UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE TECNOLOGIA MDICA - LABORATORIO

CURSO

BIOQUIMICA

TEMA

DETERMINACION DE LA UREA

DOCENTE

ARIAS RAMIREZ NGELA

CICLO

III

ALUMNO

GONZA
SARMIENTO MORALES LUIS

Lima-Per
2016
UNA EUCARIOTA SIN ORGANELA MITOCONDRIAL

En
palabras

pocas

Karnkowska et al.
Revertir
el
paradigma que las
eucariotas
debe
tener
las
mitocondrias.
Su
investigacin de la
genmica
microbiana
anaerobica
eucariota

Monocercomonoides sp. revela una falta total de orgnela mitocondrial y

funciones, incluyendo la sntesis de grupos Fe-S, que se lleva a cabo en
el citosol por una va bacteriana adquirida lateralmente.

Destaca

Monocercomonoides sp. es un microorganismo eucariotico sin

mitocondria
La ausencia completa de la mitocondria es una prdida
secundaria, no una caracterstica ancestral
El sendero ISC mitocondrial esencial fue sustituido por un sistema
de SUF bacteriana.

Una eucariota sin una orgnela mitocondrial

La presencia de mitocondrias y orgnelas relacionados en cada estudi
eucariota apoya la opinin de que las mitocondrias son componentes
celulares esenciales. Aqu presentamos la secuencia del genoma de un
eucariota microbiana, la oxymonada
Monocercomonoides sp., que
revel que este organismo carece de toda caracterstica protenas
mitocondriales. Fundamentalmente, el hierro-azufre mitocondrial
conjunto grupos externos, pensado para ser conservados en casi todas
las clulas eucariticas, ha sido sustituido por un sistema de
movilizacin de azufre citoslico (SUF) adquirido por la transferencia
lateral de genes de bacterias. En el contexto de eucariotas Filogenia,
nuestros datos sugieren que no es primitiva la Monocercomonoides
amitocondrial pero ha perdido la mitocondria secundaria. Este es el
primer ejemplo de un eucariota carente de cualquier forma de
mitocondria, demostrando que este orgnela no es absolutamente
indispensable para la viabilidad de una clula eucariota.
INTRODUCCIN
Las mitocondrias son organelas que surgi a travs de la integracin
endosimbiotica un proteobacterial proto-eucariota endosimbiontico en
la clula husped. Durante el curso de la evolucin eucariota, el genoma
y proteoma del compartimiento mitocondrial se ha modificado
considerablemente, y se ha ganado muchas funciones, perdidas o
reubicadas. En casos extremos, los derivados de las mitocondrias de
protistas anaerobicas se han modificado que haban sido ignorados o no
reconocidos como homlogas de la mitocondria. De hecho, en el decenio
de 1980, la hiptesis Arquezoo propuso que algunos microbios
eucariotas primitiva carecen de mitocondrias, peroxisomas apilados,
aparato de Golgi, intrones spliceosomales, y reproduccin sexual. Sin
embargo, a lo largo de la siguiente dcada, orgnelas con doble
membrana fueron identificados en todos los investigaciones de Arquezoo
putativa.

El ltimo clavo en el atad de la hiptesis Arquezoo fue la demostracin

de que estos orgnelas contienen algn marcador de protenas
mitocondrial, tales como aquellos implicados en el grupo de hierroazufre (ISC) grupos Fe-S Sistema de Biognesis, translocasas, maturasas
y/o chaperonas moleculares conocidas para facilitar la importacin de
protenas en la mitocondria. En la actualidad est ampliamente
aceptados que las mitocondrias o organelas mitocondriales relacionados
(OPF) compartimentos son esenciales en todas las clulas eucariotas y
que la endosimbiosis mitocondrial tuvo lugar antes de que la radiacin
de todos las eucariotas existentes.
Metamonada, originalmente parte de la Arquezoo, ahora se clasifican
como uno de los principales clados de las clulas eucariotas ''supergrupo'' Excavado y estn compuestos de eucariotas microaerofilias
unicelulares o anaerbicas que son a menudo parsitos o simbiontes
especializados. Detallados estudios de biologa molecular y celular,
incluida la secuenciacin del genoma, han sido realizados nicamente
por tres especies parasitarias de dos linajes metamonad - Giardia
intestinalis y Spiro nucleussalmonicida (Fornicata) y Trichomonas
vaginalis (Parabasalia), que han proporcionado informacin importante
acerca de las funciones de sus OPF. El tercer linaje de metamonadas,
Preaxostyla, contiene el parafiletico basal de vida libre y los derivados
endobioticos trimastigidas oxymonadas. La presencia de homlogos
mitocondrial ha sido demostrado convincentemente en Paratrimastix
(anteriormente Trimastix) piriformes, aunque las funciones bioqumicas
de estos orgnelas son en gran parte desconocidos. Endobioticos
oxymonadas pertenecen al menos estudiadas de la ex Arquezoo. Aqu
presentamos el primer anlisis de la secuencia completa del genoma de
un Monocercomonoides oxymonadas, sp. PA203. Encontramos que, a
pesar de que este organismo es una clula eucariota estndar en otros
aspectos, carece por completo de cualquier rastro de una mitocondria.
RESULTADOS Y DISCUSIN
Caractersticas del genoma
Usando el 454 todo la secuencia metodolgica del genoma rifle, hemos
generado un proyecto de la secuencia del genoma de la oxymonada
Monocercomonoides sp. PA203, reunidos en 2.095 matrices a ~353
Cobertura (vanse los procedimientos experimentales). El tamao
estimado del genoma (~75 Mb) y el nmero de genes codificadores de
protenas que predijo (16,629) es intermedio entre lo que se encuentra

en diplomonads y T. vaginalis (Tabla 1). Casi el 67% de los genes

codificantes de protenas predicho contienen intrones (~1.9
intronspergenes en promedio; Tabla 1).El conjunto contiene genes que
codifican tRNAs para todos los 20 aminocidos, ADN ribosomal y ~50
unidades fueron identificadas en la pequea contigs fuera de la parte
principal de la Asamblea (Ver procedimientos experimentales
complementarios). Para estimar la exhaustividad de la secuencia del
genoma del transcriptoma, realizamos el mapeo, en el cual 96,9% de
transcripciones correlacionado con el genoma (Ver procedimientos
experimentales complementarios), y comprobar la representacin del
ncleo de los genes eucariticas. Utilizando el enfoque de mapeo de
genes eucariticas Bsico (CEGMA), hemos recuperado el 63,3% del
ncleo de los genes eucariticas, una mayor fraccin que en el genoma
de G. intestinalis (46,6%). Sin embargo, cuando se excluyeron los genes
que codifican protenas mitocondriales de la CEGMA conjunto de datos y
utilizar manualmente Monocercomonoides sp modelos gen curada, el
porcentaje de genes recuperados aument al 90% (Tabla S1). Por otro
conjunto de 163 conservan los genes eucariticas filogenomico utilizado
para analizar el porcentaje de genes recuperadas super el 95% (Tabla
S2). Como la ltima medida exhaustiva, hemos identificado 77 de 78
familias conservados del citosol protenas ribosomal eucariotas (Tabla
S3), con la nica excepcin de L41e, que es muy corto, difcil de
detectar, y no se ha identificado en otros genomas Metamonada.
Anlisis
filogenomico
(Figura
1)
confirm
la
relacin
de
Monocercomonoides sp. P. piriformes y otros Metamonadas y demostr
que el linaje Monocercomonoides se forma mucho ms cortos en
relacin con la rama y parabasalidos diplomonados. Todas estas
acciones sugieren que los Monocercomonoides sp. reunidos es casi
completa de la secuencia del genoma y sus protenas son codificadas,
en promedio, menos que los divergentes de G. intestinalis y T. vaginalis.
Con la primera secuencia en mano de genoma oxymonadas, hemos
centrado nuestra atencin en uno de los aspectos ms desconcertantes
de su biologa de la naturaleza esquiva de su mitocondria.
Ausencia de protenas mitocondriales
Sin genes que normalmente estn codificados en el genoma
mitocondrial (mtDNA) de otros eucariotas fueron encontrados entre las
matrices montados, sugiriendo que, como otros, Monocercomonoides
metamonadas sp. carece de mtDNA. A continuacin, hemos buscado

homlogos de protenas codificadas por el genoma nuclear

habitualmente asociadas con la mitocondria o MROs en otros eucariotas.
El ncleo de la protena homloga de la maquinaria de importacin est
considerada como fuerte evidencia para el origen comn de todas las
mitocondrias. Como tal, la presencia de componentes de la translocasas
de la membrana externa (TOM) y la membrana interna (TIM), la
clasificacin y la maquinaria de montaje (SAM) y complejos moleculares
mitocondriales (chaperonas Hsp70 y CPN60) en hidrogenosomas,
mitosomas y otros MROs demuestra que estos orgnelas estn
relacionadas con las mitocondrias. Si bien pudimos identificar homologos
del citosol en el Monocercomonoides chaperonas sp. secuencia
genmica, no pudimos identificar homologos de cualquier componente
de la maquinaria de importacin mitocondrial (Figura 2A; los
procedimientos experimentales; tablas de S3 y S4).
Todas las OPF, con la excepcin de G. intestinalis mitosome, son
conocidos para la exportacin o importacin de ATP y otros metabolitos
normalmente mediante transportadores de la familia portador
mitocondrial (MCF) o, en mitosomas del microsporidium Encephalitozoon
cuniculi, por el de tipo bacteriano (NTT) transportadores de nucletidos.
No hemos identificado en el genoma Monocercomonoides sp. cualquier
homologo conocido de genes que codifica protenas de transporte
metabolito mitocondrial (Figura 2A; el Cuadro S4).
Grupos Fe-S son cofactores biolgicos esenciales asociados con muchas
protenas diferentes y, por lo tanto, son sintetizados de novo en cada
organismo a travs del rbol de la vida. En Eucariotas, esto se realiza
principalmente por el sistema de ensamblaje de ISC mitocondrial y el
conjunto de hierro-azufre citoslico (CIA) Sistema. Anlisis del genoma
Monocercomonoides sp. revel la presencia de un sistema de la CIA pero
una falta completa de los componentes del sistema de ISC (Figura 2A; la
tabla S3; los procedimientos experimentales).
No hemos podido identificar cualquiera de las dos enzimas involucradas
en la sntesis de un fosfolpido cardiolipina, especficos para la
transduccin de energa de las membranas. La mayora de las eucariotas
sintetizan cardiolipinas, y el proceso se localiza en las mitocondrias, pero
una
falta
completa
de
cardiolipina
ha
sido
demostrado
experimentalmentepara G. intestinalis, T. vaginalis y E. cuniculi. Adems,
no pudimos identificar cualquier componente del retculo endoplsmico

(RE) Encuentro de estructuras de la mitocondrias (ERMES; en la

Figura2A)
Slo se identificaron dos ortlogos del conjunto de protenas se supona
localizar a la mitocondria del compartimiento relacionado estrechamente
relacionado P. piriformes: aspartato / ornitina carbamoil transferasa
familia de protenas y de nucletidos de piridina transhidrogenasa. Ni la
protena tiene exclusivamente una localizacin mitocondrial en
eucariotas, y el Monocercomonoides sp. ortlogos no contienen
secuencias mitocondriales se supona la focalizacin.
Para complementar las bsquedas de homologa selectivas basadas
tambin realizamos una bsqueda extensa para homologas de protenas
putativas mitocondriales conocidas mediante una canalizacin
Mitominer basada en la base de datos, el cual fue enriquecido con
protenas
mitocondriales
identificadas
de
diversos
eucariotas
anaerobicas con procedimientos experimentales (OPF). La bsqueda se
recuper 76 Monocercomonoides sp. Las protenas como candidatos
para las funciones en un supuesto mitocondria (Figura 2B; Tabla S5).
Anlogamente aG. intestinalis, T. vaginalis y E. histolytica, utilizados
como controles, los candidatos seleccionados fueron principalmente
protenas que son obviamenteno mitocondrial (por ejemplo, las histonas)
o para el que la anotacines demasiado general (p. ej. Dominio kinasa
contienen las protenas''), lo que indica que la especificidad de la
canalizacin en organismos con mitocondria divergentes es baja. Sin
embargo, a diferencia de todos los demsorganismos de control, en el
que la bsqueda siempre recuperan al menos unas pocas protenas
distintivo mitocondrial, el conjunto de 76 Monocercomonoides sp.
candidatos no contienen tales protenas. Solamente 11 de los candidatos
Monocercomonoides caen en la categora GO ''metabolizacin', pero que
no reune una evidente va metablica. En resumen, este enfoque (Tabla
S5) no revelaron
Figura 1. Los eucariotas Filogenia enraizadas inferida a partir de un 163protena Supermatriz: El rbol que aparece fue inferida utilizando PhyloBayes (CAT)
del modelo de Poisson de sustitucin. Una mxima verosimilitud (ML) rbol inferido a
partir de la misma mediante RAxML supermatriz (no se muestra) era muy similar a la
del rbol PhyloBayes topolgico, con las diferencias en el rea que comprende mal
resueltas, Cryptophyta Chloroplastida Glaucophyta, y Haptophyta, y en la posicin de
Metamonada, hermana en ML rbol ubicado (con fuerte apoyo bootstrap) Discoba. Los
valores mostrados son de asistencia de la sucursal probabilidades posterior (>0,95)
desde el anlisis PhyloBayes y los valores bootstrap (>50%) a partir de los anlisis de

ML. Se muestran tres ramas acort el porcentaje indicado de su longitud real para que
quepan en la pgina. Vase tambin la tabla S2.

ninguna serie creble de protena mitocondrial en Monocercomonoides

sp. Como una alternativa a las bsquedas de homologa, tambin hemos
intentado identificar protenas mitocondriales buscando varios tipos de
secuencias de la firma. La matriz de protenas de la mitocondria y las
MROs se espera para contener conservado la N-terminal enfocar seales
necesarias para el objetivo de la importacin en MROs. Se ha realizado

la prediccin in silico ("hecho por computadora o va simulacin computacional") de

focalizacin mitocondrial seales en la predicha Monocercomonoides sp.
proteoma e identificaron 107 protenas candidatas (Figura 2A; los
procedimientos experimentales; Tabla S6A). La presencia de una seal
de focalizacin predicho por s mismo no prueba la focalizacin, como
esas secuencias de aminocidos puede aparecen tambin al azar. La
anotacin funcional revel que la mayora de las protenas recuperadas
por la cada de esta bsqueda en Kyoto Encyclopedia of Genes and
Genomes (KEGG) categora ''informacin gentica procesamiento. dada
la ausencia de un genoma mitocondrial, o maquinaria de traduccin de
organelas, es improbable que estas protenas funcionan en un MRO. Slo
ocho candidatos fueron asignados a la categora de KEGG
''metabolizacin',y forman parte de diferentes rutas metablicas.Por
ltimo, slo tres protenas fueron pronosticados para tener una seal de
focalizacin mitocondrial y homologa con una protena (Mitominer
hidrolasa como familia protena monos_10795, citoslico 1 TCP/CPN60
chaperonina monos_13132 familia de protenas, y ribonucleasa Z
MONOS_6181). Esto tambin sugiere que ambos ductos no se pudo
recuperar conjuntos especficos de protenas mitocondriales, sino que
slo se detecta baja especificidad ''ruido''.
La membrana mitocondrial externa acomodan dos clases especiales de
protenas, -barril y cola-anclada (TA), protenas, que estn desprovistos
de la N-terminal de focalizacin y en su lugar usar seales especficas
seales C-terminal. Hemos identificado 32 candidatos para las protenas
en el TA predijo proteoma, varios de los cuales parecan ser redirigidos
de protenas. Ninguna de ellas tena la caracterstica caractersticas de
protenas destinadas a la membrana externa mitocondrial (Figura 2A; los
procedimientos experimentales; Tabla S6B). Tambin hemos fallado para
identificar los candidatos plausibles para -barril protenas de membrana
externa (BOMPs) (Figura 2A; los procedimientos experimentales).
En resumen, nuestro anlisis amplio del genoma Monocercomonoides
sp. sobre la base de bsquedas de homologa y bsquedas especficas
para N-terminal y C-terminal especificas fallaron al recuperar las
protenas normalmente asociados con las MROs, incluyendo metabolitos
translocasas mitocondrial, transportistas y la ISC para el sistema Fe-S,
sntesis de grupos, ERMES cardiolipinas y enzimas responsables de la
sntesis. A fin de comprobar que nuestra incapacidad para encontrar
cualquier protenas mitocondriales fiables no es

Figura 2. Estrategias de bsqueda para las protenas relacionados

funcionalmente con la mitocondria en Monocercomonoides (A) buscar
estrategias para protenas mitocondriales y de localizacin de protenas firmas en una
clula eucariota cannica (se proporcionan detalles adicionales de los procedimientos
experimentales): (1) la membrana externa mitocondrial (MOM) orientadas cola-anclada
(TA), protenas (Tabla S6B), (2) las protenas con un seal de focalizacin mitocondrial
(Tabla S6A), (3), -barril protenas MOM, (4) 41 distintivos protenas mitocondriales
(Tabla S4), los componentes de Tom y TIM translocasas, cpn60, ERMES, ISC va
componentes complejos, cardiolipina sintasa (CL). (B) para recuperar la canalizacin
homologas semiautomtica de las protenas mitocondriales de proteomas. Se utiliz
una base de datos personalizada para la bsqueda de homologa de protenas
mitocondriales en la prediccin de Proteomas Monocercomonoides sp., Entamoeba

histolytica, Giardia intestinalis, Trichomonas vaginalis, Blastocystis sp. subtipo 7, Tabla

y Saccharomyces cerevisiae (S5). Vase tambin tablas S4, S5 y S6.

causada
por
la
posible
divergencia
sin
precedentes
de
protenasMonocercomonoides sp. o un fracaso de nuestros mtodos,
hemos buscado protenas caractersticas de otro sistema celular, hasta
ahora no se han observado en Monocercomonoides sp. El complejo de
Golgi. En este caso, mediante bsquedas basadas en homologa, hemos
detectado numerosas protenas asociadas al aparato de Golgi, incluidos
los componentes del COPI, AP-1, AP-3 y AP-4, COG, GARP, TRAPPI y
complejos incontables y Rab las GTpasas que regulan el transporte hacia

y desde el aparato de Golgi (Tabla S3). Esto sugiere la presencia de Golgi

como compartimientos en oxymonadas, a pesar de la ausencia de un
aparato de Golgi citolgicamente discernible.La ausencia especfica de
protenas asociadas a la mitocondria en Monocercomonoides sp. implica
la ausencia de una legtima compartimiento mitocondrial. Si es as,
entonces cmo funciona la funcin CELDA Monocercomonoides sin este
orgnela?
Metabolismo energtico sin mitocondria
Para comparar el metabolismo de Monocercomonoides sp. con sujecin
protistas anaerobicas compartimentos mitocondriales, realizamos la
anotacin manual de protenas del ncleo de vas del metabolismo
energtico normalmente asociadas con la presencia y la funcin de un
MRO. Como con muchos otros organismos en segundo lugar redujo la
mitocondria, la Monocercomonoides sp. genoma no codifica cualquier
enzimas para la generacin de energa aerbica (por ejemplo, TCA ciclo
o cadena de transporte de electrones protenas). Hicimos identificar un
conjunto completo de enzimas mediante gliclisis, incluida la alternativa
de enzimas para la glucolisis anaerobica, as como la fermentacin
enzimas anaerbica piruvato: ferredoxin oxidorreductasa (PFOR) y
hidrogenasas FeFe-Tabla (S3). [FeFe] hidrogenasa maturasas estaban
ausentes, que no es sin precedentes como tambin estn ausentes de
G. intestinalis y E. histolytica, parsitos anaerbicos que son capaces de
citosol de produccin de H2. Ni (PFOR) ni (FeFe) hydrogenasa ha
pronosticado una focalizacin mitocondrial secuencia y expresin
heterloga de T. vaginalis sugiere una localizacin citoslico de (PFOR)
(Figura S1).En resumen, Monocercomonoides sp. en el metabolismo de
la glucosa, parece producir ATP a travs del nivel de pasos de sustrato la
fosforilacin en un largo camino, la gluclisis y la reduccin de cofactores son re-oxidado por fermentacin,en ltima instancia, producir
acetato y etanol, o por [FeFe] hidrogenasa produciendo gas hidrgeno.
La situacin en Monocercomonoides sp. es prcticamente idntica a la
de G. intestinalis y E. histolytica, que de forma independiente han
reducido sus mitocondrias para mitosomas y toda la produccin de ATP
se produce en el citosol. Adems extendi la gluclisis,
Monocercomonoides sp. contiene un conjunto completo de tres genes
que codifican para enzimas implicadas en la ruta deiminasa arginina deiminasa arginina, ornitina carbamoil transferasa deiminasa y
carbamato quinasa. Esta ruta tambin puede ser utilizada para la
produccin de ATP por degradacin arginina como en T. vaginalis y G.

intestinalis. En G. intestinalis, esta va produce ocho veces ms ATP que

el metabolismo del azcar.
Fe-S Conjunto clster sin mitocondria
Cada clula eucariota contiene una maquinaria de la CIA, que asiste a
las etapas finales de la Asamblea de grupos Fe-S en protenas eucariotas
funcionando en el citosol y en el ncleo. Ocho protenas mostraron ser
involucrados en el sendero de la CIA en la levadura y los seres humanos:
Cfd1, NUBP1 (PNI35), NARFL (nar1), CIAO1 (CIA1), Dre2, Tah18, Cia2, y
MMS19. Cuatro de ellos (por ejemplo, PNI35 Nar1, Cia1 y Cia2) se
conservan entre los eucariotas y tambin presente en el genoma
Monocercomonoides sp. Tabla (S3). No detectamos Cfd1 y MMS19, que
faltanen muchos otros eucariotas, y Dre2 y Tah18, en e lque faltan de los
protistas anaerbicas que contengan OPF (incluyendo la E. histolytica,
Mastigamo ebabalamuthi, T. vaginalis, G. intestinalis y Blastocystis sp.).
A pesar de la presencia de la va ISC, comnmente se sugiere que las
mitocondrias y las organelas son esenciales para las clulas eucariotas
porque el sistema ISC mitocondrial juega un papel crtico en la fase
inicial de la formacin del citosol grupos Fe-S. Aunque el sistema ISC es
casi universalmente conservada en va eucariotas y parece ser la
caracterstica comn de las mitocondrias y las organelas, los genes que
codifican las protenas de la mitocondria sendero ISC no han sido
detectadas en el genoma Monocercomonoides sp. La sustitucin
funcional del sistema ISC ha sido reportada por slo dos linajes,
Pygsuiabiforma (Breviatea) y Archamoebae. Una movilizacin de azufre
metanoarquea (SUF) o bien un sistema de fijacin de nitrgeno
bacteriano (NIF) Aparentemente ha sustituido el sistema de ISC en la P.
biforma y los linajes Archamoebae, respectivamente. Existen datos
contradictorios sobre la localizacin de la NSI sistema en E. histolytica;
sin embargo, el inM. balamuthi sistema, el NIF se localiza en el citosol y
el MRO.
El principal problema sigue siendo: Cmo Monocercomonoides sp.
formar grupos Fe-S? Inesperadamente, hemos identificado los genes
que codifican las cuatro subunidades del sistema: SufB SUF, SufC, y
fusionados y SufSSufU Tabla (S3). SufS es un ''2'' de componente de
sulfurasa cistenasu actividad podra ser mejorada por SufE o SufU. En
Monocercomonoides sp., se fusiona con SufSSufU, que es una
caracterstica nica. SufCSufB y pueden formar un complejo de matrices
en procariotas, y SufB complejo 2C2 es capaz de unirse y transferir 4FE-

4S de grupos a un destinatario apoprotena. Todo sistema de SUF

identificado protenas aparentemente conservan todos los importantes
sitios catalticos (Figura S2) y puede realizar de grupos Fe-S biognesis
novo por s solos o conjuntamente con la maquinaria de la CIA. El
sistema SUF para sntesis de grupos Fe S se

Figura 3. La expresin heterloga de Monocercomonoides sp. Sistema SUF

Protenas y filogenia de SufB SufC concatenados, y SufS Homologas (A) la
expresin heterloga de Monocercomonoides sp. SufC SufB y protenas de Trichomonas
vaginalis. Monocercomonoides sp. protenas con una C-terminal de la etiqueta HA
fueron expresados en T. vaginalis y visualizados por un anticuerpo anti-HA (verde). La
seal del anticuerpo anti-HA no co-localiza con hidrogenosomas teidos con un
anticuerpo anti-enzima mlico (rojo). El ncleo teido con DAPI (azul). Barra de escala,
de 10 mm. (B) la expresin heterloga de Monocercomonoides sp. SufC protena en
Saccharomyces cerevisiae. Monocercomonoides sp. protenas etiquetadas con GFP se
expresaron en S. cerevisiae (verde). La GFP seal no co-localiza con la levadura
mitocondrias manchadas por Mitotracker (rojo). Barra de escala, de 10 mm. (C) del
rbol enraizado ML SufB SufC concatenados, y SufS secuencias. Apoyo Bootstrap
valores superiores a 50 y posterior probabilidades superiores a 0.75 se muestran.

Monocercomonoides sp. y Paratrimastix piriformes se muestran en rojo, eukaryotic

plstidos y cianobacterias en verde, Blastocystis sp. y Pygsuia biforma en Orange,
bacterias y arquea en gris y en azul. Consulte tambin las figuras S1-S3.

Figura 4. Evolucin reductiva de mitocondrias en transicin de Metamonadas

Hacia un estilo de vida anaerbico se produjo en un ancestro comn de metamonadas

y fue seguido por una reduccin de las mitocondrias a MROs, acompaado por la
prdida de cristae y genoma, y la transicin al metabolismo anaerbico. La ISC via de
grupos fe-S sntesis estuvo presente en un ancestro comn metamonada. Otra
reduccin a un mitosoma tuvo lugar en linaje Giardia intestinalis. Proponemos que en
el ancestro comn de Paratrimastix piriformes y Monocercomonoides, un sistema SUF
adquiridas a travs de la LGT desde la bacteria sustituye el sistema ISC-localizada de
MRO. Posteriormente, las MROs se perdi completamente en el linaje que llev a
Monocercomonoides sp. Localizacin de la va suf en P. piriformes es desconocida.

encuentra en plstidos ,bacterias y arqueas y tambin se ha encontrado

en dos eucariotas microbianos P. biforma y Blastocystis sp.
La presencia de intrones spliceosomalesen la putativa y de
Monocercomonoides SufSU SufC confirma que estas protenas no son
procariotas contaminacin. Adems, hibridacin in situ fluorescente
(FISH) con sondas gen sufC sufB y demostrado su presencia en el
Monocercomonoides sp. ncleo (Figura S3). Importantes, homologos de
estas protenas fueron detectados en la P. piriformes genoma
secuenciado, el ms cercano a Monocercomonoides relativa. Los
componentes de ambos sistemas SUF Monocercomonoides sp. y P.
piriformes no contienen seales de focalizacin mitocondrial reconocible,
y
nuestros
experimentos
con
la
expresin
heterloga
de
Monocercomonoides sp. SufC SufB y protenas en T. vaginalis (Figura 3A)
y SufC protena en levaduras (Figura 3b) apoyar una localizacin
citoslico. Los anlisis filogenticos indican que este sistema SUF fue
adquirida por un antepasado Monocercomonoides y Paratrimastix por
transferencia gentica lateral (LGT) de bacterias de forma independiente
del resto de SUF-conteniendo clulas eucariotas (Figura 3C). Proponemos
que la adquisicin de un sistema SUF citoslico hizo el ancestral sistema
de ISC en la mitocondria prescindible, que condujo a la prdida, y en el
linaje Monocercomonoides, a la prdida completa de la MROs (Figura 4).
Conclusiones
Las mitocondrias y las organelas son actualmente considerada como
componentes indispensables de las clulas eucariotas. La secuencia del
genoma de Monocercomonoides sp. inform aqu sugiere que este no es
el caso. A pesar de extensas bsquedas, ningn marcador de protenas
mitocondrial como la protena de membrana translocasas y
transportadores de metabolito fueron identificados. Fundamentalmente,
la mitocondria ISC especfico camino de grupos fe-S Biognesis est
ausente y aparentemente fue reemplazado por un sistema que SUF
funciones bacterianas en el citosol. Por otro lado, los genes que codifican

para otras caractersticas crean estar ausente de estas diferentes

clulas eucariotas, es decir, el cuerpo de Golgi, eran fcilmente
identificables. El genoma tambin contiene genes para trayectos
citoslico esenciales del metabolismo energtico, aunque s observamos
ejemplos de racionalizacin metablicos caractersticos de otros
anaerbicas o microaerfilos eucariontes.
Reduccin de las mitocondrias es conocido desde diversos linajes
eucariticos adaptado al estilo de vida anaerbica. En Mitosomas
Giardia, Entamoeba dispar, y microsporidios representan los casos ms
extremos de reduccin mitocondrial conocida hasta la fecha y, sin
embargo, que todava contienen protena mitocondrial translocasas
reconocibles y generalmente un sistema de ISC. La ausencia especfica
de todas estas protenas en el genoma mitocondrial de
Monocercomonoides sp. indica que esta eucariota ha dispensado con el
compartimiento mitocondrial completamente. En principio,no podemos
excluir la
posibilidad de que una mitocondria
exista en
Monocercomonoides sp., cuya composicin proteica hasido alterado por
completo. Sin embargo, esa hipottica organela no poda ser reconocida
como una mitocondria homloga por cualquier medio disponible. Sin
ningn tipo de pruebas positivas para el ltimo escenario, sugerimos
que la completa ausencia de marcadores mitocondriales y vas apunta a
la ausencia de buena fe de las mitocondrias. Porque todas las
oxymonadas conocidos son simbiontes animales, y homologas
mitocondriales estn presentes en el cierre de vida libre linaje
Paratrimastix
hermana,
la
ausencia
de
la
mitocondria
en
Monocercomonoides sp. deben ser secundarias. Hipotetizamos que la
adquisicin del sistema SUF precedi a la prdida delsistema ISC
mitocondrial en el ancestro comn de Preaxostyla y permita la prdida
completa de las mitocondrias en Monocercomonoides sp. estirpe, la
primera conocida verdaderamente secundaria eucariota amitocondriaca.
PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES
Secuenciacin de genoma y transcriptoma
Todos los experimentos fueron realizados en el Monocercomonoides sp.
PA203 cepa. La cultura (2 l con una densidad celular de
aproximadamente 4 3 105 clulas/ mL) fue filtrada para eliminar la
mayora de las bacterias antes de aislamiento de ADN (cultivo de
filtracin y detalles adicionales de los procedimientos experimentales).
El ADN fue aislado con sangre y tejido DNeasy Kit (QIAGEN). Adn

genmico total fue secuenciado utilizando un secuenciador de Genoma

454 GS FLX con reactivos XL. Un total de siete ejecuciones se realizaron
de secuenciacin, incluidos cuatro escopeta se ejecuta en las bibliotecas
con el promedio de la longitud del fragmento de 500 a 800 y tres
carreras de 3 kb emparejado a finales de biblioteca. Dos secuencias de
RNA (RNA-Seq) se realizaron experimentos utilizando 454 Illumina y
plataformas de secuenciacin. Los detalles de la secuencia son dados en
los procedimientos experimentales complementarios.
Los procedimientos
Ensamblador de Roche Newbler v.2.6 fue utilizado para generar una
secuencia de genoma ensamblado desde 454 solo y un par final de
lecturas. El montaje final se compona de 2.095 matrices que abarcan
casi 75 Mb del genoma. El N50 Tamao de matrices es de 71,4 KB.
Montaje del transcriptoma 454 datos se realiz por Newbler v.2.8 con
parmetros predeterminados y Illumina transcriptmica generado datos
fueron ensambladas con Trinidad (detalles adicionales de los
procedimientos experimentales). El CEGMA fue utilizado para estimar el
nmero de genes eucariticas conservados en el genoma
Monocercomonoides sp. Tabla general (S1) y la presencia de citosol
protenas eucariotas ribosomal como una medida adicional de
exhaustividad (Cuadro S3).
Anotacin de genomas y genes
Para la anotacin Estructural, Augustus v.2.7, pasa2 y EVM fueron
utilizados. Modelos de genes de particular inters fueron evaluados de
forma manual con la ayuda de RNA-Seq datos o considerando la
conservacin con homologas (detalles adicionales de los procedimientos
experimentales). Anotacin funcional fue asignado a los genes mediante
bsquedas por similitud deprotenas predijo usando BLASTP, contra la
base de datos de protenas no redundante NCBI y HMMER3 bsquedas
de dominio Pfam hits en la base de datos de familias de protenas.
Anotaciones adicionales se realiza utilizando el servidor de anotacin
automtica KEGG. Los archivos de anotacin se encuentran disponibles
en la pgina web http://www.protistologie.cz/hampllab/data.html.
TArn genes fueron pronosticados con tRNAscan-SE; secuencias de rDNA
no estaban presentes en el conjunto principal original, pero fueron
identificados en no contigs montado en matrices y aadido al conjunto
principal. La base de datos del genoma Monocercomonoides sp. fue

buscado
utilizando
el
algoritmo
TBLASTN
y
proteoma
Monocercomonoides base de datos y seis marcos de traduccin de la
secuencia genmica fueron registrados utilizando el algoritmo o BLASTP,
el perfil modelo ocultos de Markov (HMM) Mtodo de bsqueda desde el
HMMER phmmer3 paquetes. Utilizamos una amplia gama de consultas
descritas en los procedimientos experimentales complementarios.

Los anlisis filogenticos

Realizamos una serie de mxima probabilidad y anlisis filogentico
Bayesiana: (1) anlisis de filogenomica eucariotas basados en 163 genes
y 70 taxones; (2) anlisis filogenticos de genes que codifican para
enzimas va SUF; y (3) gen individual rboles en apoyo de anotacin
funcional de los genes (detalles adicionales de los procedimientos
experimentales).
Prediccin de localizacin subcelular
Para la prediccin de localizacin subcelular Monocercomonoides sp.
Proteoma se realiz utilizando TargetP v.1.1 y v.1.101 MitoProt II. TA
protenas fueron identificadas y analizados en funcin de la presencia de
un dominio transmembrana (TMD) de moderada hidrofobicidad,
flanqueada por residuos cargados positivamente (detalles adicionales de
los procedimientos experimentales). Se identificaron BOMPs, en base a
la presencia de una -seal de - C- terminal conservado, usando un
conducto descrito previamente.
Protena mitocondrial Bsqueda utilizando una base de datos
Mitominer-Based
Hemos preparado una base de datos personalizada de protenas
mitocondriales para buscar genes que codifican protenas con
localizacin mitocondrial putativa. La base de datos personalizada se
basa en el juego de referencia de la base de datos MitoMiner
conteniendo 12 mil 925 protenas de 11 eucariota proteomas
mitocondrial, el cual fue enriquecido por conocidos o previstos de MRO
protenas localizadas de E. histolytica, G. intestinalis, P. biforma, S.
salmonicida, T. vaginalis y P. pyriformis. Homologas de protenas a partir
de esta base de datos fueron registrados en la prediccin del proteoma
de Monocercomonoides sp. y en las previsiones de proteomas de
Blastocystis sp., E. histolytica, G. intestinalis, S. cerevisiae, y T.

vaginalis,que fueron utilizadas como control base de datos. Mientras

busca el control de base datos, las protenas del organismo buscado
fueron eliminadas de la base de datos personalizada. En el ltimo paso,
slo los candidatos eran mantenidos cuyo primer golpe en la base de
datos NCBI contiene una seal de focalizacin mitocondrial predecible
(score > 0,5 en TargetP v.1.1 y v.1.101 MitoProtII ) Se dan ms detalles
adicionales de los procedimientos experimentales.
FISH
Hemos realizado experimentos de FISH con sondas marcadas para
determinar si los genes de las protenas del sistema SUF residen
fsicamente en los Monocercomonoides sp. genoma o representar la
contaminacin bacteriana. Los detalles de la preparacin de las sondas
de etiquetado tendrn en los Procedimientos Experimentales
Suplementario. Un litro de Monocercomonoides sp. por cultura se filtr
para eliminar las bacterias , y las clulas se sedimentaron por
centrifugacin durante 10 min a 2000 g 3 a 4 C. con sondas FISH
marcadas con digoxigenina se llev a cabo de acuerdo con un
previamente procedimiento descrito omitiendo el procedimiento de la
colchicina. Los ncleos celulares y las sondas se desnaturalizaron bajo
un cubreobjetos en un solo paso en 50 ml de 50 % de formamida en 2 3
SSC a 70 C durante 5 min . Se observaron las preparaciones usando un
microscopio IX81 (Olympus ) equipado con una cmara IX2- UCB. Las
imgenes fueron procesadas utilizando el software Cell ( Olympus ) y
1.42q Image J .
La expresin de protenas
Trichomonas vaginalis

heterlogas

en

microscopa

El sistema de transfeccin T. vaginalis fue utilizado para evaluar la

localizacin subcelular de SufB, SufC y obtener PFOR protenas.
Monocercomonoides sp. cDNA de preparacin se realiza como se
describe para el transcriptoma de secuenciacin Procedimiento
experimental (suplementarios). Se construye con la etiqueta
hemaglutinina (HA) fusionados a 30 Fin de las secuencias codificadoras
de los genes estudiados fueron preparados y expresado en T. vaginalis,
un anaerobio Monocercomonoides protistas relacionados con sp. y
teniendo un hydrogenosoma (se proporcionan detalles adicionales de los
procedimientos experimentales). Monocercomonoides sp. protenas
expresadas en las clulas T. vaginalis fueron visualizados utilizando

tcnicas estndar (se proporcionan

procedimientos experimentales).

detalles

adicionales

de

los

Sistema de expresin de Saccharomyces cerevisiae heterlogo

Este sistema de expresin se utiliz para confirmar los resultados de la
T. vaginalis sistema de expresin para la protena SUFC. El
procedimiento fue anlogo al se describe en los detalles de los
procedimientos experimentales suplementarios.
NMEROS DE ACCESO
Los datos de secuencia del genoma leer (nmero de experimento),
SRX1470187 el 454 transcriptoma lee secuencia usando el 454
plataforma (experimento nmero SRX1453820), y el transcriptoma
Illumina leer secuenciados utilizando la plataforma Illumina (nmero de
experimento SRX1453675) han sido depositados a leer archivo de
secuencias NCBI bajo el nmero de SRA: SRP066769. El nmero de
acceso para el Monocercomonoides sp. PA203 genoma informar en este
documento es GenBank: LSRY00000000. la adhesin nmero para el
proyecto 454 transcriptoma informa en este documento es GenBank :
GEEG00000000 . El nmero de acceso para el proyecto transcriptoma
Illumina informa en este documento es GenBank: GEEL00000000. Las
versiones descritas en este documento son versiones LSRY01000000,
GEEG01000000, y GEEL01000000. Ms informaciones adicionales sobre
el anlisis del genoma se puede encontrar en http: //
www.protistologie.cz/hampllab/data.html.
INFORMACIN SUPLEMENTARIA
Informacin adicional incluye los procedimientos experimentales
Suplementarios, tres figuras, tablas y seis y se pueden encontrar con
este artculo en lnea en http://dx.doi.org/10.1016/j.cub.2016.03.053.