Engineering of ultra-small diagnostic

nanoprobes through oriented conjugation of

single-domain antibodies and quantum dots
Protocol Exchange
(2012)
doi:10.1038/protex.2012.042
Published online
22 August 2012
El enfoque comn de bioimagen , la deteccin y el diagnstico con nanopartculas es
hacer uso de la especificidad y avidez de los anticuerpos monoclonales ( mAb ) para la
orientacin ( Fig. 1a , b ) 1,2 . Aunque varios conjugados de mAb - nanopartculas se han
utilizado para el etiquetado del biomarcador , estos nanosondas funcionalizadas son
grandes , lo que limita el nmero de ligandos que se pueden vincular a la superficie de
una nanopartcula , impide la distribucin intratumoral de nanosondas debido a la presin
intersticial del tumor , y limita su intracelular y intratissular penetration3 . Las
inmunoglobulinas G ( IgG ) tiene un peso molecular de 150 kDa y un tamao medio de
14,5 8,5 4 nm , lo que limita considerablemente su uso para targeting4 . Por otra parte
, las condiciones de conjugacin de mAb utilizando tcnicas convencionales proporcionan
las nanosondas con orientacin irregular de los mAbs sobre la superficie de las
nanopartculas y, a menudo provocan IgG de despliegue (Fig. 1c ) 5 . Fragmentos de
anticuerpos ms pequeos conjugados con las nanopartculas de una manera altamente
orientado pueden convertirse en una alternativa atractiva como componentes de los ms
pequeos posibles nanosondas dirigidos .
IgG estn compuestas de dos cadenas ligeras idnticas y dos cadenas pesadas idnticas
( Fig. 1b ) . Una cadena ligera contiene un dominio variable ( VL) y un dominio constante
( CL ) , y una cadena pesada tiene un dominio variable ( VH ) y tres dominios constantes
(canales ) . Los sitios de unin a antgeno de IgG se forman por asociacin de los
dominios variables , VL - VH . Tres enlaces disulfuro intercatenarios garantizar la
estabilidad y la actividad funcional de la IgG ( Fig. 1a , b ) . Como sulfhidrilos libres de Ab
pueden ser tiles en una reaccin de conjugacin con nanopartculas , el enlace disulfuro
en la regin bisagra de la IgG debe reducirse selectivamente para obtener un fragmento
funcionalmente activo parcialmente escindido pesada - cadena ligera de Ab ( 75 kDa , la
fig. 1c ) .
Figura 1 . Representacin esquemtica de las estructuras de anticuerpos de tamao
completo (ABS) , sus fragmentos , y diferentes enfoques para su vinculacin a las
nanopartculas .
( a) La estructura en forma de Y de un Ab de tamao completo , que es el ligando que se

adjunta a la nanopartcula ; las dos cadenas ligeras ( regiones variables ) y las cadenas
pesadas ( regiones constantes ) se muestran en la violeta y rojo , respectivamente . Los
sitios funcionales especficos en los cuales el Ab se puede unir antgenos se muestran en
verde . Los grupos que se pueden utilizar para la unin a las nanopartculas se muestran
en amarillo .
( b ) Un modelo tridimensional de un Ab sobre la base de datos de cristalografa de rayosX . La estructura de Ab fue tomado de 1IGY entrada del Protein Data Bank ( PDB) . Las
cadenas ligeras se muestran en naranja y cian , cadenas pesadas , de color amarillo y
verde. Residuos de hidratos de carbono se muestran en prpura .
( c ) La fragmentacin de un Ab Ab en fragmentos funcionales y no funcionales despus
de la reduccin de los enlaces disulfuro.
( d ) La fragmentacin de la cadena pesada llama Ab ( HCAb ) resulta en fragmentos Ab
de dominios variables individuales ( anticuerpos de dominio nico , sdAbs ) .
Las tcnicas anteriores y los mtodos alternativos
En trminos de aumentar el nmero de Abs funcionalmente activos en la superficie de las
nanopartculas , la integridad de los sitios de unin de Ab y la orientacin adecuada de
Abs despus de la conjugacin son las dos condiciones cruciales . Comercial sondas Ab nanopartculas , por ejemplo , Ab - de puntos cunticos ( QD ) nanosondas se hacen por
la conjugacin de los fragmentos de completamente reducido Abs con grupos amino
sobre la superficie de puntos cunticos ( fig. 1c ) 5,6 . La reduccin completa de Abs
interrumpe la integridad de los sitios de reconocimiento , cada uno de los cuales est
formado por los dominios variables de una pesada y una cadena ligera unidas por enlaces
disulfuro , debido a que estos tambin se reducen . Otras estrategias conocidas para Ab
acoplamiento covalente a puntos cunticos requieren un ligando de pasivacin unido a la
superficie cuntica para hacer posible el uso de carbodiimida ( - COOH ) , NHS ster ( NH2 ) , o maleimida ( - SH ) qumica routes8 , 9 . Estos enfoques no son especficos para
el sitio de conjugacin, y con ellos se obtienen nanosondas con orientacin irregular de
Abs en la superficie de las nanopartculas ( Fig. 2a ) .
Recientemente, hemos desarrollado un procedimiento de conjugacin avanzada basada
en la reduccin selectiva del enlace disulfuro en la regin bisagra de la IgG , dejando los
enlaces entre las cadenas pesada y ligera intacta ( Fig. 1c ) 7 . Esto asegura un alto
rendimiento de medio -anticuerpos funcionalmente activos , que pueden ser purificados y
covalentemente conjugado con puntos cunticos por mtodos de qumica sulfo - SMCC
para obtener nanosondas con sitios de reconocimiento intactas y orientaciones
homogneos de Abs relacin a la superficie QD . Estas sondas , aunque bastante grande
en tamao , exhiben una capacidad de reconocimiento de diez veces mayor en
comparacin con nanoprobes7 convencional . A pesar de esta mejora , el enfoque
desarrollado no siempre garantiza la orientacin uniforme de los fragmentos funcionales
de Ab en la superficie QD , por lo tanto , son necesarios nuevos enfoques para la
conjugacin direccional .
Una estrategia para superar los problemas mencionados anteriormente es disear
fragmentos Ab muy pequeas pero funcional , modificarlos de modo que slo uno , sitio
nico por fragmento es accesible para la conjugacin con el vehculo ( por ejemplo , una

nanopartcula ) , y entregar muchos de estos fragmentos en un solo portador ( fig. 2b ) .

Es incluso posible obtener nanosondas multivalentes , donde los fragmentos activos
pequeas , funcionalmente diferentes de Abs contra diferentes antgenos