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INDICE
1-INTRODUCCIN, 2
1.1 Origen del queso, 2
1.2 Produccin y consumo nacional e internacional del queso, 3
1.3 Proceso de elaboracin del queso, 5
1.3.1 Preparacin de la leche, 6
1.3.2 Cuajado, 7
1.3.3 Corte de la cuajada, 7
1.3.4 Moldeado, 8
1.3.5 Prensado, 8
1.3.6 Salado, 9
1.3.7 Madurado, 9
1.3.8 Acabado, 10
1.4 Produccin de queso untable sin conservante (sorbato de potasio)
efectuada por Danone para el presente estudio, 10
1.5 Variedades de quesos, 13
1.6 Clasificacin de quesos, 14
1.7 El queso y la salud, 16
1.8 El queso como alimento nutritivo,16
1.8.1 Aporte de macronutrientes, 17
1.8.2 Aporte de micronutrientes, 18
1.9 El queso como alimento seguro, 19
1.10 Tecnologas combinadas de preservacin, 22
1.10.1 Efecto de la reduccin de la aw, 23
RESUMEN
En microbiologa predictiva los modelos matemticos son utilizados para
predecir el comportamiento de los microorganismos bajo diferentes condiciones.
Antes de ser utilizados en una situacin prctica, estos modelos matemticos
deben ser validados con el propsito de demostrar que las bacterias se comportan
de igual modo tanto en los alimentos reales como en los sistemas modelo que se
utilizaron para generar dichos modelos. En este trabajo se estudi el crecimiento
o la inactivacin de diferentes microorganismos ptogenos de relevancia en
queso untable (S.aureus; E. coli; S. Enteritidis y L. monocytogenes) bajo
diferentes condiciones microambientales (pH; temperatura; presencia de sorbato
de potasio; presencia de timol). Dichas respuestas fueron caracterizadas por los
modelos primarios de Gompertz y Gompertz modificado para muerte obteniendo
los parmetros caractersticos. Tambin se utiliz para la prediccin el programa
terciario de modelado de patgenos PMP. Los modelos fueron validados
estadsticamente y tambin por los estudios de reto microbiano en queso untable.
El modelo de Gompertz, utilizado para describir el crecimiento microbiano no
present limitaciones estadsticas. No ocurri lo mismo con el modelo de
Gompertz modificado para muerte, el cul sobreestim la cada global al final del
almacenamiento en muchas situaciones. El programa de simulacin modelado de
patgenos mostr debilidades al momento de predecir la conducta microbiana en
el queso untable debido seguramente a las limitaciones biolgicas imperantes en
el queso. Este estudio resalt la necesidad de validar los modelos matemticos en
un alimento real.
RECONOCIMIENTOS
A la Dra. Sandra Guerrero por el tiempo que me ha dedicado y por su excelente
direccin y dedicacin .
toda la capacitacin
que enriquece
RESULTADOS
Figura 1: Efecto de la temperatura de almacenamiento : 5C (-- ) y
15C ( -- ) en el desarrollo de S.aureus inoculado en caldo BHI (a) y en
queso untable (b); (I) desvo estndar. (PAG.59)
Figura 2: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivacin de S.aureus en queso untable almacenado a 5C, ( ) valores
experimentales; () prediccin (PAG.61)
Tabla 1: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable almacenado a 5 C. (PAG.61)
Figura 3 : Validacin interna del modelo propuesto para la inactivacin
de S.aureus en queso untable almacenado a 5C: a) Valores observados
vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . ( ) valores
experimentales; () prediccin. (PAG.62)
Figura 4 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivacin de S.aureus en queso untable almacenado a 15C, ( )
valores experimentales; () prediccin. (PAG.63)
Tabla 2 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable almacenado a 15 C. (PAG.64)
Figura 5: Validacin interna del modelo propuesto para la inactivacin
de S.aureus en queso untable almacenado a 15 C: a) Valores observados
vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . ( ) valores
experimentales; () prediccin. (PAG.64)
Figura 6: Comportamiento de
S.aureus a 15C
(base, --) y con agregado de 1000 ppm de sorbato de potasio (--); (I)
desvo estndar. (PAG.65)
Figura 7
( --).
almacenado a 10 C: a) Valores
prediccin (PAG.80)
Figura 18: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivacin de S.aureus en queso untable base (pH 4.3) almacenado a
15C, ( ) valores experimentales; () prediccin . (PAG.81) Tabla 7:
Ajuste del modelo de Gompertz modificado a los datos experimentales
y sus respectivos parmetros caractersticos, correspondientes al
comportamiento de S.aureus en queso untable base (pH 4,3)
almacenado a 15 C (PAG.82)
Figura 19: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento
de S.aureus en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 15 C: a)
datos
experimentales. (PAG.88)
Figura 25: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivacin de S.aureus en queso untable base almacenado a 6C, ( )
valores experimentales; () prediccin (PAG.89)
Tabla 9: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 6 C (PAG.90)
Figura 26: Validacin
datos
Figura
( )
34:
Validacin
propuesto
para la
(PAG.101)
Figura 37: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
crecimiento de E.coli en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25C,
( ) valores experimentales; () prediccin (PAG.102)
Tabla 14: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de E.coli
en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 25 C (PAG.103)
Figura 38: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento
de E.coli en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25 C: a) Valores
observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos .
( ) valores experimentales; () prediccin. (PAG.104)
predichos . ( ) valores
prediccin (PAG.112)
Figura 47: Evaluacin del comportamiento de L.monocytogenes en
queso untable base, pH 5,0 a diferentes temperaturas de almacenamiento:
6C (-- ),17C ( -- ) y 25C ( -- ); (I): desvo estandar (PAG.113)
Figura 48: Comportamiento predicho de L.monocytogenes a pH 5,0 y 6
C (a), 17C (b) y 25C (c) : ( ) prediccin, ( --- ) lmite de confianza
superior predicho, ( --- ) lmite de confianza inferior predicho, (-- )
datos experimentales. (PAG.114)
Figura 49 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de
inactivacin de L.monocytogenes en queso untable base (pH 5,0)
almacenado a 6C (a),17C (b) y 25C (c) ( ) valores experimentales;
() prediccin (PAG.116)
Tabla 18: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de
L.monocytogenes en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 6 C
(PAG.117)
Tabla 19: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos
parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de
L.monocytogenes en queso untable base (pH 5.0) almacenado a 17 C
(PAG.117)
; (I):desvo estndar.
(PAG.122)
Figura 52: Comportamiento de S.Enteritidis en queso untable base con
(--) y sin agregado de (--)
1. INTRODUCCIN
El queso tiene una produccin anual superior a otros productos del mundo
muy importantes tales como caf, t, cacao y tabaco. Estados Unidos es el mayor
productor mundial y casi la totalidad de esa produccin est dirigida al mercado
local, siendo casi nula su exportacin. Alemania es el mayor exportador en cuanto a
cantidad y Francia el mayor exportador en cuanto a valor monetario. As mismo,
siguen a Estados Unidos en cuanto a produccin. Dentro de los pases productores
en cuarta posicin encontramos a Italia y en dcimo lugar a la Argentina. Los pases
importadores de quesos por excelencia son: Alemania, Reino Unido e Italia. El
mayor consumo per cpita lo registra Grecia, seguido de Francia y en tercera
posicin, Italia. Luego siguen Suiza, Alemania, Pases Bajos, Austria, Suecia, etc.
(SAGyP, MINAGRI,2010)
En el cuadro 1 se presenta un resumen de los volmenes producidos,
consumidos y los stocks finales de los principales productos comercializados en el
mercado mundial.
Cuadro 1. Principales variables del mercado internacional (ao 2002)
Produccin
Consumo
Stocks
3.473
3.116
12.470
6.211
(tonelada)
3.127
2.438
12.091
5.854
970
186
716
310
Productos
Leche en Polvo descremada
Leche en Polvo entera
Quesos
Manteca
Leche
Filtrado
Pasteurizacin
Enfriamiento
Cuajado
Corte de la cuajada
Moldeado
Prensado
Salado
Acabado
1.3.2 Cuajado
Una vez la leche en la cuba de cuajado (Figura 6), se aaden los fermentos
lcticos, bacterias que contribuirn a la posterior maduracin del queso. Es en esta
fase donde se le adiciona el cuajo, que dependiendo del tipo de queso podr ser
vegetal, animal o microbiano, formndose la cuajada. Fsicamente, consiste en la
precipitacin de las micelas de casena formando un gel que retiene adems los
glbulos de grasa, agua y sales.
Figura 6: Proceso de cuajado
1.3.4. Moldeado
El moldeado consiste en el llenado de los moldes con los granos de cuajada
(Figura 8).
Figura 8: Moldeado
1.3.5. Prensado
Una vez llenados los moldes se pasa a la etapa de prensado, la cual en la
actualidad se realiza con unas prensas neumticas en la mayora de las queseras.
Debido a la presin, que variar dependiendo del tipo de queso que estemos
elaborando, se facilita la unin entre los granos de la cuajada y el desuerado (Figura
9).
Figura 9: Prensado
1.3.6. Salado
Una vez finalizado el tiempo de prensado, se procede al salado del queso a
mano bien, sumergindolo en salmuera (Figura 10). Con la fase de salado, se
consigue realzar el sabor del queso; preservar del crecimiento de microorganismos
indeseables, favorecer la prdida de suero y la formacin de la corteza.
Figura 10: Salado
1.3.7. Madurado
A esta fase pasan los quesos tiernos, semicurados y curados. Son mantenidos
en cmaras donde se controla la temperatura y la humedad. Durante esta fase los
quesos son volteados frecuentemente para evitar que se deformen y la corteza se
forme de forma uniforme. La maduracin comprende una serie de cambios en las
1.3.8. Acabado
La fase de acabado se refiere a las distintas presentaciones en las que podemos
encontrar algunos de los quesos, por ejemplo, quesos al pimentn, al romero, etc.
(Figura 12)
Figura 12: Acabado
1.4. Produccin de queso sin conservante (base) efectuada por Danone para el
presente estudio.
El proceso de elaboracin del queso untable base utilizado en el presente
estudio y realizado por la empresa Danone posee varios pasos alguno de los cuales
son especficos para esta variedad.
Como primer paso se realiz la pasteurizacin con el fin de destruir flora
indeseada.
Posteriormente al tratamiento trmico se di comienzo a un proceso
bioqumico pero de decisiva importancia: se adicionaron el cuajo, los cultivos
10
10
tasa
de
recuperacin de
protenas
solubles, por
cuyo objetivo es
Pasteurizacin
Incorporacin de
cloruro de calcio,cuajo y
fermento
Fermentacin
Fermentacin
Termizacin
Inyeccin de crema
Inyeccin de
ingredientes
Homogeneizacin
Envasado
Acondicionamiento
Enfriamiento
Homogeneizacin
Almacenamiento en
cmara fra
Ricota y el Fundido. Estos quesos son muy aptos para ser incorporados en ensaladas
y para elaborar salsas livianas y fras para acompaar carnes.
Grasas- Aparte de ser fuente de energa (42% de la energa de la leche entera) aporta
a la textura, sabor y al poder de saciedad de este alimento. . Los lcteos son la fuente
natural ms rica en cido linoleico conjugado siendo identificado este producto como
potencial fuente benfica para la salud, teniendo propiedades antioxidantes habiendo
evidencias
de
tener
propiedades
anticarcinognicas
(colon
mama)
Enterococcus,
Aerococcus,
Carnobacterium,
Oenococcus,
estn ms
vinculados con quesos blandos, de humedad superior al 46%. En cambio, los quesos
duros, de humedad menor al 36% pueden ser elaborados con leche termizada
(tratamiento trmico ms suave que la pasteurizacin), la larga maduracin requerida
para alcanzar esos niveles de humedad dificulta el desarrollo de los patgenos que
microorganismos asociados
desde 1970 con brotes asociados a quesos (Roberts, 2002). Muchos de estos
microorganismos estn
distribuidos en
el
ambiente
pueden
ocasionar
en
20
20
la mayora de los
del
metabolismo.
El
crecimiento
la
supervivencia
de
los
la
30
30
dividirlos
en
modelos
de
crecimiento
modelos
de
2. OBJETIVOS
35
un derivado
lcteo mediante la
2)
Modelar
validar
internamente
la
cintica
de
3)
36
36
4)
5)
abuso trmico.
6)
3. MATERIALES Y MTODOS
38
54,3%
Crema
44,5%
Gelatina
0,7%
Cloruro de sodio
0,2%
Citrato de sodio
0,3%
84%
39
39
Crema
15,98%
Gelatina (textura)
0,002%
0,0008%
Cloruro de Sodio
0,0006%
Cloruro de Calcio
0,004%
Fermento(cultivo iniciador)
0,02%
Cuajo
0,0001%
El fermento mencionado anteriormente estaba compuesto por
una
tuvo un valor
aproximado de 0,6-0,7%.
3.1.2 Medicin de pH
Para la medicin de pH se utiliz un equipo marca Orion, in selectivo,
modelo 710 (Orion, Inc, USA) calibrado con soluciones buffer (Hanna Instruments,
Italia)
Las
40
40
27,5 gr,
2,0 gr
Cloruro sdico
5,0 gr
15,0 gr
17,0 gr
3,0 gr
2,5 gr
Cloruro sdico
5,0 gr
Hidrgenofosfato di potsico
2,5 gr
10,0 gr
Cloruro de sodio
5,0 gr
Fosfato disdico
3,5 gr
Fosfato monopotsico
1,5 gr
10,0 gr
Extracto de carne
5,0 gr
5,0 gr
12,0 gr
Piruvato de sodio
10,0 gr
1,0 gr
0,5 gr
15,0 gr
Agar 2,0 gr
Suplemento: cycloheximida, colistina, cefotetn, fosfomicina,acriflavina.
Agar BPL ( Merck, Darmstadt, Alemania), composicin:
Peptona de carne
5,0 gr
Peptona de casena
5,0 gr
Extracto de carne
5,0 gr
Cloruro de sodio
3,0 gr
Hidrgenofosfato disdico
Lactosa
10,0 gr
Sacarosa
10,0 gr
2,0 gr
0,0125 gr
12,0 gr
10,0 gr
Lactosa
10,0 gr
Fosfato dipotsico
2,0 gr
Eosina 0,4 gr
Azul de metileno 0,065 gr
Agar-agar
15,0 gr
United
States
Pharmacopea
XXI,1995;Internacional
Aislamiento de S.aureus ATCC 25923 utilizados en este estudio, medio agar Baird
Parker.
Argentina ).
3.4-Metodologa
3.4.1- Preparacin de los inculos
Para cada una de las cepas, se aisl una colonia a partir del agar diferencial y
selectivo correspondientes (Figuras 2a, b, c y d). Dicha colonia se inocul en 10 ml
de caldo de enriquecimiento (Materiales y Mtodos, seccin 3.2), el cual se incub
durante 24 hs a 37C.
Para la elaboracin de un inculo madre, se tom 0,5ml del inculo de cada
microorganismo y se diluy en 500 ml de agua peptonada alcanzando en todos los
5
minutos a baja velocidad. Las bolsas, conteniendo los 160 gr de queso inoculado y
0,48 gr de timol, se cerraron manualmente sacando todo el oxgeno remanente y se
almacenaron a las distintas temperaturas correspondientes en cada ensayo (5C25C) para su posterior anlisis.
3.4.4- Recuento de microorganismos
De cada bolsa inoculada y almacenada a la temperatura correspondiente a la
experiencia se tomaron en los das de recuento10 gr de la muestra de queso, por
duplicado (duplicado de experiencia). Se agregaron 90 ml de agua peptonada a cada
bolsa y se homogeneizaron 2 minutos a baja velocidad en stomacher (Seward
Medical,Londres,UK) para asegurar un correcto mezclado.
A partir de dichos homogenatos se calcularon las diluciones correspondientes
como para lograr un recuento de no ms de 100 colonias por placa y minimizar el
error de conteo. Se inocularon las placas de Petri, por duplicado (duplicado de placa)
realizando la metodologa de recuento combinado.
Para la metodologa del recuento combinado se tom 1 ml del homogenato
presente en las bolsas agitadas en el stomacher, se distribuy homogneamente en 3
placas de Petri (0,33 ml en cada placa), se esparci con esptula de Drigalsky hasta
absorcin total y se puso a incubar. El medio utilizado para las placas fue el agar de
aislamiento especfico para cada microorganismo (Materiales y Mtodos, seccin
3.2.2). La incubacin se llevo a cabo en incubadoras (Velp, Italia) a 37C ,el tiempo
correspondiente a cada experiencia. Se realiz el recuento informando UFC/gr.
3.5 Estudios realizados
3. 5.1 Estudio del efecto de la temperatura de almacenamiento
Se estudi el comportamiento de S. aureus en el queso untable (conteniendo
1000 ppm de sorbato de potasio) a temperatura de refrigeracin: 5C y temperatura
de abuso trmico: 15C y se compar con el comportamiento a las mismas
temperaturas pero en caldo nutritivo (BHI) a modo de tener un parmetro mas de
referencia.
Matriz
Temperatura de
Das de recuento
almacenamiento
Queso untable
5C
0,7,12,17 y 21
Queso untable
15C
0,3,5,7,10,12,14,17 y 19
BHI
5C
0,1,2,3,10,12 y 14
BHI
15C
0,2,5,9,12,13,y 14
Matriz
Temperatura de
Das de recuento
almacenamiento
Queso untable
15C
0,3,5,7,10,12,14,17 y 19
15C
2,4,6,8,10,12,14 y 16
pH final medido
(ml)
0,1
5,0
0,3
4,6
0,5
4,5
0,7
4,4
0,9
4,3
1,1
4,2
1,3
4,1
Temperatura/pH
Das de recuento
10C/ 5,0
0,5,7,12,20,25,30 y 40
15C/ 5,0
0,2,4,6,8,11,13,15 y 17.
22C/5,0
0,2,5,7,12,16,19,26,28,30,33 y 38
10C/ 4,3
0,20,40,50,60 y 65.
15C/ 4,3
0,3,7,11,14,17 y 19.
22C/ 4,3
0,2,6 y 20
Temperatura/pH
Das de recuento
6C/ 5,0
17C/ 5,0
0, 2, 5, 8, 11, 12, 13 y 14
25C/ 5,0
0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7
50
50
los fines de poder realizar una comparacin del comportamiento del microorganismo
ensayado. Se realiz el siguiente esquema de muestreo:
Matriz
Microorganismo
Temperatura/pH
Das de recuento
Queso untable
S.aureus
6C/ 5,0
0,7,14,21,31,33 y 35
17C/ 5,0
0,4,7,11,12,18 y 21
base + 0,3%timol
Queso untable
S.Enteritidis
25C/ 5,0
0,3,4,10,12,14 y 17
17 C/ 5,0
0,2,7,9,13,14,15 y 20
base + 0,3%timol
eq (1)
representan las
Log N (UFC/g)
Tiempo (da)
Log10UFC / g / da
LAG da
eq 2
Log10 2 exp 1
BC
1
B
BC
exp 1
eq 3
eq(4)
eq (5)
donde
Log [Nt/N0]: fraccin logartmica de supervivencia
Los parmetros estimados (A, B y C) representan las diferentes regiones de
la curva de supervivencia inactivacin (Figura 15). A: hombro de la curva de
muerte (da); B: velocidad mxima de muerte (1/da) y C: cambio total en el nmero
de sobrevivientes (-).
Figura 15. Parmetros de la ecuacin de Gompertz modificada para muerte
3.6.2 Modelo
terciario
El progreso logrado en el modelado microbiano ha sido importante y los
modelos presentados han logrado ser una herramienta de mucho valor para evaluar y
disear diferentes procesos en la industria alimentaria. Sin embargo no es posible an
contar nicamente con estos modelos para determinar la seguridad de los alimentos y
sistemas. Las validaciones en
y 17)
programa
3. 7 Anlisis estadstico
Los ajustes del modelo de Gompertz y del modelo de Gompertz modificado
para muerte a los datos experimentales
se validaron
internamente mediante el
4. RESULTADOS
57
UFC/g)
58
58
el
caso de
L.monocytogenes en pasta de
salchichas.
60
60
LogN/N0
0
-0,4
-0,8
-1,2
-1,6
-2
-2,4
12
16
20
24
Tiempo (da)
1,21
0,08
-0,35
0,03
-8,6
8,1
ANLISIS DE LA DESVIACIN
Fuente
SS
gl
MODELO
10,12
RESIDUAL
0,005
R ajustado
1
FISHER
1348*
99,70
2
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R ajustado: coeficiente de
2
determinacin ajustado por grados de libertad. NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%. A: hombro de la curva de muerte (da) ; B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).
-1
sigmoideas
y 1500 ppm de
(a)
residuales
0
-0,4
-0,8
-1,2
-1,6
0,02
0
-0,02
-0,04
-2
-2,4
(b)
0,04
-0,06
-2,4
-2
-1,6
-1,2
-0,8
-0,4
valores predichos
-2,4
-2
-1,6
-1,2
-0,8
-0,4
valores predichos
un
un hombro inicial (A) de 4,55 das; una velocidad de muerte (B) de 0,39 da y un
cambio global (C) de 1,55 ciclos, el cual es muy cercano al valor observado
experimentalmente.
Figura 4 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivacin de
S.aureus en queso untable almacenado a 15C, ( ) valores experimentales; ()
prediccin.
LogN/N0
0
-0,3
-0,6
-0,9
-1,2
-1,5
-1,8
12
Tiempo (da)
16
20
4,55
-0,39
0,17
0,04
-1,65
2,97
ANLISIS DE LA DESVIACIN
Fuente
SS
FISHER
gl
MODELO
6,49
RESIDUAL
0,03
432
R ajustado
98,59
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R ajustado: coeficiente de
2
determinacin ajustado por grados de libertad. NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%. A: hombro de la curva de muerte (da) ; B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).
Residuales
Valores observados
-0,3
-0,6
(b)
0,16
0,11
0,06
-0,9
0,01
-1,2
-0,04
-0,09
-1,5
-1,8 -1,8
-1,5
-1,2
-0,9
-0,6
-0,3
-0,14
valores predichos
-1,8
-1,5
-1,2
-0,9
-0,6
-0,3
Valores predichos
alimentaria pero sin la presencia de este aditivo. La experiencia se realiz tal como se
detalla en Materiales y Mtodos, seccin 3.5.2. Para ello se trabaj con la misma
cepa de S.aureus y una vez inoculado el queso untable base (sin agregado de 1000
ppm de sorbato de potasio) se procedi a incubarlo a 15C.
En este caso se observ un leve
las diferentes regiones de la curva de supervivencia: el hombro inicial (A~ 5,9 das),
-1
Log N/N0
() prediccin .
0,1
-0,1
-0,3
-0,5
-0,7
-0,9
-1,1
12
15
18
Tiempo (da)
A
B
5,88
-0,43
1,84
0,15
-1,35
0,22
ANLISIS DE LA DESVIACIN
Fuente
gl
MODELO
1,95
RESIDUAL
0,006
R ajustado
1
SS
FISHER
325**
99,08
2
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R ajustado: coeficiente de
2
determinacin ajustado por grados de libertad. NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da) ; B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).
predichos . (
) valores
Valores observados
experimentales; ()
prediccin.
X 0,001)
55
Residuales
(a)
0,1
-0,1
-0,3
-0,5
(b)
35
15
-5
-0,7
-25
-0,9
-45
-1,1
-1,1
-0,9
-0,7
-0,5
-0,3
-0,1
0,1
Valores predichos
-1,1
-0,9
-0,7
-0,5
-0,3
-0,1
0,1
Valores predichos
untable base con el propsito de evitar introducir un agente de stress microbiano (tal
como es el uso de sorbato de potasio) y as poder estudiar la influencia de distintos
factores evaluados.
pH 4,3
result
y 22C, quienes
observaron que tanto en quesos semi-duros como en quesos blandos elaborados con
leche de oveja la flora microbiana contaminante compuesta por diferentes gneros
de la familia Enterobacteriaceae y el gnero Staphylococcus disminua lentamente.
La nica flora constitutiva que se encontraba presente era la correspondiente a
Bacterias cido Lcticas
su concentracin desde un
el gnero
Figura 9
10C (-- ), 15C ( -- ) y 22C ( --). (a) pH 5,0; (b) pH 4,3; (I): desvo estndar.
establece crecimiento de S. aureus (en un caldo de cultivo) con una fase de latencia
de 10 das, aumento exponencial de la poblacin hasta el da 35 y fase estacionaria a
partir de all (Figura 10a).
En queso untable base almacenado a 15C, la respuesta de S.aureus fue
nuevamente de muerte a lo largo del tiempo de almacenamiento pero con una
reduccin de 1 ciclo logartmico en 22 das contradicindose nuevamente con lo
predicho por el programa PMP (Figura 10 b).
La Figura 10c muestra la curva de crecimiento de S. aureus en queso untable
base (pH 5,0)
a 22C
interacciones que pudieran derivar entre ellos y los microorganismos (se trate de
sinergismos o antagonismos) alteran la respuesta observada y la alejan de la
prediccin. En todo modelo predicho el comportamiento bacteriano est descripto
para un medio de cultivo con los nutrientes ptimos para permitir, si fuera factible, el
crecimiento bacteriano. Esta es posiblemente la causa por la que no se observ
concordancia con la prediccin (Whiting, 1997).
70
70
Figura 10 : Comportamiento de
y (c): 22C . (
15 C se
0,05 da y un cambio global (C) de 9,4 ciclos. Al parecer este modelo fall en la
prediccin de la cada total observada y esto pudiera deberse a la ausencia de una
cola marcada en los datos experimentales, hecho que ya ha sido comentado.
Figura 11: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivacin de
S.aureus en queso untable base (pH 5.0)
almacenado a 10C,
( ) valores
Log N/N0
experimentales; () prediccin .
0,6
-0,4
-1,4
-2,4
-3,4
-4,4
10
20
30
40
Tiempo (da)
-0,16
1,17
-0,05
0,03
-9,38
8,64
ANLISIS DE LA DESVIACIN
Fuente
SS
gl
MODELO
55,61
RESIDUAL
0,12
R ajustado
1
FISHER
927**
99,01
2
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R ajustado: coeficiente de
2
determinacin ajustado por grados de libertad. NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%. A: hombro de la curva de muerte (da) ; B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).
(a)
(b)
Residuales
Valores observados
() prediccin.
0,32
0,6
0,22
-0,4
0,12
-1,4
0,02
-2,4
-0,08
-3,4
-0,18
-4,4
-4,4
-0,28
-3,4
-2,4
-1,4
-0,4
0,6
-4,4
-3,4
Valores predichos
-2,4
-1,4
-0,4
0,6
Valores predichos
inicial mayor (A= 5,9 das), una velocidad de muerte similar (B = - 0,43 d ) y un
cambio global en el numero de sobrevivientes significativamente menor (C = 1,4),
hecho que est de acuerdo con el establecimiento de una temperatura ms propicia
para el desarrollo del microorganismo.
A 22C se observ crecimiento de S. aureus en queso untable base (pH 5,0).
Dado que el comportamiento observado no fue lineal, se caracteriz la curva
mediante el modelo de Gompertz (Figura 13), obteniendo los parmetros
matemticos caractersticos del mismo: A, B, C y M.
Tal como se describi en Materiales y Mtodos, seccin 3.6.1.1 con los
valores matemticos de los parmetros correspondientes a la curva se obtuvieron los
parmetros biolgicos tiempo de generacin (TG); velocidad de crecimiento
exponencial (VCE) y tiempo de fase lag (LAG). La Figura 13 muestra una adecuada
correlacin entre los datos experimentales y los predichos por este modelo primario.
( ) valores
experimentales; () prediccin
Log N
9,1
8,1
7,1
6,1
5,1
4,1 0
10
20
30
40
Tiempo (dia)
Valores observados
experimentales; () prediccin
(a)
9,1
8,1
7,1
0,6
(b)
0,4
0,2
0
-0,2
6,1
-0,4
5,1
4,1
predichos . ( ) valores
-0,6
4,5
5,5
6,5
7,5
8,5
4,1
9,5
5,1
6,1
7,1
8,1
9,1
Valores predichos
Valores predichos
Estimador
Error Estndar
0,18
4,54
0,14
4,43
0,73
18,60
1,70
0,05
ANLISIS DE LA DESVIACIN
Fuente
SS
gl
MODELO
510,35
1,02
RESIDUAL
2
R ajustado
FISHER3
981**
95,85
PARAMETROS BIOLGICOS
Gompertz
PMP
TG (da)
1,17
0,10
0,26
1,35
LAG (da)
18
0,67
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R ajustado: coeficiente de
2
determinacin ajustado por grados de libertad.
TG: tiempo de generacin; VCE: velocidad de
crecimiento exponencial; LAG: tiempo de fase lag.3NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**:
muy significativo al 1%.
El anlisis de la
Tabla 5
la muerte del
Figura 15: Comportamiento de S.aureus a pH 4,3 y 10 C(a), 15C (b) y 22C (c):
() prediccin , ( --- ) lmite de confianza superior predicho, ( --- ) lmite
de
confianza inferior predicho ,(-- ) datos experimentales.
realiz un modelado primario solo con el fin de orientar sobre los parmetros
caractersticos de las curvas obtenidas a 10, 15 y 22 C y comparar con la prediccin
del programa PMP.
A 10C se observ que el modelo de Gompertz modificado para
supervivencia
Log N/N0
experimentales; () prediccin .
0,5
-0,5
-1,5
-2,5
-3,5
10
20
Tiempo (da)
30
40
2,91
-0,17
1,0x10
3
0,9x10
-3,56
0,5x10
ANLISIS DE LA DESVIACIN
Fuente
SS
gl
MODELO
25,25
RESIDUAL
1,0x10
-8
FISHER
8
8,4x10 **
99,99
R ajustado
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R ajustado: coeficiente de
2
determinacin ajustado por grados de libertad. NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da) ; B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -)
Figura 17: Validacin interna: Anlisis estadstico del modelo propuesto para el
crecimiento de S.aureus en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 10 C: a)
Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . ( )
(a)
0,5
-0,5
-1,5
-2,5
-3,5
-3,5
-2,5
-1,5
(b)
X 0,00001)
8
Residuales
Valores observados
-0,5
Valores predichos
0,5
4
0
-4
-8
-3,5
-2,5
-1,5
-0,5
0,5
Valores predichos
80
80
( ) valores
Log N/N0
experimentales; () prediccin .
0
-0,5
-1
-1,5
-2
-2,5
-3
12
15
Tiempo (da)
1,60
0,90
-0,20
0,17
-3,89
2,14
ANLISIS DE LA DESVIACIN
Fuente
SS
gl
MODELO
14,76
RESIDUAL
0,20
R ajustado
FISHER
49**
94,12
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R ajustado: coeficiente de
2
determinacin ajustado por grados de libertad. NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da) ; B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).
Figura 19: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento de S.aureus
en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 15 C: a) Valores observados vs
Valores observados
() prediccin.
0,34
(a)
-0,5
0,14
-1
0,04
-1,5
-0,06
-2
-0,16
-2,5
-3 -3
(b)
0,24
-2,5
-2
-1,5
-1
-0,5
Valores predichos
-0,26
-3
-2,5
-2
-1,5
-1
-0,5
Valores predichos
Otros
alimenticios estudiados.
Figura
Log (N/N0)
experimentales; () prediccin .
0
-1
-2
-3
-4
0
12
Tiempo (da)
16
20
-0,49
0,25
-0,27
0,01
-8,80
1,62
ANLISIS DE LA DESVIACIN
Fuente
SS
gl
MODELO
26,95
RESIDUAL
0,0004
FISHER
22458**
R ajustado
99,98%
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R ajustado: coeficiente de
2
determinacin ajustado por grados de libertad. NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da) ; B : mxima velocidad de muerte (1/da)
y C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).
Figura 21: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento de S.aureus
Valores observados
0
-1
-2
-3
-4
-4
-3
-2
-1
Valores predichos
Figura 22: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento de S.aureus
en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 22 C:Residuales vs. valores predichos
. ( ) valores experimentales; () prediccin
Residuales
0,001)
23
13
3
-7
-17 -4
-3
-2
-1
Valores predichos
el comportamiento de cuatro
modelos de
9 y 10
Log(N/N0)
prediccin
0,6
-0,4
-1,4
-2,4
-3,4
10
20
Tiempo (da)
30
40
-1,17
0,43
-0,06
0,006
-14,43
1,27
ANLISIS DE LA DESVIACIN1
Fuente
MODELO
RESIDUAL
SS
gl
39,38
0,38
3
4
FISHER2
146*
R ajustado
93,00
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R ajustado: coeficiente de
2
determinacin ajustado por grados de libertad. NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%. A: hombro de la curva de muerte (da) ; B : mxima velocidad de muerte (1/da)
y C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).
Residuales
Valores observados
-0,4
0,51
(b)
0,31
0,11
-0,09
-1,4
-0,29
-2,4
-0,49
-3,4
-3,4
-2,4
-1,4
-0,4
Valores predichos
0,6
-3,4
-2,4
-1,4
-0,4
0,6
Valores predichos
90
90
0,1
-0,3
-0,7
-1,1
-1,5
-1,9
12
16
20
Tiempo (da)
Tabla 10: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
base almacenado a 17 C.
Parmetro
-0,39
0,096
-0,46
0,073
-3,44
0,74
1
ANLISIS DE LA DESVIACIN
Fuente
SS
gl
MODELO
15,65
RESIDUAL
0,07
R ajustado
1
FISHER2
261**
96,00%
2
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R ajustado: coeficiente de
2
determinacin ajustado por grados de libertad. NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da); B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).
(b)
Residuales
(a)
0,1
0,28
0,18
-0,3
0,08
-0,7
-1,1
-0,02
-1,5
-0,12
-0,22 9
-1,
-1,9
-1,9
-1,5
-1,1
-0,7
-0,3
-1,5
0,1
-1,1
-0,7
-0,3
0,1
Valores predichos
Valores predichos
cadas similares de la
poblacin de S. aureus en queso cheddar (pH 5,4) y en mozzarella (pH 5,3) sin
agregado de sorbato de potasio y almacenados a 10C, de entre 2,4 y 4 ciclos
logartmicos, respectivamente.
Ambas condiciones de almacenamiento provocaron que la curva de muerte de
este microorganismo no presentara hombro inicial (valores negativos de A). La
velocidad de muerte fue algo mayor a 17C
-1
tambin fue
( ) valores
experimentales; () prediccin
Log N
9
8
7
6
5
0
12
15
18
Tiempo (dia)
Tabla 11: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
base (pH 5.0) almacenado a 25 C
Parmetro
Estimador
Error Estndar
5,11
0,12
1,41
0,30
2,79
0,18
6,42
3,29
ANLISIS DE LA DESVIACIN
1
3
Fuente
MODELO
RESIDUAL
2
R ajustado
SS
313,63
0,09
98,46
FISHER
gl
4
3
2613**
PARAMETROS BIOLGICOS
TG (da)
VCE (Log UFC/g/da)
Gompertz
0,54
0,55
PMP
0,07
0,59
LAG (da)
5,0
0,42
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R ajustado: coeficiente de
2
determinacin ajustado por grados de libertad. NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.
Figura 30: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento de S.aureus
en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25 C: a) Valores observados vs
valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos. ( ) valores experimentales;
(a)
0,21
Residuales
Valores observados
() prediccin
8
7
(b)
0,11
0,01
-0,09
6
5
5,1
5,6
6,1
6,6
7,1
Valores predichos
7,6
8,1
-0,19 5
Valores predichos
4.4.2 E. coli
Los datos experimentales correspondientes al desarrollo de E. coli en queso
unatble base a 6C; 17C
y a 25C mostraron
un comportamiento similar al
en medio de cultivo, de
experimentales observados pero con un perfil muy diferente (Figura 32a). Mientras
el programa PMP predice un hombro inicial de aproximadamente 7 das, para luego
inmediatamente caer 3 ciclos logartmicos y a partir de all un descenso progresivo,
la curva experimental no presenta hombro y exhibe una declinacin muy escasa de la
poblacin.
A 17C, la poblacin de E.coli disminuy conforme aument el tiempo de
almacenamiento, resultados que no condicen con la prediccin del programa PMP,
el cual, propone crecimiento para dichas condiciones y en medio de cultivo (Figura
32b). Las diferencias observadas se deben posiblemente a que se trata de una
temperatura sub-ptima y que E.coli patgena no desarrolla en los quesos
fermentados a pH <5,4 (ICMSF,1996). Ya se ha comentado que tambin podra
deberse a la presencia de algn componente inhibidor de crecimiento en el queso.
Montville (1997) describi que el crecimiento bacteriano est gobernado al
menos por tres factores (pH, aw y temperatura) y en muchos casos existen
interacciones entre ellos. Estos autores mencionaron tambin que estas interacciones
o sinergismos describen como diferentes factores extrnsecos e intrnsecos del
alimento afectan la habilidad del microorganismo de sobrevivir o iniciar su fase de
crecimiento. Ciertas investigaciones (Roberts e Ingram, 1973) observaron la
necesidad de estudiar los efectos interactivos de varios parmetros influyentes en el
crecimiento bacteriano sumado a la produccin de metabolitos txicos. Esto podra
explicar la no coincidencia con lo predicho por el programa PMP.
A 25C, temperatura cercana a la temperatura ptima de crecimiento (35C40C) definida en la bibliografa (ICMSF,1996), se observ que los datos
experimentales son coincidentes con lo predicho por el programa de modelado de
patgenos, PMP con la diferencia de una fase de latencia de mayor duracin (3 das
(--
);
(I):desvo estndar.
Figura 32: Comportamiento predicho de E.coli a pH 5,0 y 6 C (a), 17C (b) y 25C
(c): ( ) prediccin , ( --- ) lmite de confianza superior predicho, ( --- ) lmite
de
confianza inferior predicho, (-- ) datos experimentales
Log(N/N0)
prediccin
0,07
-0,03
-0,13
-0,23
-0,33
-0,43
12
16
20
Tiempo (da)
Tabla 12: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de E.coli en queso untable base
(pH 5.0) almacenado a 6 C
Parmetro
A
B
2,39
-0,10
0,06
0,01
-1,84
0,37
ANLISIS DE LA DESVIACIN
Fuente
gl
MODELO
0,28
RESIDUAL
0,00002
R ajustado
1
SS
FISHER2
13283**
99,98
2
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R ajustado: coeficiente de
2
determinacin ajustado por grados de libertad. NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da); B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).
Figura 34: Validacin interna del modelo propuesto para la supervivencia de E.coli
en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 6 C: a) Valores observados vs valores
predichos; b) Residuales vs. valores predichos . ( ) valores experimentales; ()
X 0,0001)
48
(a)
0,07
Residuales
Valores observados
prediccin.
-0,03
-0,13
-0,23
(b)
28
8
-12
-0,33
-0,43
-0,43
-0,33
-0,23
-0,13
-0,03
-32
-0,43
0,07
-0,33
-0,23
-0,13
-0,03
0,07
Valores predichos
Valores predichos
Log(N/N0)
prediccin.
0,6
0,1
-0,4
-0,9
-1,4
-1,9
-2,4
12
15
18
Tiempo (da)
100
1001
Tabla 13: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de E.coli en queso untable base
(pH 5.0) almacenado a 17 C.
Parmetro
A
B
2,88
-0,25
2,00
0,20
-2,80
0,89
1
ANLISIS DE LA DESVIACIN
FISHER2
SS
gl
Fuente
MODELO
8,02
RESIDUAL
0,04
133**
R ajustado
98,12
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R ajustado: coeficiente de
2
determinacin ajustado por grados de libertad. NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%. A: hombro de la curva de muerte (da); B: mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).
Figura
(a)
0,6
0,1
-0,4
-0,9
(b)
0,2
0,1
0
-1,4
-0,1
-1,9
-2,4
-2,4
-1,9
-1,4
-0,9
-0,4
0,1
Valores predichos
0,6
-0,2
-2,4
-1,9
-1,4
-0,9
-0,4
0,1
0,6
Valores predichos
ajustado de
Log N
8,4
7,4
6,4
5,4
4,4
3,4 0
Tiempo (dia)
10
( ) valores
Tabla 14: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de E.coli en queso untable base
(pH 5.0) almacenado a 25 C
Parmetro
Estimador
Error Estndar
3,93
0,19
0,56
0,05
5,33
1,63
6,77
1,00
ANLISIS DE LA DESVIACIN
Fuente
SS
MODELO
239,77
RESIDUAL
0,60
R ajustado
FISHE R3
gl
399 **
94,51
PARAMETROS BIOLGICOS
Gompertz
PMP
TG (da)
0,26
0,04
1,18
5,9
LAG (da)
5,75
0,22
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R ajustado: coeficiente de
2
determinacin ajustado por grados de libertad. NS: no significativo; *: significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.
Figura 38: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento de E.coli en
queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25 C: a) Valores observados vs valores
predichos; b) Residuales vs. valores predichos . ( ) valores experimentales; ()
8,4
(a)
Residuales
Valores observados
prediccin.
7,4
6,4
5,4
0,55
(b)
0,35
0,15
-0,05
4,4
-0,25
3,4
-0,45
3,9
4,9
5,9
6,9
7,9
Valores predichos
8,9
3,4
4,4
5,4
6,4
7,4
8,4
Valores predichos
4.4.3. S. Enteritidis
En la Figura 39
untable base almacenado a 6C, 17C y 25C. Al igual que con S. aureus y E. coli; la
poblacin de S.Enteritidis decreci en funcin del tiempo a 6C y 17C pero mostr
crecimiento neto a 25C.
El programa PMP predijo a 6C y 17C muerte bacteriana coincidente con los
resultados obtenidos, pero si se observan los grficos superpuestos (Figura 40 a y b)
se evidencia la curva de muerte de S.Enteritidis en el queso untable base a una
velocidad muy inferior (2 ciclos logartmicos en 37 das) a la predicha por el
programa PMP, el cual estim una cada de 5 ciclos logartmicos en 2,5 das.
A 25C experimentalmente se comprob crecimiento a pesar que la
prediccin por el PMP es de muerte bacteriana Figura 39 c) ; PMP predice
crecimiento de S.Enteritidis a 25C a un pH > 5.4 (en caldo nutritivo).
(I):desvo estndar.
Figu
c*
*en este caso no se superpuso la respuesta observada ya que se registr crecimiento (ver figura 39)
arroj valores de R entre 99,2% y 97,3% con F muy significativo ( < 0,01). La
validacin interna realizada (Figuras 42 y 44) mostr que en los grficos de valores
observados vs predichos as como en el grfico de residuales vs. valores observados
los datos experimentales y los predichos presentaron distribucin homognea.
Log(N/N0)
experimentales; () prediccin
0
-0,4
-0,8
-1,2
-1,6
-2
0
10
20
Tiempo (da)
30
40
Tabla 15: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de S.Enteritidis en queso untable
base (pH 5.0) almacenado a 6 C
Parmetro
1,12
-0,12
0,28
0,02
-2,17
0,16
1
ANLISIS DE LA DESVIACIN
FISHER2
SS
gl
Fuente
MODELO
RESIDUAL
15,23
0,02
3
4
1016**
R ajustado
99,23
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R ajustado: coeficiente de
2
determinacin ajustado por grados de libertad. NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da); B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).
Figura
0,3
(b)
Residuales
Valores observados
prediccin
-0,1
0,06
-0,5
-0,9
0,02
-0,02
-1,3
-1,7
-2,1
-2,1
0,1
-0,06
-1,7
-1,3
-0,9
-0,5
-0,1
Valores predichos
0,3
-0,1
-2
-1,6
-1,2
-0,8
-0,4
Valores predichos
( ) valores
Log(N/N0)
experimentales; () prediccin
0,9
-0,1
-1,1
-2,1
-3,1
12
16
20
24
Tiempo (da)
Tabla 16: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de S.Enteritidis en queso untable
base (pH 5.0) almacenado a 17 C
Parmetro
A
B
0,94
-0,16
0,03
0,06
-3,65
0,07
1
ANLISIS DE LA DESVIACIN
Fuente
SS
gl
MODELO
29,90
RESIDUAL
0,15
R ajustado
1
FISHER2
249**
97,29
2
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R ajustado: coeficiente de
2
determinacin ajustado por grados de libertad. NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da); B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).
(a)
Residuales
Valores observados
experimentales; () prediccin
0,9
-0,1
-1,1
(b)
0,33
0,23
0,13
0,03
-0,07
-0,17
-2,1
-0,27
-3,1 -3,1
-2,1
-1,1
-0,1
0,9
-3,1
Valores predichos
-2,1
-1,1
-0,1
0,9
Valores predichos
0,16 da y una cada global algo mayor a 17C que a 6C, tal como se observ con
los otros microorganismos estudiados.
Dado que S. Enteritidis creci en el queso untable base almacenado a 25C,
se caracteriz dicha curva mediante el modelo de Gompertz. En la Figura 45, puede
observarse que hubo un buen ajuste con el modelo propuesto ya que la prediccin es
coincidente con los valores experimentales. El anlisis de la varianza (Tabla 17)
2
110
1101
( ) valores
experimentales; () prediccin
Log N
8,7
7,7
6,7
5,7
4,7
3,7 0
10
Tiempo (dia)
Varios estudios han subrayado la capacidad aumentada de los
microorganismos que crecen en condiciones cidas (pH~5) o en medios de salinidad
elevada (>2% NaCl) a temperaturas ptimas para su crecimiento o cercanas
(Ferreira, 1987;Thomas, 1992). El gnero Salmonella est integrado por
microorganismos resistentes que se adaptan fcilmente a las condiciones extremas
del medio. Adems, la capacidad de adaptacin fisiolgica de Salmonella spp. se
demuestra por su capacidad de multiplicarse a valores de pH desde 4.5 a 9.5 con un
pH ptimo de crecimiento de 6.5 hasta 7.5 al igual a lo observado con respecto a la
temperatura de almacenamiento (temperatura ptima de crecimiento 37C con un
rango que va desde 2C a 54C), tal como se ha observado en el presente estudio.
Estimador
Error Estndar
4,14
0,16
0,82
0,16
4,42
0,71
7,04
0,40
ANLISIS DE LA DESVIACIN
Fuente
SS
gl
MODELO
213,98
RESIDUAL
0,24
FISHER3
668**
96,50
R ajustado
PARAMETROS BIOLGICOS
Gompertz
TG (da)
0,27
1,10
LAG (da)
5,33
PMP
-------
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R ajustado: coeficiente de
2
determinacin ajustado por grados de libertad.
TG: tiempo de generacin; VCE: velocidad de
3
crecimiento exponencial; LAG: tiempo de fase lag. NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**:
muy significativo al 1%.
8,7
(a)
Residuales
Valores observados
Figura 46: Validacin interna: Anlisis estadstico del modelo propuesto para el
crecimiento de S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25 C: a)
Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . ( )
valores experimentales; () prediccin
7,7
6,7
5,7
0,04
0,02
0
-0,02
4,7
3,7 4,1
(b)
0,06
-0,04
5,1
6,1
7,1
Valores predichos
8,1
-0,06 4,4
5,4
6,4
7,4
Valores predichos
8,4
4.4.4. L.monocytogenes
La Figura 47 exhibe el comportamiento de L.monocytogenes inoculada en el
queso untable base a pH 5,0 y almacenado a 6C, 17C y 25C. Esta experiencia se
llev a cabo tal como se describe en Materiales y Mtodos, seccin 3.4.5.4. Puede
observarse una disminucin de la poblacin, con similar perfil de inactivacin en
todos los casos aunque a 6C, se observ una leve recuperacin parcial de la
poblacin a partir de los 23 das de almacenamiento.
Figura 47: Evaluacin del comportamiento de L.monocytogenes en queso untable
base, pH 5,0 a diferentes temperaturas de almacenamiento: 6C (-- ),17C ( -- )
y
25C ( -- ); (I): desvo estandar.
es
0,8
(b)
LogNN0
LogNN0
(a)
-0,2
-0,3
-1,3
-1,2
-2,3
-2,2
-3,3 0
10
20
30
40
50
-3,2 0
LogNN0
Tiempo (da)
12
16
20
24
Tiempo (da)
0,7
-0,3
(c)
-1,3
-2,3
-3,3 0
10
20
30
40
Tiempo (da)
la posible presencia de un
Tabla 18: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de L.monocytogenes en queso
untable base (pH 5.0) almacenado a 6 C
Parmetro
A
B
1,64
-0,25
0,27
0,10
-3,02
0,18
1
Fuente
MODELO
RESIDUAL
ANLISIS DE LA DESVIACIN
FISHER2
SS
gl
51,77
0,41
215**
3
5
94,26
R ajustado
Tabla 19: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de L.monocytogenes en queso
untable base (pH 5.0) almacenado a 17 C
Parmetro
1,78
0,50
-0,11
0,05
-4,76
1,65
ANLISIS DE LA DESVIACIN1
Fuente
MODELO
RESIDUAL
2
R ajustado
1
SS
gl
21,18
0,12
3
4
FISHER2
235**
98,14
2
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R ajustado: coeficiente de
2
determinacin ajustado por grados de libertad. NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da); B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -)
Tabla 20: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de L.monocytogenes en queso
untable base (pH 5.0) almacenado a 25 C
Parmetro
1,34
0,65
-0,22
0,08
-3,36
0,37
ANLISIS DE LA DESVIACIN1
Fuente
MODELO
RESIDUAL
2
R ajustado
1
SS
gl
18,83
0,33
3
4
FISHER2
76**
94,23
2
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R ajustado: coeficiente de
2
determinacin ajustado por grados de libertad. NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da); B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).
Figura 50: Validacin interna: Anlisis estadstico del modelo propuesto para el
crecimiento de
6C
(a)
(b)
0,7
Residuales
Valores observados
experimentales; () prediccin
-0,3
-1,3
3
2
1
0
-1
-2,3
-2
-3,3
-3,3
-2,3
-1,3
-0,3
-3
0,7
-3,3
-0,2
-1,2
-0,3
0,7
0,4
0,2
0
-0,2
-2,2
-0,4
-3,2-3,2
-2,2
-1,2
-0,2
0,8
-3,3
Valores predichos
Valores observados
-1,3
17C
0,8
-2,3
Valores predichos
Residuales
Valores observados
Valores predichos
-2,3
-1,3
-0,3
0,7
Valores predichos
25C
0,7
-0,3
4
2
-1,3
-2,3
-2
-4
-3,3
-3,3
-2,3
-1,3
-0,3
-6
0,7
-3,3
Valores predichos
-2,3
-1,3
-0,3
0,7
Valores predichos
Residuales
monocytogenes en quesos.
de
demostrada por Montes y Carvajal (1998) y Basilico y Basilico (1999) sobre los
hongos, tales como A. flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus ochraceus,
Aspergillus fumigatus y Fusarium spp. Segn Soliman y Badeea (2002), este efecto
antifngico podra ser causada por el contenido de b-pineno de aceite esencial de
tomillo, ya que puede alcanzan valores de 30 a 37.6%.
En el presente estudio el tratamiento con timol en una concentracin superior
(0,3% p/p) no result en una mayor inactivacin bacteriana sino que por el contrario,
el mismo ejerci una accin protectora.
Juven y col. (1994) sugirieron que los alimentos con cierto tenor de grasa
(Materiales y Mtodos, seccin 3.1.1) podran formar una barrera protectora
alrededor de las bacterias protegindolas de los agentes antimicrobianos. Estos
estudios sugirieron tambin que la fraccin lipdica del alimento absorbe el agente
antimicrobiano, reduce su concentracin en la fase acuosa y por ende su accin
bactericida. El contenido proteico del alimento podra tambin ser un factor
influyente en la inefectividad del timol ya que la albmina de suero bovino
neutralizaba la accin antimicrobiana del timol sugiriendo formacin de complejos
entre los componentes fenlicos del timol y las protenas del alimento. Estas
reacciones podran haber prevenido toda otra formacin de complejos similares entre
compuestos fenlicos y protenas u otros componentes de la membrana celular
bacteriana que es considerada el sitio de accin blanco de los aceites esenciales
(Peter, 2004).
Es necesario evaluar tambin el comportamiento de la flora lctica frente al
timol. Nuevos estudios seran necesarios para evaluar si el timol tiene algn tipo de
efecto sobre su crecimiento lo que provocara que el accionar metablico de las BAL
se vea alterado as como tambin su capacidad competitiva. Esto, de comprobarse,
podra explicar la causa por la cual la muerte bacteriana observada tanto en S. aureus
como en S. Enteritidis a las temperaturas ensayadas es menor con timol que sin la
presencia del mismo. Es decir, el timol en cierta forma altera la capacidad
biopreservativa y competitiva de las BAL permitiendo mayor desarrollo de otra flora
acompaante.
El anlisis de modelado terciario no se pudo incluir en el estudio del
comportamiento microbiano en queso con y sin timol ya que el programa PMP no
contempla, dentro de las variables que ofrece, el agregado de este producto. Esta es
la razn por la cual no fue posible comparar las respuestas observadas y las
predichas.
Con el propsito de caracterizar las curvas de supervivencia de los
microorganismos estudiados en queso untable base adicionado con aceite esencial de
timol se
modificado.(Materiales y Mtodos,3.6.1.2).
Las Tablas 21; 22 y 23 exhiben los parmetros estimados que representan
las diferentes regiones de la curva de supervivencia junto a los estadsticos de ajuste
del modelo. El ajuste del modelo result altamente satisfactorio, obtenindose
2
valores de R ajustado por grados de libertad entre 89,3% y 99,1%. Los valores de F
muy significativos (<0,01), demostraron que el modelo fue apropiado para describir
el comportamiento observado tanto para S. aureus a 6C y 17C como para S.
Enteritidis a 17C tal como se observa en la Figura 53. La validacin del modelo fue
correcta tal como puede observarse en los grficos de valores observados y predichos
y la distribucin de residuales (Figuras 54).
En el caso del comportamiento de S.aureus en queso untable base
almacenado a 6C, el perfil de las curvas de supervivencia difiere escasamente, sobre
todo en los primeros das de almacenamiento donde la cada de la poblacin es ms
acelerada en el caso del queso sin adicin de timol (Figura 51a). El modelo de
Gompertz modificado caracteriz correctamente el cambio global observado dada la
presencia de una cola marcada (C= 4,2 ciclos; Tabla 21), mientras que en ausencia
de timol, la falta de cola marcada hizo que el modelo sobrestimara dicho valor(C=
14,4 ciclos; Tabla 9); cuando en realidad el cambio observado experimentalmente
fue de
timol=1,3
-1
da ; Bs/
timol=
0,5
-1
da ; Cc/ timol= 3,4 ciclos; Cs/ timol =0,07 ciclos). Tal como se coment anteriormente,
son varios los factores que en combinacin podran
protector observado.
(a)
0
-0,5
-1
-1,5
0,19
(b)
-0,01
-0,21
-0,41
-0,61
-2
-0,81
-2,5
-3
0
10
20
30
40
12
(c)
-0,5
-1
-1,5
-2
-2,5
-3
0
16
Tiempo (da)
Tiempo (da)
Log (N/N0)
Log (N/N0)
Log (N/N0)
() prediccin
12
Tiempo (da)
16
20
20
24
Tabla 21: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
base (pH 5.0) con timol almacenado a 6 C.
Parmetro
1,43
0,30
0,08
0,02
-4,19
0,82
ANLISIS DE LA DESVIACIN
Fuente
MODELO
RESIDUAL
SS
gl
30,97
0,06
3
4
R ajustado
FISHER
516**
99,07
-4,17
-1,33
102,50
27,11
-0,07
0,31
ANLISIS DE LA DESVIACIN
Fuente
MODELO
RESIDUAL
2
R ajustado
1
SS
1,67
0,03
gl
FISHER
3
4
55**
89,29
2
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R ajustado: coeficiente de
2
determinacin ajustado por grados de libertad. NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da); B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).
Tabla 23: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de S.Enteritidis en queso untable
base (pH 5.0) con timol almacenado a 17 C.
Parmetro
1,76
0,47
-0,20
0,06
-3,28
0,34
ANLISIS DE LA DESVIACIN
Fuente
SS
gl
MODELO
26,44
RESIDUAL
0,12
R ajustado
FISHER
367**
98,27
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R ajustado: coeficiente de
2
determinacin ajustado por grados de libertad. NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da); B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).
se
en este caso anomalas (Figura 55 a y b). Los perfiles de las curvas de supervivencia
predichas en este caso fueron similares , del tipo sigmoideo con valores semejantes
(Tablas 11 y 24) de tiempo de generacin (TGc/timol=0,51das;TGs/timol=0,54 das);
velocidad de crecimiento (VCEc/timol=0,59 LogUFC/gr /da ; VCEs/timol= 0,55
LogUFC/gr/da) y tiempo de fase lag (LAGc/timol=5,5 das; LAGs/timol=5,0 das)
aunque con una tendencia a mayor crecimiento en el caso del sistema con timol. La
observacin de las curvas experimentales de crecimiento (Figura 51c) evidencian que
S. aureus en queso untable
Figura 54: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento de S.aureus
en queso untable base (pH 5,0) con timol almacenado a 6C ; 17C; y de S.
Enteritidis en igual matriz almacenada a 17C: a) Valores observados vs valores
predichos; b) Residuales vs. valores predichos . ( ) valores experimentales;
()
prediccin.
0,8
0,22
Residuales
Valores observados
S.aureus- 6C
-0,2
-1,2
-2,2
0,12
0,02
-0,08
-3,2 -3,2
-2,2
-1,2
-0,2
0,8
-0,18 -3
Valores predichos
-2,5
-2
-1,5
-1
-0,5
Valores predichos
0,12
0,19
0,08
-0,01
Residuales
Valores observados
S.aureus- 17C
-0,21
-0,41
-0,61
-0,81
-0,81
-0,61
-0,41
-0,21
-0,01
0,04
0
-0,04
-0,08
-0,12
-0,81
0,19
Valores predichos
-0,61
-0,41
-0,21
-0,01
0,19
Valores predichos
Residuales
Valores observados
S.Enteritidis- 17C
0
-0,5
-1
-1,5
-2
0,21
0,11
0,01
-0,09
-2,5
-3 -3
-2,5
-2
-1,5
-1
Valores predichos
-0,5
-0,19
-3
-2,5
-2
-1,5
-1
Valores predichos
-0,5
( ) valores
experimentales; () prediccin
Log N
8,9
7,9
6,9
5,9
4,9
3,9 0
12
15
18
Tiempo (dia)
Tabla 24: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
base con timol (pH 5.0) almacenado a 25 C
Parmetro
Estimador
Error Estndar
A
B
4,01
0,26
0,20
0,46
5,24
0,05
7,49
0,61
ANLISIS DE LA DESVIACIN
1
3
Fuente
MODELO
RESIDUAL
2
R ajustado
SS
gl
4
314,25
0,12
FISHER
1964**
99,14
PARAMETROS BIOLGICOS
Gompertz
PMP
TG (da)
0,51
---
0,59
---
LAG (da)
5,5
---
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R ajustado: coeficiente de
2
determinacin ajustado por grados de libertad.
TG: tiempo de generacin; VCE: velocidad de
crecimiento exponencial; LAG: tiempo de fase lag.3NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**:
muy significativo al 1%
130
1301
Figura 56: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento de S.aureus
en queso untable base con timol (pH 5,0) almacenado a 25 C: a) Valores observados
vs valores predichos; b) Residuales vs. valores
predichos. ( ) valores
(a)
(b)
8,9
Residuales
Valores observados
experimentales; () prediccin
7,9
6,9
5,9
0,33
0,23
0,13
0,03
-0,07
4,9
-0,17
3,9
4
Valores predichos
-0,27 3,9
4,9
5,9
6,9
7,9
8,9
Valores predichos
5. CONCLUSIONES
132
en queso
El programa de simulacin
resultado fue relevante pues seala un punto de inicio para futuras investigaciones y
aspectos a tener en cuenta al momento de desarrollar quesos untables saborizados.
6. APNDICE
136
Este captulo incluye informacin con respecto a los mtodos estadsticos que se
utilizaron para el anlisis de los resultados, definiciones y frmulas.
6.1 Definiciones y Frmulas
6.1.1- Poblacin estadstica
Una poblacin estadstica se define como un conjunto completo de elementos
de inters. La medidas tomadas sobre los elementos de una poblacin estn
gobernadas por una distribucin de probabilidad, usualmente expresada en forma de
ecuacin matemtica, la cual relaciona la ocurrencia de un valor especfico con la
probabilidad de dicha ocurrencia.
6.1.2-Distribucin normal
Distribucin normal es el tipo de distribucin que ms comunmente se
encuentra. En general cuando se procesan los datos estadsticamente se asume que su
distribucin es normal. La siguiente frmula es la funcin de la distribucin normal y
se puede usar para
distribucin
f ( x)
1/ 2
exp (Y Y ) 2 / 2
2
(6.1)
Donde:
exp = funcin exponencial con base e
Y= medicin realizada
Y = media del total de las mediciones
= desviacin estndar
= varianza
137
1371
Yi i
Y
donde
(6.2)
Y)
i 1
N 1
(6.3)
Y)
i 1
N 1
(6.4)
(6.5)
Y t
2,n 1
(6.6)
Donde
t
/2,n-1
(6.7)
donde:
n= el nmero de sujetos en la muestra
r=el nmero de sujetos estadisticamente dependientes.
Cuando se trata de ajustar modelos estadsticos a un conjunto de datos, los
residuos se encuentran habitualmente en un espacio de menor dimensin que aqul
en el que se encontraban los datos originales. Los grados de libertad del error los
determina, precisamente, el valor de esta menor dimensin.
es
pueden dar por azar y entonces la probabilidad de que sean no debidos al azar es P=
1-0,05=0,95. Si, en cambio, el ensayo es bilateral en el mismo caso P= 1-2 = 0,90.
En muchos trabajos el nivel de significacin se denota con una , dos o tres
estrellitas. Existen tres niveles; cuando P
0,999 (
0,95 (
0,05); P
0,99 (
0,01 ) y P
140
1401
VE < VT
(NS)/(-)
**
***
tcnica compara las medias de varias muestras y verifica si todas ellas pertenecen a
la misma poblacin o si, unao ms son significativamente diferentes y provienen de
poblaciones diferentes. El ANOVA debe ser considerado en la prctica un test de
diferencias de medias a dos colas (ya que las medias en s mismas pueden aumentar o
decrecer) que opera va un test de cambio de varianza a una cola, el cual se describir
ms adelante (test F).
La variacin total que existe en una distribucin global de valores o medidas
puede ser segregada en categoras representando por un lado los efectos
identificables y por otro lado la variacin debida a causas no identificables.
La
variacin total del conjunto de datos es llamada Suma de Cuadrados Totales (SST).
Dicha suma puede dividirse en dos contribuciones: una Suma de Cuadrados debida
a la Regresin (SSR) y una Suma de Cuadrados Residual (SSE).
SST
Yi
(6.9)
i 1
(6.10)
i 1
(6.11)
MSR
SSR
p
(6.12)
Yi
Y
i
i 1
(6.13)
i 1
MSE
SSE
N
(6.14)
Los residuales se usan para evaluar el ajuste del modelo a los valores
experimentales. La suma de los residuales de cada corrida tericamente es siempre
cero, sin embargo, en la prctica puede no serlo exactamente pero debera
aproximarse.
Modelo de los parmetros de un ANOVA
Fuente
gl
Suma de Cuadrados
Media de cuadrados
SSR
DEBIDO A
LA REGRESION
RESIDUAL
TOTAL
p-1
N-p
SSR
SSE
N-1
MSR =
p-1
SSE
MSE =
N-p
SST
causas
no identificables
MSR
SSR p 1
MSE
SSE N p
(6.15)
(6.16)
nivel de significacin,
y significa que por lo menos un parmetro de los que describen la regresin tiene
efecto sobre la respuesta. Cuanto ms grande sea el F calculado mejor describir la
regresin el modelo propuesto ya que tambin significa que aumenta la razn de la
varianza debida a la regresin sobre la viarianza debida a causas no identificables.
SSR 100
SST
(6.17)
2
aj
1
SST N 1
2
(6.18)
ri
Yi
Si el trmino independiente
desplaza:
ri
Yi
ri
Yi
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