este
polimorfismo consiste en una variacin en el nmero de repeticiones del
dinucletido TA que vara de 5 a 8. En la poblacin caucsica se limitan a 6 o 7,
y la forma normal es la homocigota para 6 repeticiones (6/6). Basndose en
estudios funcionales se ha demostrado que la actividad del gen es
inversamente proporcional al nmero de repeticiones. La presencia de 7
repeticiones en uno de los dos alelos se asocia a una disminucin de la
actividad de UGT1A1. En este caso, debido al pequeo nmero de repeticiones,
las diferentes formas del gen no pueden separarse por electroforesis y es
necesaria la secuenciacin para determinar el tipo de polimorfismo (fig. 4). La
frecuencia en la poblacin espa- ola es del 43% de homocigotos para 6
repeticiones (6/6), del 49% para los heterocigotos y de slo el 8% para
homocigotos con 7 repeticiones (7/7) (Martnez E, Abad A, et al, comunicacin
personal, 2000). La relacin de este polimorfismo con la aparicin de toxicidad
en pacientes tratados con CPT-11 se ha demostrado en la cl- nica. El estudio
ms importante22 incluye a 118 pacientes afectados de CCR avanzado
tratados con CPT-11. La toxicidad grados 3-4 tanto hematolgica como de
diarreas fue significativamente ms alta para los pacientes con dficit de
UGT1A1, los homocigotos para 7 repeticiones y tambin para los heterocigotos,
con un 54 y un 31% de los 26 pacientes que la presentaron, frente al 15% para

los homocigotos 6/6 (p = 0,001). En nuestra experiencia (Abad et al,

Perspectives in colorectal cancer, Dubln 2001), aunque sin alcanzar
significacin estadstica, la toxicidad grados 3-4 en un grupo de 21 pacientes
tratados con 5-FU + CPT-11 fue ms elevada, con un 55% de diarreas para los
pacientes con 7 repeticiones en algn alelo (5 de 9) frente al 33% para los
homocigotos 6/6 (4 de 12). Los resultados hasta el momento indican
claramente un riesgo de toxicidad grave con relacin al polimorfismo 7/7 de
UGT1A1 en los pacientes tratados con CPT-11, sin que existan datos respecto a
su influencia en los resultados del tratamiento. Polimorfismo XRCC1. El OXA, al
igual que todos los derivados platinados, ejerce su accin citotxica daando al
ADN. En los mecanismos de reparacin de ADN interviene el gen XRCC1,
perteneciente al sistema BER, descrito anteriormente. Se ha descrito en este
gen un polimorfismo que modifica la eficiencia reparadora de XRCC1. En este
caso, el polimorfismo consiste en un cambio de una base en el codn 399 del
exn 10 del gen. Se considera normal y por tanto, con la funcin reparadora
correcta el polimorfismo arginina/arginina. El cambio consiste en la sustitucin
de una o las dos guaninas por adenina (ag), de manera que tendremos
glutamina/arginina o adenina en los dos alelos (aa) glutamina/glutamina.
Recordemos que la accin de XRCC1 es reparar el dao producido en el ADN y
la induccin de apoptosis si no puede repararlo. El dao inducido por OXA no es
reparable y en condiciones de normalidad de XRCC1 se induce la apoptosis y la
clula muere, lo que se traduce en sensibilidad a OXA. Cuando la funcin est
disminuida por la existencia de alguno de los polimorfismos, el dao no se
repara, pero XRCC1 no es capaz de inducir la apoptosis, por lo que la clula
prolifera, lo cual se corresponde con resistencia a OXA. De nuevo el grupo de
Lenz analiza los resultados del tratamiento con 5-FU + OXA en dos trabajos. El
primero23 incluye a 45 pacientes tratados en segunda lnea de quimioterapia.
La RO para los pacientes con XRCC1 normal (aa) es del 83% (5 de 6) y del 33%
para los pacientes con un cambio en algn alelo. Si se analizan por
progresiones, las diferencias son del 22% para (aa), del 44% para (ag) y del
33% para los pacientes (gg). La supervivencia es de 11,2 meses para los (gg) y
de 8,5 para los (aa). En el segundo trabajo24 se analiza a 61 pacientes en
primera lnea de tratamiento con 5-FU + OXA. Aunque la respuesta global es
muy baja (del 18%, lo que no refleja los resultados alcanzables actualmente en
el tratamiento del CCR metasttico), el anlisis de las respuestas demuestra
una clara superioridad para los pacientes con XRCC1 normal (gg) o arg/arg con
un 73% de RO frente al 27% para los pacientes con algn cambio. El 66% de
los que no presentaron respuesta eran heterocigotos o homocigotos para (aa) o
gln/gln, lo que significa un riesgo 5,2 veces mayor de fallar al tratamiento (p =
0,03). Polimorfismo XPD. El gen del xeroderma pigmentosum de la clase D
(XPD) es otro miembro importante del sistema de reparacin de ADN. Este gen
presenta polimorfismos en tres posiciones, que son: C156A, llamada XPD156;
Asp312Asn, llamada XPD312, y la que tiene por el momento ms importancia
clnica, Lys751Gln, llamada XPD751. Se trata de un cambio en un aminocido

(single nucleotide polymorphism). En el caso de XPD751, el genotipo Lys/Lys se

considera la forma normal y por tanto debe mantener el sistema de reparacin
intacto. El polimorfismo consiste en el cambio de una Lys por Gln o en la
sustitucin de las dos Lys por Gln. Si bien la lgica indica que la presencia de
un polimorfismo debera conducir a un dficit de reparacin, los estudios hasta
el momento son contradictorios25,26. Tambin en este caso Lenz et al
desarrollaron un estudio que incluye a 73 pacientes y en el que analizan la RO
y la supervivencia con relacin a los tres polimorfismos descritos27. No
encuentran ninguna influencia en los polimorfismos XPD156 ni XPD 312. El
anlisis del polimorfismo XPD751, sin embargo, es de gran inters. Los
pacientes son previamente tratados con 5-FU o CPT-11 y reciben segunda lnea
de tratamiento con 5-FU + OXA. En este caso la RO y la supervivencia son
significativamente mejores para los pacientes con el sistema de reparacin
normal. As, los pacientes Lys/Lys presentaron un 24% de respuestas frente al
10% para los dems grupos (p = 0,015). La supervivencia fue de 17,4 meses
para la forma Lys/Lys, de 12,8 para los heterocigotos y de tan slo 3,3 meses
para los homocigotos Gln/Gln (p = 0,002). Tambin los resultados acumulados
hasta el momento respecto a los genes implicados en la reparacin del ADN,
tanto XRCC1 como XPD (ERCC2), indican una clara relacin entre sus
polimorfismos y la respuesta al tratamiento. Consideraciones finales En este
captulo hemos revisado los datos tanto conceptuales como de resultados
comunicados hasta el momento. Queremos aadir para finalizar que es
necesario sealar que la prctica totalidad de los estudios con resultados
positivos provienen del mismo grupo de trabajo y que no se encuentran
trabajos procedentes de otros grupos, por lo que es necesario confirmar estos
resultados. No obstante, la experiencia acumulada hasta ahora indica que la
determinacin de los polimorfismos genticos y otros marcadores, como la
expresin de determinados genes, permite la seleccin de la combinacin
ptima de citostticos para cada paciente y, por tanto, la individualizacin del
tratamiento con quimioterapia no tan slo en el CCR, sino en los pacientes
neoplsicos en general. Es ste un camino de futuro en el que debemos poner
el mximo esfuerzo para disear ensayos clnicos comparativos con la potencia
necesaria para alcanzar conclusiones con evidencia de primer orden.

Cncer colorrectal hereditario: anlisis molecular de los genes APC y

MLH1
El cncer colorrectal (CCR) es, actualmente, una causa importante de
mortalidad, con ms de mil muertes al ao en nuestro pas1. En pases
desarrollados con alta prevalencia de cncer colorrectal, se ha sugerido realizar
un tamizaje a todo paciente mayor de 50 aos, o antes a pacientes con mayor
riesgo, con antecedentes familiares, enfermedades inflamatorias intestinales y
otros2. En Chile, iniciativas como esta supondran un alto costo, adems que
los estudios disponibles producen incomodidad en los pacientes. Dentro de las
variantes hereditarias de CCR se cuentan dos sndromes en los cuales la
predisposicin a la enfermedad se basa en una mutacin de la lnea germinal3.
Uno de ellos es la poliposis adenomatosa familiar (PAF)4. Esta se caracteriza
por la presencia de mltiples adenomas colnicos (>100) de aparicin
temprana, y por ser autosmica dominante con una penetrancia de 100%5,6.
Adems, la PAF se asocia a lesiones en otros parnquimas, como adenomas
periampulares, tumores desmoides, alteraciones retinales y cncer papilar de
tiroides, entre otras7-13. En 1991, se identific al gen supresor de tumores APC
(cromosoma 5) y se determin qu mutaciones en este gen son la causa
principal de la PAF14. Este gen contiene 15 exones, entre los cuales, el de
mayor tamao es el exn 15 con 6570 pb. El gen APC codifica para la protena
APC, que se une a - catenina, promoviendo la degradacin de esta ltima,
regulando as su funcin. La ausencia de APC permite la entrada de -catenina
al ncleo, la cual activa la expresin de genes que estimulan la proliferacin
celular. De esta forma, mutaciones que suprimen la funcin de APC, podran ser
responsables del inicio de un proceso neoplsico al perderse el control del
supresor APC sobre -catenina. As, la aparicin de plipos adenomatosos en
todo el tracto digestivo, en especial en el colon, con una edad promedio de
aparicin a los 16 aos, y de desarrollo del cncer a los 39 aos6, pueden
explicarse por un descontrol del ciclo celular iniciado por la ausencia de la
funcin de APC. Por otra parte, se estima que entre 1 y 5% de los cnceres

colorrectales aparecen en pacientes portadores de cncer de colon hereditario

no poliposo (HNPCC)4,6,15. Este sndrome, fue descrito por Henry Lynch16 en
1966, en dos familias que presentaban cncer colorrectal en ausencia de
plipos del colon, por lo cual tambin se le conoce como sndrome de Lynch.
Los individuos con HNPCC se caracterizan por presentar tumores a una edad
temprana, de preferencia en el colon derecho y presentan antecedentes
familiares de cncer tanto de colon y recto, como de otros tejidos (endometrio,
ovario, urotelio). Como caracterstica importante, estos tumores presentan en
su ADN genmico una inestabilidad microsatelital de alta frecuencia. Para la
identificacin de pacientes de riesgo se han elaborado criterios clnicos, entre
los cuales se cuentan los criterios de Amsterdam I y II y Bethesda6. Un alto
porcentaje (90%) de los pacientes HNPCC presentan mutaciones en la lnea
germinal, para el gen MLH1 (cromosoma 3, mRNA de 2524 pb, 19 exones) o
bien para el gen MSH2 (cromosoma 2, mRNA 3145 pb, 16 exones)5. Estos dos
genes codifican para enzimas que participan en el sistema de reparacin del
ADN. De esta forma, la ausencia de cualquiera de estas funciones celulares
permite la acumulacin de mutaciones en el ADN, que al ocurrir en genes
supresores de tumores o protoncogenes, colaboran en el desarrollo del proceso
neoplsico. Recientemente, nuestro grupo public el anlisis de genealogas y
resultados quirrgicos de pacientes HNPCC y PAF17,18. Es destacable la gran
relevancia que ha cobrado la deteccin de mutaciones en los genes
involucrados en cncer de colon, especialmente en relacin con el pronstico y
desarrollo del tumor, y en relacin con el diagnstico de familiares
asintomticos. En este trabajo presentamos el hallazgo de dos mutaciones, una
en el gen APC y otra en el gen MLH1, en tres familias chilenas. PACIENTES Y
MTODOS Pacientes. Se incluyeron 5 pacientes: 2 con demostracin
histopatolgica de cncer y que cumplieran los criterios de Amsterdam para
HNPCC (una familia) y 3 con diagnstico histolgico de PAF que demostrara la
presencia de al menos 100 plipos adenomatosos (2 familias). Tcnicas.
Obtencin de ADN genmico: el ADN genmico fue aislado a partir de 10 ml de
sangre perifrica, mediante el protocolo descrito por Lahiri et al en 199119. El
ADN obtenido fue estudiado en busca de alteraciones del gen APC, en los
pacientes con PAF, o en el gen MLH1, en la familia con HNPCC. Deteccin de
mutaciones. El anlisis molecular de los genes se realiz por la tcnica de
conformmeros de hebra simple (Single Strand Conformer PolymorphismSSCP). Para esto se realiz la amplificacin por PCR de todos los exones de los
genes APC y MLH1 (menos el exn 15 del gen APC). Para el exn 15 del gen
APC, se analizaron slo aquellas regiones que presentan una alta frecuencia de
mutaciones segn est descrito en la literatura20. La reaccin por PCR se llev
a cabo segn el siguiente protocolo: en un volumen final de 50 l se agregan
100 ng de ADN genmico, 25 pmoles de cada partidor, 1U de Taq ADN
polimerasa (Fermentas), 0,2 mM de cada desoxinucletido trifosfato
(dATP,dCTP,dGTP y dTTP), MgCl2 2,5 mM y amortiguador Taq (Tris-HCl 10 mM
pH 8,8; KCl 50 mM, Nonidet P40 al 0,08%). Los partidores utilizados para cada

gen han sido previamente descritos en la literatura14,20-23. Los productos de

PCR fueron desnaturados, colocndolos a 90 por 5 min en una solucin que
contiene: formamida al 95%, EDTA 20 M, azul de bromofenol al 0,25% p/v,
xilencianol al 0,25% p/v y NaOH 10 mM. Posteriormente, estos productos se
separan por electroforesis de alta resolucin en geles de poliacrilamida MDETM
0,5 X (Mutation Detection Enhancement, Cambrex Bio Science Rockland, Inc.
ME, USA) en condiciones nativas. La electroforesis se realiz a una potencia
constante de 3 watts por 14 h y el gel fue teido con nitrato de plata.
Secuenciacin de ADN. Los productos de PCR que presentan un cambio en la
migracin electrofortica, con respecto a los controles en la tcnica de SSCP,
se someten a secuenciacin en un secuenciador automtico ABI PRISM 3100 v
3.7 (Applied Biosystems, CA, USA). Se definieron como mutaciones las
alteraciones genticas que deriven en una protena de menor tamao,
produciendo un efecto drstico sobre la funcin de la protena, a travs de la
prdida de dominios de interaccin con otras molculas o cambios
conformacionales. RESULTADOS Anlisis del gen APC en familias PAF. El caso
ndice de la familia PAF4, cuya genealoga se presenta en la Figura 1A,
corresponde a un paciente de 26 aos operado a los 21 aos por PAF, sometido
a colectoma total e leo-recto anastomosis. El hermano de su padre,
actualmente de 52 aos, fue sometido a una proctocolectoma total e
ileostoma terminal por PAF a los 18 aos, momento en que se diagnostic un
cncer de colon sigmoides. Este familiar y el caso ndice fueron sometidos al
estudio gentico molecular. La familia PAF5 incluye a un paciente de 9 aos,
cuya genealoga se muestra en la Figura 1B. Su padre fue operado a los 22
aos por PAF, y posteriormente falleci a los 41 aos por cncer de pncreas
metastsico. Al paciente le fue diagnosticada una poliposis a los 6 aos,
posterior a lo cual present sangrado digestivo bajo intermitente. La
endoscopia digestiva alta confirm la presencia de plipos adenomatosos en el
estmago y el duodeno. Por presentar una poliposis sintomtica, se decidi
realizar una colectoma total ms una leo-recto anastomosis laparoscpica. El
anlisis molecular del gen APC se realiz slo en este paciente. En las dos
familias mencionadas, el anlisis molecular por medio de la tcnica SSCP
determin cambios en la migracin electrofortica en un fragmento del exn
15 del gen APC (Figura 2A). La secuenciacin de este fragmento revel la
delecin de cinco nucletidos entre las posi-ciones 3927 y 3931 del cADN
denominada c.3927_3931delAAAGA. Esta delecin provoca un desplazamiento
del marco de lectura del mARN, derivando en la aparicin de un codn de
trmino prematuro. De esta forma, la traduccin se interrumpe en el codn
1313, sintetizndose una protena de tamao menor a lo normal (2843
aminocidos) (Figuras 2B y 2C). Anlisis del gen MLH1 en familia HNPCC. La
genealoga de la familia HNPCC6 (Figura 3) est compuesta por una paciente
de 53 aos, operada de cncer de colon derecho hace un ao, realizndose una
colectoma total ms leo-recto anastomosis. Su hermano fue operado
anteriormente por cncer de colon transverso a los 42 aos, realizndose la

misma ciruga. En estos dos pacientes se realiz un anlisis molecular. El

estudio molecular del gen MLH1 mediante SSCP mostr una probable mutacin
en el exn 6 (Figura 4A). La secuenciacin de este fragmento demostr una
insercin de una adenina en el codn 168 del exn 6, denominada c.504insA.
Esta insercin provoca un desplazamiento del marco de lectura del mARN
derivando en la aparicin de un codn de trmino prematuro. De esta forma, se
obtiene una protena trunca de 171 aminocidos en comparacin con la
protena normal de 756 aminocidos (Figuras 4B y 4C). DISCUSIN Dentro del
espectro de los tumores colorrectales, aproximadamente 4 a 6% corresponde a
dos entidades bien identificadas: PAF y HNPCC, para las cuales se ha
identificado el gen de susceptibilidad correspondiente. En el primer caso, una
mutacin en el gen APC es la responsable de este cuadro, mientras que en el
segundo, alteraciones en los genes MLH1 o MSH2 se encontraran en la gran
mayora de los que presentan este sndrome. Los familiares directos de los
portadores de una mutacin en estos genes presentan hasta 50% de
probabilidad de presentar el gen alterado. Por esta razn, todos deberan
someterse a un estudio endoscpico precoz, ya que est demostrado que el
identificar pacientes de riesgo permite detectar tumores en etapas tempranas,
permitiendo una mejor sobrevida6,24-26. En los ltimos diez aos, el avance
en el conocimiento de la gentica molecular humana, ha permitido identificar
los genes responsables de diversas enfermedades hereditarias, incluidos
algunos tipos de cncer. Esto mismo ha posibilitado identificar mutaciones
causantes de estas patologas, permitiendo un diagnstico preciso en aquellos
pacientes portadores de la enfermedad, adems de entregar a los no
portadores la posibilidad de no someterse a estudios incmodos, de alto costo
y de por vida. En este estudio, el anlisis de las dos familias PAF, mostr una
delecin de 5 nucletidos entre los codones 1308 y 1310 del exn 15, entre
dos sitios de unin de -catenina. Esta mutacin ha sido la ms
frecuentemente descrita en la literatura mundial en pacientes con PAF, y
produce un codn de trmino con la sntesis de una protena trunca. Esta
protena truncada carece de la segunda regin de unin a -catenina, que es la
de mayor importancia en la regulacin negativa de sta27. Es interesante que
esta mutacin ha sido asociada por diversos autores con una aparicin ms
temprana de los plipos28-30, un mayor compromiso rectal con la subsecuente
necesidad de proctocolectoma27 y un comportamiento ms agresivo de la
enfermedad31,32, que la mayora de los casos de PAF. En las familias
estudiadas, se demuestra un fenotipo de la enfermedad agresivo y de aparicin
precoz, con un caso operado antes de los 10 aos, otro a los 18, y dos
familiares muertos por cncer antes de los 40 aos. Efectivamente, en el
seguimiento de dos pacientes portadores de esta mutacin y que han sido
sometidos a una colectoma total se ha observado el desarrollo de mltiples
plipos rectales que no han respondido a la terapia farmacolgica con
Celecoxib33. Esto hace pensar que en un corto plazo ser necesario extirpar el
recto. En este sentido, un mejor conocimiento respecto a la asociacin

genotipo-fenotipo podra permitirnos plantear en los familiares asintomticos y

portadores de esta misma mutacin un enfoque teraputico distinto desde el
inicio. Por todo lo anterior, concordamos con Wu y cols27 al afirmar que en
individuos portadores de mutaciones en el codn 1309, el tamizaje
endoscpico debe comenzar precozmente. En el caso inverso, es decir,
pacientes que se presenten con poliposis en edades tempranas o de
comportamiento agresivo, el estudio mutacional se debe iniciar en la regin del
exn 15 que contiene esta mutacin. Esta mutacin tambin se ha descrito en
familias donde aparece un caso de PAF sin antecedentes familiares, lo cual se
denomina mutacin de novo34. Como se observa en la Figura 1B, el paciente y
su padre son los nicos que han presentado poliposis (ambos abuelos vivos y
sin evidencia de enfermedad), sugiriendo que la mutacin ocurri por primera
vez en el padre. Este hecho concuerda con que la mutacin ocurre en una
regin del gen llamada punto caliente (hot spot), es decir, con alta
probabilidad de sufrir mutaciones. Una situacin distinta es la que se observa
en los pacientes HNPCC, ya que como su abreviacin lo seala, este cncer no
se asocia al desarrollo de mltiples plipos y, de este modo, se debe ser muy
riguroso en la seleccin de los pacientes que se estudiarn. Desde el punto de
vista costo-efectividad, debieran estudiarse los pacientes que renan los
criterios Amsterdam I ya que en ellos la probabilidad de encontrar mutaciones
puede llegar a 60%-70%5. Tal cual como se puede observar en la Figura 3, nos
encontramos con una familia en la cual, adems del caso ndice, tres familiares
de primer grado han presentado cncer de colon en dos generaciones
sucesivas, uno de ellos antes de los 40 aos y adems en la anatoma
patolgica se ha descartado una poliposis. Con respecto al tratamiento de los
pacientes HNPCC, vemos que ambos fueron sometidos a una colectoma total
con anastomosis ileorrectal, conducta fundamentada por el alto riesgo de
desarrollar un tumor metacrnico (35% a 45%)26,35. Sin embargo, esta
operacin no excluye el riesgo de desarrollar un cncer metacrnico del recto
cuya probabilidad es de 11%3, por lo que se justifica un seguimiento
endoscpico de por vida. La mutacin c.504insA del gen MLH1 fue descrita en
el ao 200336 por primera vez, en un paciente de un estudio de 59 familias
HNPCC de la poblacin norteamericana. Esta mutacin produce el
desplazamiento del marco de lectura del mARN con lo que se sintetiza una
protena truncada en el codn 171, que constituye cerca de 23% del tamao de
la protena normal. No se describen en la literatura estudios funcionales de
esta mutacin. Sin embargo, el hecho de que la protena se presente como un
fragmento peque- o, que carece de los sitios de unin a las otras enzimas que
participan en el complejo de reparacin del ADN, lleva a afirmar que la protena
no sera funcional. Este estudio es el primero, en el medio nacional, en
identificar mutaciones en pacientes portadores de variantes hereditarias de
cncer colorrectal. La relevancia de estos resultados radica, tanto en la
modificacin de conductas teraputicas en los pacientes que manifiestan la
enfermedad (por la correlacin genotipo-fenotipo), como en la deteccin de

familiares asintom- ticos portadores de la mutacin, objetivo secundario de

este proyecto.