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ESTRATEGIAS DE PURIFICACIN - UN ENFOQUE SIMPLE

Aplicar un enfoque sistemtico para el desarrollo de una estrategia de purificacin. El primer paso es para describir el
escenario bsico para la purificacin. Consideraciones generales responden a preguntas tales como: Cul es el uso
previsto del producto? Qu tipo de material de partida se encuentra disponible y cmo debe ser manejado? Cules son
los problemas de pureza en relacin con el material de origen y el uso previsto del producto final? Lo que ha de ser
eliminado? Lo que debe ser eliminado por completo? Cul ser la escala final de la purificacin? Si hay una necesidad de
ampliacin, qu consecuencias tendr esto en las tcnicas de purificacin elegidos? Cules son las restricciones
econmicas y qu recursos y materiales disponibles?
La mayora de los protocolos de purificacin requieren ms de un paso para lograr el nivel deseado de pureza del producto.
Esto incluye los pasos necesarios cualquier acondicionado para transferir el producto de una tcnica en condiciones
adecuadas para llevar a cabo la siguiente tcnica.
Cada paso en el proceso har que algo de prdida de producto. Por ejemplo, si se supone un rendimiento del 80% en cada
paso, esto se redujo a slo el 20% de rendimiento global despus de las etapas de procesamiento de 8 como se muestra
en la Figura 1. En consecuencia, para alcanzar los objetivos de rendimiento y pureza con el nmero mnimo de pasos y el
diseo ms simple posible, no es eficiente para agregar un paso a otro hasta que se hayan cumplido los requisitos de
pureza.
En ocasiones, cuando una muestra es fcilmente pureza disponible puede lograrse simplemente aadiendo o repitiendo
los pasos. Sin embargo, la experiencia demuestra que, incluso para las aplicaciones ms exigentes, de alta pureza y el
rendimiento se puede lograr de manera eficiente en menos de cuatro etapas de purificacin bien elegida y optimizada.
Las tcnicas deben ser organizadas en una secuencia lgica para evitar la necesidad de etapas de acondicionamiento y las
tcnicas cromatografcas seleccionadas apropiadamente para utilizar el menor nmero de etapas de purificacin como
sea posible.

Limitar el nmero de pasos en un procedimiento de purificacin

PREPARACIN
La necesidad de obtener una protena, de manera eficiente, econmica y con suficiente pureza y cantidad, se aplica a cada
purificacin. Es importante establecer objetivos para la pureza, la cantidad y el mantenimiento de la actividad biolgica y
para definir el marco econmico y tiempo para el trabajo. Todas las propiedades de la informacin relativa a la protena
diana y los contaminantes ayudarn durante el desarrollo de la purificacin. Algunos experimentos sencillos para
caracterizar la muestra y la molcula diana son una excelente inversin.
Desarrollo de ensayos analticos rpidos y fiables es esencial para seguir el progreso de la purificacin y evaluar su eficacia.
Preparacin de la muestra y los procedimientos de extraccin deben ser desarrollados antes de la primera etapa de
purificacin cromatogrfica.
Con informacin de fondo, ensayos y procedimientos de preparacin de muestras en lugar de la estrategia de purificacin
fase tres puede ser considerado.

TERCERA FASE ESTRATEGIA DE PURIFICACIN


Imagnese la purificacin tiene tres fases: captura, Intermedio Purificacin y pulido. En la estrategia de tres fases objetivos
especficos son asignados a cada paso en el proceso:
En la fase de captura son los objetivos para aislar, concentrar y estabilizar el producto de destino.
Durante la fase de purificacin intermedia el objetivo es eliminar la mayor parte de las impurezas a granel, tales como
otras protenas y cidos nucleicos, endotoxinas y virus. En la fase de pulido el objetivo es lograr una alta pureza mediante
la eliminacin de las impurezas de traza restantes o sustancias estrechamente relacionadas. La seleccin y la combinacin
ptima de tcnicas de purificacin para la captura, Intermedio Purificacin y pulido es crucial para asegurar el desarrollo
de mtodos rpidos, un tiempo ms corto al producto puro y una buena economa.
El proceso de purificacin final debera idealmente consistir en la preparacin de muestras, incluyendo la extraccin y
clarificacin cuando se requiera, seguido por tres grandes etapas de purificacin, como se muestra en la Figura 2. El
nmero de pasos que se utilizan siempre depender de los requisitos de pureza y el uso previsto para la protena.

Directrices para la purificacin de protenas


Las directrices para la purificacin de protenas que se muestra aqu se pueden aplicar a cualquier proceso de purificacin
y son una sugerencia en cuanto a cmo un enfoque sistemtico se puede aplicar a la elaboracin de una estrategia de
purificacin eficaz. A modo de recordatorio se resaltarn estas directrices en su caso a travs de los siguientes captulos.
Definir objetivos: la pureza, la actividad y la cantidad necesaria de producto final para evitar el sobre o bajo el desarrollo
de un mtodo.
Definicin de las propiedades de la protena diana y las impurezas crticos: para simplificar la seleccin y optimizacin
tcnica.
Desarrollar ensayos analticos: para la deteccin rpida de la actividad de la protena / recuperacin y contaminantes
crticos.
Reducir al mnimo la manipulacin de muestras en cada etapa: para evitar largos procedimientos que corren el riesgo de
perder la actividad / reduccin de la recuperacin.
Minimizar el uso de aditivos: pueden necesitar ser eliminado en una etapa de purificacin adicional o aditivos pueden
interferir con los ensayos de actividad.
Eliminar los contaminantes dainos principios: por ejemplo, las proteasas.
Utilice una tcnica diferente en cada etapa: para tomar ventaja de caractersticas de la muestra que se pueden utilizar
para la separacin (tamao, carga, hidrofobicidad, ligando especificidad).
Minimizar el nmero de pasos: pasos adicionales reducen el rendimiento y aumentan el tiempo, se combinan pasos
lgicamente.

PREPARACIN
Antes de que empieces:
La necesidad de obtener una protena, de manera eficiente, econmica y con suficiente pureza y cantidad, se aplica a
cualquier purificacin, de la preparacin de un extracto de protena enriquecido para la caracterizacin bioqumica de la
produccin a gran escala de una protena recombinante teraputico. Es importante establecer objetivos para la pureza y
cantidad, mantenimiento de la actividad biolgica y la economa en trminos de dinero y tiempo. Requisitos de pureza
deben tener en cuenta la naturaleza del material de origen, el uso previsto del producto final y cualquier problema de
seguridad especial. Por ejemplo, es importante diferenciar entre los contaminantes que deben ser eliminados y aquellos
que pueden ser tolerados. Otros factores que tambin pueden influir en la priorizacin de objetivos. Los altos
rendimientos suelen ser un objetivo clave, pero pueden ser menos crucial en los casos en que una muestra es fcilmente
disponibles o se requiere el producto slo en pequeas cantidades.
El desarrollo del mtodo extensiva puede ser imposible sin recursos, tales como un sistema de cromatografa de diseo
KTA . Del mismo modo, la presin del tiempo combinado con un cambio de ensayo lenta dirigir hacia la menos extensa
de exploracin y optimizacin. Todas las propiedades de la informacin relativa a la protena diana y los contaminantes
ayudarn durante el desarrollo de purificacin, lo que permite ms rpido y ms fcil la seleccin tcnica y optimizacin,
y evitar condiciones que puedan inactivar la protena diana. Desarrollo de ensayos analticos rpidos y fiables es esencial
para seguir el progreso de la purificacin y evaluar la eficacia (rendimiento, actividad biolgica, recuperacin).

Definir los objetivos


Objetivo: Establecer los objetivos mnimos de pureza y cantidad, mantenimiento de la actividad biolgica y la economa
en trminos de dinero y tiempo. Definir los requisitos de pureza de acuerdo con el uso final del producto. Ejemplos ley de
pureza se muestran a continuacin.

Identificar los contaminantes: Identificar la naturaleza de los posibles contaminantes restantes tan pronto como sea
posible. La afirmacin de que una protena es pura> 95% (es decir, protena objetivo constituye 95% de la protena total)
est lejos de una garanta de que la pureza es suficiente para una aplicacin deseada. Lo mismo es cierto para la
declaracin comn "la protena era homogneo por Coomassie manchado SDS-PAGE". La pureza de 95% puede ser
aceptable si el 5% restante consiste en impurezas inofensivas. Sin embargo, incluso las impurezas de menor importancia
que pueden ser biolgicamente activos podran causar problemas significativos tanto en aplicaciones teraputicas y de
investigacin. Por tanto, es importante diferenciar entre los contaminantes que deben ser eliminados por completo y los
que pueden reducirse a niveles aceptables. Dado que los diferentes tipos de material de partida contendrn diferentes
perfiles de contaminantes que presentarn diferentes problemas de contaminacin.
Es mejor que sobre-purificar a bajo purificar por: Aunque el nmero de etapas de purificacin debe ser minimizada, la
calidad del producto final no debe ser comprometida. Los resultados posteriores podran ser cuestionados si pureza de la
muestra es baja y los contaminantes son desconocidos. Los contaminantes que degradan o inactivan la protena o
interfieren con los anlisis deben ser removidos tan pronto como sea posible. La necesidad de mantener la actividad
biolgica debe ser considerada en todas las etapas de purificacin durante el desarrollo. Es especialmente beneficioso si
las proteasas se eliminan y protena diana transfirieron a un medio ambiente durante el primer paso.
Un proceso de produccin aguas abajo debe lograr la pureza requerida y recuperacin con total seguridad y fiabilidad, y
dentro de un marco econmico determinado. La economa es un tema muy complejo. En la produccin comercial el
tiempo de comercializacin puede anular cuestiones tales como la optimizacin de la recuperacin, la capacidad o

velocidad. La robustez y la fiabilidad son tambin de gran preocupacin, ya que un fracaso lote puede tener importantes
consecuencias.
Los problemas de seguridad especial pueden estar implicadas en la purificacin de productos biofarmacuticos, como la
deteccin o eliminacin de agentes infecciosos, protenas, contaminantes inmunognicas y peligros tumorignicas. Puede
ser necesario el uso de tcnicas de anlisis dirigidos a contaminantes especficos, a fin de demostrar que se han eliminado
a niveles aceptables.

Definicin de las propiedades de la protena diana e impurezas crticas


Objetivo: Determinar una "ventana de estabilidad" para la protena diana para facilitar la seleccin y optimizacin de las
tcnicas y para evitar la inactivacin de la protena durante la purificacin.
Compruebe ventana estabilidad de la protena diana para al menos pH y la fuerza inica. Toda la informacin relativa a
las propiedades de la protena diana y los contaminantes contribuir a orientar la eleccin de las tcnicas de separacin y
las condiciones experimentales para la purificacin. Informacin de base de datos para el objetivo, o protenas
relacionadas, pueden dar tamao, punto isoelctrico (pI) y los datos de hidrofobicidad o solubilidad. uno nativo y dos
pginas dimensiones pueden indicar la complejidad de la muestra y las propiedades de la protena objetivo y los
principales contaminantes. Particularmente importante es el conocimiento de la ventana de estabilidad de la protena de
modo que se evita la inactivacin irreversible. Es recomendable comprobar la ventana de estabilidad de la protena diana
para, al menos, el pH y la fuerza inica. La Tabla 1 muestra cmo las diferentes propiedades de la protena objetivo pueden
afectar a una estrategia de purificacin.

Desarrollar ensayos analticos


Objetivo: Para seguir el progreso de una purificacin, para evaluar la eficacia (rendimiento, actividad biolgica,
recuperacin) y para ayudar durante la optimizacin. Seleccionar ensayos que son rpidos y fiables. Para avanzar de
manera eficiente durante el desarrollo del mtodo de la eficacia de cada paso debe ser evaluada. El laboratorio debe tener
acceso a los siguientes ensayos:
Una rpida, ensayo fiable para la protena diana

Determinacin de la pureza
Determinacin de protenas totales
Los ensayos para las impurezas que deben ser eliminadas
La importancia de un ensayo fiable para la protena diana no debe subestimarse. Al probar fracciones cromatogrficas
asegurar que los tampones usados para la separacin no interfieren con el ensayo. La pureza de la protena diana es ms
a menudo estimado por SDS-PAGE, electroforesis capilar, cromatografa de fase invertida o espectrometra de masas.
Ensayos de Lowry o Bradford se utilizan con mayor frecuencia para determinar la protena total. El ensayo de Bradford es
adecuado particularmente para muestras en las que hay un alto contenido de lpidos que puede interferir con el ensayo
de Lowry.
Para la purificacin de protenas a gran escala a menudo es esencial la necesidad de ensayar protenas diana e impurezas
crticos. En la prctica, cuando una protena se purifica con fines de investigacin, es lento para identificar y establecer
ensayos especficos para los contaminantes dainos demasiado tiempo. Un enfoque prctico es purificar la protena a un
cierto nivel, y a continuacin, realizar SDS-PAGE despus de un perodo de almacenamiento para verificar la escisin de la
proteasa. Experimentos de control adecuados, incluidos en los ensayos para la bioactividad, ayudarn a indicar si las
impurezas estn interfiriendo con los resultados.

TERCERA FASE ESTRATEGIA DE PURIFICACIN


PRINCIPIOS
Con informacin de fondo, ensayos y preparacin de muestras y procedimientos de extraccin en lugar de las tres
estrategias de purificacin de fase puede ser aplicado (Figura 3). Esta estrategia se utiliza como una ayuda para el
desarrollo de procesos de purificacin de protenas teraputicas en la industria farmacutica y es igualmente eficiente
como una ayuda en el desarrollo de los esquemas de purificacin en el laboratorio de investigacin.

Asignar un objetivo especfico para cada paso en el proceso de purificacin.


En la Estrategia trifsico de un objetivo especfico se asigna a cada paso. El problema de purificacin asociado con un paso
en particular depender en gran medida de las propiedades del material de partida. Por lo tanto, el objetivo de una etapa
de purificacin variar de acuerdo con su posicin en el proceso, es decir, al principio para el aislamiento del producto de
la muestra bruta, en el medio para la purificacin adicional de la muestra parcialmente purificada, o en el extremo para
una limpieza final de un producto casi puro.
La estrategia de tres fases garantiza el desarrollo de mtodos ms rpidos, un tiempo ms corto al producto puro y una
buena economa.
En la fase de captura son los objetivos para aislar, concentrar y estabilizar el producto de destino. El producto debe ser
concentr y se transfiere a un entorno que conservar potencia / actividad. En el mejor, tambin se puede lograr una
importante eliminacin de otros contaminantes crticos.

Durante la fase de purificacin intermedia los objetivos son para eliminar la mayora de las impurezas a granel, tales como
otras protenas y cidos nucleicos, endotoxinas y virus.
En la fase de pulido mayora de las impurezas ya se han retirado a excepcin de cantidades traza o sustancias
estrechamente relacionadas. El objetivo es lograr la pureza final.
Cabe sealar que esta estrategia de tres fases no significa que todas las estrategias deben tener tres etapas de purificacin.
Por ejemplo, la captura y purificacin intermedia pueden ser alcanzable en un solo paso, como la purificacin intermedia
puede y pulido. Del mismo modo, las demandas de pureza pueden ser tan bajas que una etapa de captura rpida es
suficiente para lograr el resultado deseado, o la pureza del material de partida puede ser tan alta que slo se necesita una
etapa de pulido. Para la purificacin de protenas teraputicas cuarta o quinta etapa de purificacin puede ser necesario
para cumplir con las ms altas exigencias de pureza y de seguridad. La seleccin ptima y la combinacin de tcnicas de
purificacin para la captura, Intermedio Purificacin y pulido es crucial para un proceso de purificacin eficaz.

SELECCIN Y COMBINACIN DE TCNICAS DE PURIFICACIN

Reducir al mnimo la manipulacin de muestras


Minimizar el nmero de pasos
Utilizar diferentes tcnicas en cada paso

Objetivo: Ruta ms rpida a un producto de la pureza requerida.


Para cualquier separacin cromatogrfica cada tcnica diferente, ofrecer un rendimiento diferente con respecto a la
recuperacin, resolucin, velocidad y capacidad. Una tcnica puede ser optimizada para centrarse en uno de estos
parmetros, por ejemplo, la resolucin, o para lograr el mejor equilibrio entre dos parmetros, tales como la velocidad y
capacidad. Una separacin optimizada para uno de estos parmetros producir resultados muy diferentes en apariencia
de los producidos utilizando la misma tcnica, pero se centr en un parmetro alternativo. Ver, por ejemplo, los resultados
mostrados en la pgina 49, donde se utiliza intercambio inico para una captura y de una etapa de pulido.
Seleccionar una tcnica para cumplir los objetivos para la etapa de purificacin.
Capacidad, en el modelo simple que se muestra, se refiere a la cantidad de protena diana cargado durante la purificacin.
En algunos casos la cantidad de muestra que puede ser cargado puede estar limitado por volumen (como en la filtracin
en gel) o por las grandes cantidades de contaminantes en lugar de la cantidad de la protena diana.
Velocidad, es de la mayor importancia en el comienzo de una purificacin donde los contaminantes tales como las
protenas deben ser eliminados lo ms rpidamente posible.
Recuperacin, se vuelve cada vez ms importante que los beneficios de purificacin debido a una apreciacin del valor
del producto purificado. Recuperacin est influenciada por procesos destructivos en la muestra y las condiciones
desfavorables en la columna.
Resolucin, se consigue mediante la selectividad de la tcnica y la eficiencia de la matriz cromatogrfica para producir
picos estrechos. En general, la resolucin es ms difcil de lograr en las etapas finales de purificacin cuando las impurezas
y protena diana es probable que tengan propiedades muy similares.
Cada tcnica ofrece un equilibrio entre la resolucin, la velocidad, la capacidad y la recuperacin y deben ser seleccionados
para satisfacer los objetivos de cada etapa de purificacin. En general, la optimizacin de uno cualquiera de estos cuatro

parmetros slo puede lograrse a expensas de las otras y una etapa de purificacin ser un compromiso. La importancia
de cada parmetro variar dependiendo de si una etapa de purificacin se utiliza para la captura, purificacin intermedia
o de pulido. Esto dirigir la optimizacin de los parmetros crticos, as como la seleccin de los medios de comunicacin
ms adecuados para la etapa.
Las protenas se purifican usando tcnicas de purificacin cromatogrficas que separan segn las diferencias en
propiedades especficas, como se muestra en la Tabla 3.

Elija combinaciones lgicas de las tcnicas de purificacin a partir de los principales beneficios de la tcnica y la condicin
de la muestra al principio o al final de cada paso.
Reducir al mnimo la manipulacin de muestras entre etapas de purificacin mediante la combinacin de tcnicas para
evitar la necesidad de acondicionamiento de la muestra.
Evitar medidas adicionales de acondicionamiento de muestra.
El producto debe ser eluy de la primera columna en condiciones adecuadas para las condiciones de inicio de la siguiente
columna.
Para cualquier etapa de captura, seleccionar la tcnica que muestra la fuerte unin a la protena diana mientras que la
unin como algunos de los contaminantes como sea posible, es decir, la tcnica con la ms alta selectividad y / o capacidad
de la protena de inters.
Considere el uso tanto de aniones y cromatografa de intercambio catinico para dar diferentes selectividades dentro de
la misma estrategia de purificacin.