Jhon Edison Dueas, German Jos Sanchez , Julio Cern , Miguel Angel Duran

Grupo A. Biquimica II

FIGURA 1
OBJETIVO: SE ANALIZA LA PRESENCIA Y O FALTA DE UNA
POR UNA DE LAS DIVERSAS SUSTANCIAS.
El CTP se requiere para la sntesis del intermedio CDP-diglicrido
del cido fosfatdico presente en las vesculas. En la presencia de
serina, CDP-diglicrido se convierte en PS por la enzima sintetasa
PS.La omisin de uno de los componentes result en menos o
ninguna sntesis de fosfolpidos amino
Se concluye:
1- Cuando CTP fue omitido de la incubacin, algunos aminofosfolpidos se sintetizaron, Esto es probablemente debido a la
presencia de una pequea cantidad de CDP-diglicrido en la
membrana de las vesculas
2- Cuando el lisado aislado de tipo salvaje E. coli, que es la fuente de la enzima sintetasa
PS, se qued fuera de la mezcla de reaccin, no se sintetiz amino-fosfolpido
3 Mg no es esencial para la sntesis de PS en la membrana interna AD93 vesculas, pero
tena un efecto estimulante
4 En ausencia de vesculas ISO no se sintetizaron lpidos.
LA DISTRIBUCIN TRANSMEMBRANA DE LA
SINTETIZADO
SE
DETERMIN
UTILIZANDO
FLUORESCAMINA. (FIG 2)

PE-RADIOMARCADA RECIN
AMINO-REACTIVO
QUMICO

FIGURA. 2: muestra el anlisis de HPTLC de una muestra antes (carril 1) y despus del
tratamiento (carril 2) con fluorescamina 2 mM durante 15 s.
FLUORESCAMINA 2 MM DURANTE 15 S: Estos parmetros fueron elegidos por dos
razones. En primer lugar, la cantidad de PE que se hace reaccionar con fluorescamina no
aument con concentraciones superiores a 2 mM, lo que sugiere que fluorescamina 2 mM
fue capaz de etiquetar todos los grupos amino accesibles. En segundo lugar, para minimizar
la penetracin de la membrana se utiliz el menor tiempo posible tcnicamente de 15 s. En
estas condiciones 2 mM fluorescamina etiqueto al menos 85% de la PE en las que las
vesculas se abrieron por octilglucsido
los 2 puntos de FL-PE y PE que parecen se refiere al PE que ha reaccionado con la
fluorescamina que es aprox del 85%, y un porcentaje de pe que no reacciona pero
que aparece en la grafica, haciendo parte del pe sintetizado en total

CARRIL 1: en ausencia de fluorescamina y octiglucosido, se evidencia la cantidad y

presencia fuerte de PE en contraste de PS casi difuso y la ausencia de las versiones
reactivas (FL-PE, FL-PS) porque sus respectivos reactivos estn ausentes.
CARRIL 2: se evidencia mediante la presencia de fluorescamina + 15sg en hielo+
ausencia de octylglucosido, la deteccin de los fosfolpidos presentes (FL-PE, PE, PS)
se muestra la intensidad de la presencia deL DERIVADO DE FLUORESCAMINA PE
menos fuerte y la presencia fuerte de PE; adems de una presencia dbil de PS. Esto
comprueba la efectividad e idoneidad del reactivo en la deteccin de fosfolpidos, la
determinacin de la accesibilidad de PE a la sustancia qumica amino-reactiva, as
como su capacidad para infiltrarse en ellos.
La razn para elegir fluorescamina para la determinacin de la distribucin de la PE recin
sintetizada es su rpida tasa de reaccin (t1 / 2 de 200 a 500 ms) con grupos amino
CARRIL 3: Para comprobar si la cantidad de fluorescamina aadida fue suficiente
para convertir todo el conjunto de PE presente en las vesculas, se aadi a la
fluorescamina vesculas solubilizados con octilglucsido 40 mM, el cual se convierte
en un mtodo importante en el reconocimiento, integrabilidad y facilidad de reaccin
de la fluorescamina con PE, expresado en un punto color intenso en la grfica

FIGURA 2B: Las condiciones ptimas para la determinacin de la accesibilidad de PE

a la sustancia qumica amino-reactiva se establecieron mediante la incubacin de
vesculas ISO, que contiene PE con diferentes concentraciones de fluorescamina, ya
sea para 15 o 30 s.

E n la figura 2B tenemos una convergencia de factores implicados en la capacidad de

reaccin de fluorescamina a diferentes concentraciones, vs porcentaje de DERIVADO DE
FLUORESCAMINA PE producido, vs presencia de octylglicosilato(crculos con presencia y
cuadrados sin presencia), vs sntesis parada a los 15sg(cuadros y crculos negros) y parada
a los 30sg( cuadros y crculos sin color). Estos factores nos permiten concluir de la grafica:
Se puede comprobar por valores en la grafica que el tiempo de 15sg y la
concentracin de 2mM de de fluorescamina usados en el procedimiento si son
optimos para una reactividad casi completa de la misma en presencia del fosfolpido
En presencia de octylglicosilato, aumentar el tiempo de incubacin en 30 sg, permite
obtener mayores porcentajes de DERIVADO DE FLUORESCAMINA, inclusive en un
rango de variabilidad en la concentracin.
FIGURA 3
Luego que se ha alcanzado la etapa de sntesis de PE in vitro, dada su formacin para una
vescula ISO dadas las condiciones que se mantienen cuando se alcanza una elevada
cantidad sustancial de PE, este puede ser transportado a travs de la membrana, por ello se
une rgano fluorescente (Flurescamina), as la forma de FL-PE en determinado tiempo
alcanza una de relacin del 35 % de PE fuera de la membrana, en relacin al transporte de
fosfolpidos endgenos, de acuerdo a esto y otros factores que influyen en el proceso, de
acuerdo a grafica se puede concluir que:
A medida que va aumentando el nivel de PE, se va favoreciendo en la formacin de
FL-PE, con ello el transporte a travs de la membrana, este transporte al cabo de 15 min
alcanza una relacin 35% a 65% en el transporte de fosfolpidos endogenos

La accin de otros factores extras como la presencia de ATP no determinaron que el

proceso requiriese de este para desarrollar el proceso, el desarrollo de proceso se lleva a
cabo normalmente y no se altera.
La accin de N-etilmaleimida o con una combinacin de ditiotreitol y yodoacetamida
sobre las vesculas (ISO) tampoco mostro efecto sobre el proceso, por el cual no afecta la
funcionalidad de la actividad
Las vesculas fueron solubilizados con octilglucsido 40 mM para que se diera la integralidad
en la reaccin de fluoresamina con PE
FIGURA 4, 5 y 6
De acuerdo con la presencia o no de CTP y serina, en las sntesis de
amino-fosfolipidos este se puede o no relacionar con la fluorescencia,
que
determina
el
movimiento
transmembranal
de
Fosfatidiletanolamina (PE). As de acuerdo al mecanismo que puede
ser llevado a cabo, cuando no hay presencia de CTP y serina el
proceso simplemente no tiene un completa funcionalidad ya que, se
puede producir la sntesis de algn amino-fosfolipido pero este no es
suficiente para cumplir el resto del proceso.
Ya en presencia de CTP, el proceso puede seguir desde su origen
una serie de pasos en la formacin de PE y que luego se pasa al
siguiente nivel que en la unin de PE con el rgano fluorescente que permite as el
movimiento transmembranal en la forma de FL-PE o como fosfolpido endgeno. Otros
factores pueden suceder al tiempo con el proceso pero no tienen un efecto notorio sobre
este, algunos por ejemplo pueden contribuir en el proceso de conversin como el
octylglucoside y su concentracin de 40 mM sobre una mayor formacin de fosfolpidos
endgenos o relacionados con el fluorescente a partir de PE
La figura muestra una lmina correspondiente a una HPTLC (Cromatografa en Capa Fina
de Alto Rendimiento/High performance thin layer chromatography) de un sistema in-vitro
diseado para evaluar la sntesis de fosfatidiletanolamina (PE) y su capacidad o accesibilidad
para unirse a la fluroescamina (un compuesto fluorescente que independientemente no
proyecta luz pero una vez unido a grupos amino, caractersticos de la PE, genera luz
apreciable). A la vescula de membrana de E-Coli AD93 con las membranas al derecho ,
es decir right side out, se les agreg un compuesto de serina etiquetada con [14C] en la cara
citoslica de la membrana interna (es decir en el lumen de la vescula) del cual la propia
membrana puede obtener PE. In vivo la serina es transportada a travs de la membrana
interna por varios transportadores dependientes de fuerza protn motriz (pmf) la cual en el
sistema presentado (in vitro) es reemplazada por CTP y una enzima denominada PS
sintentasa por lo que la ausencia de pmf no afecta la sntesis de PS que luego es convertida
en PE. Podemos ver el proceso anterior en lmina presentada donde a partir de la luz de la
vescula (origen) la serina se desplaza primero con CTP a travs de la fila 1 hasta convertirse
en PE , luego en la lmina 3 se agrega fluorescamina (FL) dando como resultado FL-PE que
se desplaza hacia la membrana externa y es visto por fluorescencia en la lamina 4 . La
lamina 1 es un control que tiene solo serina y CTP. Evidentemente PE si se desplaza desde
la membrana interna hacia la membrana externa.
La evolucin a travs del tiempo de la sntesis de aminocidos marcados con fosfolpidos
-14C y de la aparicin de la PE en la vesicula rigth side out de AD93 con CTP en el lumen
se muestra en la figura 5. Aqu vemos que despus de 5 min ya alrededor de 80-90% de la

PS sintetizada en las vesculas con CTP convirti en PE. Tambin evidencia que a cantidad
de lpidos sintetizados en las vesculas freeze taw (congelado descongelado) de CTP y
lisado fue de aproximadamente 7 veces mayor que en el experimento de control en el que se
aadieron estos componentes a la suspensin de vesculas despus del procedimiento de
congelacin-descongelacin.
Bibliografia
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1302407/pdf/12496099.pdf
http://www.cornellbiochem.org/menon/pdfs1/2002_watkins_menon_Biol_Chem.pdf
http://sbcb.bioch.ox.ac.uk/users/stansfeld/4.pdf
http://what-when-how.com/molecular-biology/fluorescamine-molecular-biology/
https://books.google.com.co/books?
id=hAPSBgAAQBAJ&pg=PA180&lpg=PA180&dq=phospholipid+transmembrane+movement&
source=bl&ots=eq_KU6a8Xj&sig=xpp0nNjp7Q1Dvrx1DnOkZhWQvM&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwiHovrju47MAhWOPB4KHeMfDVAQ6AEIVjAH#v=
onepage&q=phospholipid%20transmembrane%20movement&f=false