CIRCULACIN DE CLULAS DEL LINAJE OSTEOBLSTICO EN HUMANOS

ABSTRACTO

Fondo
A pesar de que la evidencia actual sugiere que solo un minsculo nmero de linajes de clulas osteoblsticas
estn presentes en la sangre perifrica, nosotros deducimos que tales clulas circulan, pero que su
concentracin ha sido vastamente desestimada debido al uso de pruebas que requieren adherencia a la
materia plstica. Pensamos adems que, la concentracin de estas clulas se eleva durante la etapa de
crecimiento seo, as como en el crecimiento puberal.
Mtodos
Usamos citrometria de flujo con anticuerpos en protenas especficas del hueso para identificar el linaje de
clulas osteoblsticas circulatorias en 11 adolescentes varones y 11 adultos varones. La expresin gnica in
vivo e in vitro en pruebas de formacin de huesos fue usada para establecer el linaje osteoblstico en clulas
determinadas.
Resultados
Las clulas positivas a la osteocalcina y clulas positivas a la fosfatasa alcalina especfica de hueso fueron
detectadas en la sangre perifrica de los sujetos adultos (de 1 a 2 porciento de clulas monucleares). Hubo
cinco veces ms la cantidad de clulas positivas para osteocalcina en la circulacin en los sujetos
adolescentes (de cuyos marcadores de formacin de huesos fueron notablemente incrementados como
resultado del crecimiento puberal) al compararlo con los sujetos adultos.
El porcentaje de clulas positivas a la osteocalcina correlacion con los marcadores de formacin de hueso.
Algunas clulas positivas a la osteocalcina expresaron genes osteoblasticos, ndulos mineralizados formado
in vitro, y hueso formado en una prueba de trasplantacin in vivo. Tambin se encontr valores incrementados
en tres adultos con fracturas recientes.

Conclusiones
El linaje de clulas osteoblsticas circula en significantes nmeros fisiolgicamente, correlacionado con
marcadores de formacin de huesos, y se marcan ms durante el crecimiento puberal; adems, deben
representar un componente circulatorio previamente no reconocido en el proceso de formacin sea.
La mdula sea contiene precursores de
remodelacin activa de huesos distantes de la
osteoblastos y osteoclastos que puede
mdula sea. Sin embargo, no es claro si un
diferenciarse en los osteoblastos y osteoclastos
proceso paralelo incluyendo linajes de clulas
maduros, que se cree que son necesarios para la
osteoblsticas existe y, si es as, que papel deben
remodelacin normal del hueso en superficies
tomar estas clulas osteoblsticas en una
trabeculares adyacentes a la mdula sea.
remodelacin de hueso normal o patolgico.
Adems de residir en la mdula sea, nmeros
Las clulas osteoblsticas en la mdula sea
sustanciales de precursores de osteoclastos son
se han identificado tradicionalmente por su
detectados en la circulacin perifrica, y estas
adherencia a cultivo de tejidos estndar de
clulas deben ser capaces de viajar a sitios de

materia plstica y la formacin subsecuente de

ndulos mineralizados. Usando este criterio,
investigadores han provisto evidencia que las
clulas osteoblsticas que se adhieren a la
materia plstica estn, en efecto, presentes en la
circulacin en algunas especies, pero en nmeros
excesivamente bajos (menos de 1 en 108 clulas
mononucleares en sangre perifrica en humanos
adultos)
Adicionalmente
a
estas
clulas
osteoblsticas adherentes, se ha identificado una
poblacin de clulas en la mdula sea que tienen
potencial osteognico, no son adherentes y son
positivas a la osteocalcina, fosfatasa alcalina
especifica de hueso, o los dos. Por otra parte, un
estudio reciente se mostr que las clulas de la
mdula sea que no estn adheridas a la materia
plstica tienen una actividad re poblacional del
hueso en ratones irradiados letalmente, que es
10 veces mayor que la de las clulas adherentes
de la mdula. Si las clulas osteognicas no
adherentes de la medula sea estn presentes en
la circulacin perifrica, las pruebas que se basan
slo en la adhesin a la materia plstica solo
detectaran la adhesin rara de las clulas
osteoblsticas circulatorias, resultando en una
desestimacin sustancial del nmero actual de
clulas osteoblsticas en la circulacin.
Hemos llegado a la conclusin que el uso de
citrometria de flujo con anticuerpos a las protenas
especficas de hueso (osteocalcina y fosfatasa
alcalina sea) identificaran mejor las clulas del
linaje osteoblstico. Adems, si estas clulas
osteoblsticas circulatorias juegan un papel
fisiolgico en la formacin de huesos, su
concentracin en la sangre perifrica se
incrementara bajo las condiciones del incremento
de formacin de huesos. Por lo tanto,
determinamos que la concentracin de estas
clulas en la circulacin de los adultos comparada
con la de adolescentes, quienes haban marcado
un incremento de formacin de hueso, se
increment ya que estaban pasando por el
crecimiento puberal.

METODOS
Sujetos de estudio
Los sujetos de estudio incluyeron 11 adultos
varones sanos de 28 a 49 aos y 11 adolescentes
varones de 13 a 15 aos. Para algunos estudios,
se obtuvo la capa leuco-plaquetaria de sujetos
varones del Centro de Transfusin de Mayo.
Todos los estudios fueron aprobados por la junta
de revisin institucional de la Clnica Mayo, y
todos los sujetos, o sus respectivos padres,
proveyeron su informe de consentimiento escrito;
los sujetos menores de 18 aos proveyeron
consentimiento. El estudio se realiz entre Mayo
del 2003 y Enero del 2005.
Mediciones de suero bioqumico y hormonas
El suero de osteocalcina fue medido con una
prueba inmunoradiometrica de doble sitio (ELSAOSTEO, CisBio) (coeficiente de variacin entre
pruebas, menor del 12 por ciento), y el suero de
fosfatasas alcalina sea fue medido por
inmunoprueba (Quidel) (coeficiente de variacin
entre pruebas, menor del 8 por ciento). El suero
del factor de crecimiento similar a la insulina I (IgfI) y la protena de unin a IGF 3 fueron medidos
con pruebas inmunoradiometricas (coeficiente de
variacin entre pruebas, menor del 15 por ciento).
El suero de testosterona fue medido por una
inmunoprueba competitiva (coeficiente de
variacin, menor del 10 por ciento), y el suero de
estradiol fue medido con una radioinmunoprueba
de anticuerpo doble (coeficiente de variacin,
menor del 8 por ciento.
Extraccin e inmunotincin de clulas
mononucleares
Las muestras de sangre entera y de capa leucoplaquetaria se dispusieron en capas sobre
gradientes densidad Ficoll-Paque, y las clulas
mononucleares fueron aisladas y posteriormente
procesadas para la inmunotincin previamente
descrita. Los anticuerpos primarios fueron una
fosfatasa alcalina anti-sea monoclonal (B4-78

hibridoma) o un anticuerpo policlonal de cabra de

osteocalcina anti-IgE humana. Los anticuerpos
isotpicos de control fueron usados a la misma
concentracin como de los anticuerpos primarios.
Un anticuerpo anti-CD15, un marcador especifico
de granulocito, excluido de contaminacin de
clulas asiladas con linajes de granulocitos.
Despus de la incubacin con anticuerpos
primarios, las clulas fueron coloreadas con
anticuerpos conjugados secundarios incluyendo
ficoeritrina conjugada de afinidad pura f(ab)2,
anticuerpos de burro anti-ratn IgG e isotiocianato
fluorescente conjugado de afinidad pura IgG
f(ab)2 fragmento de anticuerpos de burro anticabras.

Citrometria de flujo y anlisis de clulas

clasificadas activadas por fluorescencia
Usamos el procedimiento para la citrometria de
flujo que fue previamente descrito por nuestro
laboratorio. Para algunos estudios, las clulas
mononucleares coloreadas con el anticuerpo antiosteocalcina o fosfatasa alcalina anti-sea y el
anticuerpo secundario correspondiente fueron
tambin ordenados directamente por la citrometria
de flujo hacia el medio de crecimiento
complementado con un 15 por ciento de suero
fetal de ternera osteognica.
Cultivo primario de clulas osteoblasticas
Las clulas clasificadas fueron suspendidas en el
medio crecimiento y fueron sembradas a una
densidad de 1x105 clulas por pocillo en platillos
recubiertos en fibronectina. En los das 8 y 14
despus del sembro, los sobrenadantes que
contenan clulas no adherentes se centrifugaron,
el medio fue cambiado y los grnulos de las
clulas no adherentes fueron retornados a sus
pocillos originales. En el da 21 y luego una
semana despus, el medio fue cambiado al medio
de diferenciacin (con el 15 por ciento de los
suplementos estimulantes osteognicos, ms
suplementado con una concentracin final 3,5 mM

de -glicerofosfato, 10-8 dexametasona, y 50 g

por mililitro de cido ascrbico), cada vez,
preservando las clulas no adherentes. Luego de
tres semanas en el medio de diferenciacin, las
clulas fueron arregladas y coloreadas con
coloracin von Kossas para detectar ndulos
calcificados.
Anlisis de extraccin del AND y reaccin
reversa de la cadena polimerasa-transcriptasa
en tiempo real
El total de ARN extrado de las clulas colectadas
mediante la clasificacin de clulas activadas por
fluorescencia con el Absolutely RNA Microprep kit.
Una plantilla de ADN complementario fue
construida con el uso de la transcriptasa AMV
reversa, primer p(dN)6, inhibidor de RNasa,
deoxinucleosido trifosfato, y oligodT. Los anlisis
PCR fueron realizados en el sistema de deteccin
iCycler iQ/Real-Time PCR con un 2X iQ SYBR
Green Supermix. La expresin del gen fue
normalizada a gliceraldehido-3-fostato
deshidrogenasa.
Prueba de formacin de hueso in vivo
Las clulas sanguneas perifricas positivas o
negativas a la osteocalcina, que haban sido
clasificadas por el ordenamiento de clulas
activadas por fluorescencia, as como las clulas
mononucleares perifricas no clasificadas, fueron
suspendidas en 1ml de alfa-dulbecco y mesclados
con 40 mg de hidroxiapatita y polvo de fosfato
triclcico (en un radio de 20:80; tamao de
partcula, 01 a 0.5 mm). Se form una matriz
secundaria al mezclar 15 l de fibringeno de
ratn (3.2 mg por mililitro en buffer fosfato salino)
y 15 l de trombina de ratn (25 U por mililitro en
cloruro de calcio al 2 por ciento) para formar un
gel fibroso slido. Los trasplantes fueron
realizados en bolsillos subcutneos en un ratn
inmunocomprometido de ocho semanas. Despus
de las ocho semanas, nos fijamos en las
radiografas de los pellets, y luego los pellets
fueron recubiertos, puestos en etanol al 70 por
ciento, y analizados con el uso de la tomografa
computarizada cuantitativa.
Histologa
Los pellets fueron deshidratados con etanol al 95
por ciento por un da y luego con etanol al 100 por

ciento por cinco das antes de que fueran

inmersos en glicol metil crilato de metilo por cuatro
das ms e incrustados por la polimerizacin
controlada. Las muestras fueron cortadas en
secciones de 5 m y coloreadas con colorante de
Goldner.
Anlisis estadstico
Todos los datos son presentados en medias
(promedios). Las comparaciones entre los sujetos
adultos y adolescentes fueron realizadas con el
uso de pruebas T no pareadas. Se us el
coeficiente de correlacin de Spearman para
relacionar las mediciones bioqumicas y
hormonales en suero con el porcentaje de clulas
positivas para la osteocalcina o fosfatasa alcalina
sea. Un valor P menor a 0.05 fue considerado
significativo, y todos los valores P fueron de doble
lado.
RESULTADOS
La tabla 1 muestra los datos bioqumicos y
hormonales de los sujetos de estudio. Debido al
dramtico ascenso de la formacin de huesos
durante el desarrollo puberal, los varones
adolescentes haban aumentado
significativamente los ndices de formacin de
hueso, as como el aumento de los niveles sricos
de IGF-I y protena 3 IGF-B, reflejando el aumento
de secrecin de las hormonas de crecimiento. Los
niveles de testosterona fueron similares en los dos
grupos, mientras que los niveles de estriol fue
menor en adolescentes que en los adultos.

Como se muestra en la figura 1, las clulas

positivas para la osteocalcina, pero no las clulas
positivas para la fosfatasa alcalina sea, fueron
ms de cinco veces mayor en la circulacin de los
adolescentes que en los de los adultos
(porcentaje, 5.13 vs. 0.93). Por otra parte, en los
dos grupos de sujetos combinados, el porcentaje
de clulas positivas para la osteocalcina,
correlacion significativamente con los niveles de
osteocalcina y fosfatasa alcalina sea (r=0.72 y
r=0.77, respectivamente; P<0.001 para ambos). El
porcentaje de clulas positivas para la
osteocalcina fue tambin positivamente
correlacionado con los niveles de IGF-I y protena
3 IGF-B (r=0.74, P<0.001, y r=0.61, P<0.01,
respectivamente). A pesar que los niveles de
testosterona no correlacion con el porcentaje de
las clulas positivas para la osteocalcina (r=-0.12,
P=0.62), hubo una sugerencia de una asociacin
inversa entre estas clulas y los niveles de
estradiol (r=-0.40, P=0.09). Las asociaciones no
significativas se observaron entre los marcadores
de recambio seo y el porcentaje de clulas
positivas para la fosfatasa alcalina sea, o entre
las variables hormonales y el porcentaje de
clulas positivas para la fosfatasa alcalina sea
(datos no mostrados).
Adems de los aumentos en la formacin de
hueso durante el estirn de la adolescencia, hay
tambin aumentos significativos despus de una
fractura. Un sujeto adulto en este estudio tuvo una
fractura distal severa del antebrazo seis semanas
despus de que sus datos fuesen colectados por
primera vez.