Actualizacin II-2014

Prcticas No. 13 a 15, Mdulo 5

TCNICAS

CROMATOGRFICAS: CCD y CC
Laboratorio de Qumica Orgnica I (1000035)
1. Qu se entiende por?
a. Cromatografa: es uno de los principales mtodos para la separacin de
especies qumicas estrechamente relacionadas en mezclas complejas. La
cromatografa es un mtodo fsico de separacin basado en la distribucin de
los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o
estacionaria y otra mvil.
b. Sistema cromatogrfico: sistema que se emplea para efectuar una
cromatografa, comprende la fase mvil, estacionaria y la muestra a analizar y
el material de soporte.
c. Material de soporte: es un slido que retiene y ubica la fase estacionaria de tal
forma que haya la mayor superficie de contacto posible con la fase mvil.
d. Fase estacionaria: consiste en partculas, generalmente slidas, pequeas y
con una superficie micro porosa, de forma que presenta un amplio desarrollo
superficial. Puede estar empaquetada en forma de columna o extendida en
forma de capa. En ocasiones es necesario un tratamiento qumico de la fase
estacionaria para conseguir unas partculas de tamao y poro adecuados.
e. Fase mvil: la fase mvil puede ser un lquido o un gas, y su funcin es
transportar a los componentes de la mezcla a travs del sistema
cromatogrfico.
f. Cmara de desarrollo: es un recipiente cerrado que sirve para contener el
medio empleado y la fase mvil, al tiempo que mantiene un ambiente
constante del vapor de la fase.
g. Saturacin de la cmara de desarrollo: esta expresin se refiere a la existencia
de una distribucin uniforme del vapor de la fase mvil dentro de la cubeta de
elucin, antes de iniciarse la cromatografa.
h. Columna rellena: es un tubo que contiene un slido activo ms la fase
estacionaria lquida.
i. Columna de pared recubierta: es un tubo donde fase estacionaria liquida
recubre la pared interna del tubo, la cual es lisa y por lo general poco
modificada.
j. Desarrollo cromatogrfico: es el paso de la fase mvil a travs de la fase
estacionaria.
k. Efecto de borde en CCD: consiste en sumergir el borde inferior en el solvente
este empieza a ascender y desplaza los componentes de la sustancia a
trabajar.
l. Cromatograma: es un grfico o representacin de la respuesta del detector, de
la concentracin del analito en el eluyente o de otra magnitud utilizada para
medir una propiedad del efluente frente el volumen de efluente o tiempo. En
cromatografa en plano, cromatograma puede ser el papel o capa con zonas
separadas.
m. Agente revelador: es una sustancia o mtodo que permite visualizar las zonas
en que se encuentre los compuestos ya separados, cuando estos no poseen
color intrnseco.
n. Punto de aplicacin: lugar donde se deposita la muestra en la columna o fase
estacionaria
o. Volumen muerto: es el volumen del eluyente que se consume sin que se
detecte ningn componente
p. Frente de disolvente: es el borde delantero de la fase mvil cuando atraviesa el
medio plano. En todas las formas de desarrollo, excepto en el radial, el frente
de la fase mvil es esencialmente, una lnea recta paralela a la superficie de la
fase mvil.

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q. Frente beta: es el borde delantero del componente ms desplazado a lo largo

de la placa cromatogrfica.
r. ndice de retencin, Rf: es el cociente entre la distancia recorrida por el
compuesto y la distancia recorrida por el solvente por el solvente de desarrollo.
De la definicin se desprende que el valor R f es siempre menor o igual a la
unidad
s. Poder de resolucin de un sistema cromatogrfico: es el parmetro que
expresa el grado de separacin que se puede obtener en un sistema
cromatogrfico para dos componentes dados. Relaciona la capacidad
separadora de un sistema cromatogrfico para dos componentes
t. Tiempo de retencin: es el tiempo transcurrido entre el instante en que se
introduce la mezcla y el instante en que se detecta la seal propia del
componente en su mxima intensidad. Los tiempos de retencin no son
reproducibles.
u. Volumen de elucin: se define como el volumen de lquido necesario para
extraer una determinada sustancia. Presenta el inconveniente de depender
fuertemente del volumen total de la columna.
v. Poder de elucin de una fase mvil: capacidad impulsora de la fase mvil sobre
los solutos de la muestra retenidos sobre la fase estacionaria.
w. Serie eluotrpica: es una lista de disolventes ordenados conforme a su
capacidad relativa para desplazar solutos de un adsorbente dado.
x. Cromatografa en fase normal: procedimiento de elucin en el que la fase
estacionaria es ms polar que la fase mvil. Este trmino se usa en
cromatografa liquida para resaltar el contraste con la cromatografa con fase
invertida.
y. Cromatografa en fase reversa: procedimiento de elucin empleado en
cromatografa liquida en el cual la fase mvil es significativamente ms polar
que la estacionaria; por ejemplo un material micro poroso de base silcea con
cadenas de alquilo unidas qumicamente.
z. CCD analtica o comparativa: tcnica analtica que permite la separacin de los
componentes de una mezcla debido a la influencia de dos efectos
contrapuestos, retencin y desplazamiento.
aa. Elucin: es el fenmeno de migracin de los componentes de una mezcla a lo
largo de la fase estacionaria, impulsados por la fase mvil.
ab. Elucin isocrtica: es un procedimiento en el que la composicin de la fase
mvil permanece constante durante el proceso de elucin
ac. Elucin por gradiente: procedimiento en el que la composicin de la fase mvil
se cambia, de forma continua o en etapas, a lo largo del proceso de elucin.
ad. Retencin: efecto producido sobre los componentes de una mezcla por una
fase estacionaria, que puede ser un slido o un lquido anclado.
ae. Absorcin: es la retencin de una especie qumica por parte de una masa, y
debido a la tendencia que esta tiene a formar mezcla con la primera, absorcin
pura, o a reaccionar qumicamente con la misma, absorcin con reaccin
qumica, considerando ambas como un fenmeno msico y no superficial.
af. Adsorcin: es la retencin de una especie qumica por parte de los puntos
activos de la superficie de un slido quedando delimitado el fenmeno a la
superficie que separa las fases o superficie interfacial.
ag. Particin: es el proceso de separacin en el cual se produce una competicin
entre la fase mvil y la estacionaria por el componente.
ah. Difusin: proceso fsico irreversible en el que las partculas materiales se
introducen en un medio que inicialmente estaba ausente, aumentando la
entropa del sistema conjunto formado por las partculas difundidas o soluto y
el medio donde se difunden o disuelven.

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ai. Revelado: proceso que implica la localizacin de las zonas en que se

encuentran los compuestos ya separados, cuando estos no poseen color
intrnseco.
aj. CCD: son las siglas de Cromatografa de Capa Delgada. Es un procedimiento
que se utiliza para separar molculas relativamente pequeas. Al igual que
otras cromatografas, consiste de una fase estacionaria y una mvil y el
principio es el mismo: la sustancia de inters se adherir a la fase estacionaria
o se mover con la fase mvil, viajando una distancia que es inversamente
proporcional a la afinidad por la fase estacionaria.
ak. CC: Cromatografa de Columna. Es una tcnica de separacin en la que el lecho
estacionario est dentro de un tubo. Las partculas de la fase estacionaria
slida, o del soporte recubierto con la fase estacionaria liquida, pueden llenar
el volumen interno del tubo (columna rellena), o concentrarse sobre o a lo largo
de la pared interna del tubo, dejando un camino abierto sin restriccin, en la
parte media, por el que circula la fase mvil (columna abierta)
al. GC: Cromatografa de gases. Es una tcnica de separacin en la que la fase
mvil es un gas. La cromatografa de gases se lleva a cabo siempre en
columna.
am.
HPLC: Cromatografa liquida de alta presin (o alta eficacia). Es una
tcnica de cromatografa de lquidos en la que normalmente se utilizan
partculas muy pequeas y presiones de entrada relativamente altas.
an. GPC: Cromatografa por Permeacin sobre Gel, es una tcnica de separacin en
la cual la fase estacionaria es un gel hinchado y se basa fundamentalmente en
efectos de exclusin, tales como diferencias en el tamao de las molculas y/o
en su forma o en su carga.
ao. CCP: Cromatografa en Capa Preparativa, es una variacin de la cromatografa
en capa delgada, esta emplea placas grandes de manera de los componentes
separados se puedas obtener individualmente.
2. Cules son los materiales de soporte ms comunes usados en los sistemas
cromatogrficos?
Los materiales de soporte ms empleados son geles orgnicos derivados de
polisacridos como agarosa, fractogel TSK y slices CP6
3. Cules son las fases estacionarias ms comunes usadas en los sistemas
cromatogrficos?
Las fases fijas ms comunes son:

C: papel de celulosa
CCD: gel de slice.
G.C: columna de slice fundida
C. liquida de fase normal: empaque siloxano de octilo.
C. liquida de intercambio inico: resinas de intercambio inico.
C. exclusin: empaques pequeos de partculas de slice.
C. liquida de adsorcin: partculas finas de slice.

4. Cules son los

cromatogrfica?

principales

mecanismos

que

operan

en

una

separacin

a) Separacin por adsorcin (cromatografa de adsorcin) Diferente afinidad de los

componentes de la muestra sobre la superficie de un slido activo (componentes con
polaridad baja o media)
b) Separacin por reparto (cromatografa de reparto) Diferente solubilidad en fases
estacionaria y mvil (Componentes con polaridad media o alta)

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c) Separacin por tamao molecular (Cromatografa de permeacin de gel, de tamiz

molecular o de exclusin por tamaos). Parmetros de columna:
-

Intervalo de trabajo: intervalo de M que pueden ser separados

Lmite de exclusin: M mnimo a partir del cual las macromolculas no
experimentan retencin.

d) Separacin por Intercambio inico La separacin se basa principalmente en la

diferente afinidad para el intercambio de iones de los componentes de la muestra.
5. Cmo se mide y cmo se calcula el ndice de retencin, Rf, desde el registro de las
manchas en el cromatograma de una CCD?
Rf se puede definir
como el cociente entre
la distancia recorrida
por la sustancia X, y la
distancia recorrida por
el solvente. Se puede
medir
en
el
cromatograma
la
distancia
desde
el
origen
hasta
la
mancha respectiva y
efectuar la operacin
como se ilustra en la
imagen
6. Cmo se determina mediante CCD que dos muestras distintas corresponden a un
mismo compuesto?
A partir del cromatograma de CCD para dos compuestos se puede calcular el ndice de
retencin. El ndice de retencin se utiliza como criterio de identificacin por su valor
negativo, es decir si la sustancia incgnita y el patrn con la que se compara en la
misma corrida cromatogrfica dan valores de R f distintos, se descarta que sean el
mismo compuesto. En cambio si dan el mismo valor de R f no se puede asegurar que
sean el mismo compuesto.
Solo puede garantizarse la identidad de un compuesto cuando adems de datos de
propiedades fisicoqumicas y cromatogrficas pueden analizarse y asignarse datos
espectroscpicos del mismo.
7. Qu factores determinan o afectan el valor del Rf que se mide en un
cromatograma CCD?
Las variables que afectan el ndice de retencin son:

Adsorbente
Estructura del soluto
Solvente de desarrollo
Temperatura
Saturacin de la cuba
Coeficiente de particin
Cantidades relativas de las dos fases

8. Qu es una serie eluotrpica? Muestre un ejemplo con los disolventes comunes

en un laboratorio.

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En una lista de disolventes ordenados segn su capacidad relativa para desplazar

solutos de adsorbente dado en columnas de slice, el poder eluyente disminuye as:
Agua>metanol>etanol>acetona>acetato
Etilo>cloroformo>benceno>tolueno>tetracloruro
hexano>hexano

de

carbono>ciclo

9. Cules son las caractersticas deseables de una fase mvil para CCD o CC?
El solvente (fase mvil) ptimo para llevar a cabo una CCD ser aquel que produzca
un Rf de 0.5 para el componente nico, o que separe el mayor nmero de
componentes de la muestra. Se toma un ndice de retencin de 0.5 ya que si es mayor
pudo haberse superpuesto la mancha principal con alguna de otra impureza poco
polar, si es menor pudo haberse superpuesto la mancha principal con alguna otra
impureza ms polar, en cambio s es de 0.5 puede inferirse que la muestra tiene un
solo componente.
10. Qu es un agente revelador? Cmo se clasifican los agentes reveladores que se
usan en CCD? Enumere algunos agentes reveladores comnmente empleados en
CCD.
Los reveladores cromatogrficos se usan en cromatografa de capa fina o TLC. En esta
tcnica se coloca la muestra a analizar (una gota) sobre una placa de slica-gel. Esta
placa se introduce verticalmente en un vaso donde hay un disolvente (o una mezcla
de disolventes), de forma que el disolvente no toque la muestra. La slica de la placa
ira absorbiendo el disolvente (capilaridad) y la muestra tambin subir por la placa. La
altura que alcance la muestra depender del disolvente empleado (su polaridad) y de
que se componga la muestra. Normalmente las muestras estn compuestas de varias
cosas, de forma que se obtienen una serie de manchas a distintas alturas. Para
identificar las muestras se usa el Rf que consiste en medir y dividir la altura que ha
alcanzado la mancha entre la altura que ha alcanzado el disolvente y hay que decir
siempre que disolvente has utilizado.
Ejemplo: Acetato de etilo (disolvente usado) sube 10 cm, y la mancha a analizar sube
6 cm. El Rf ser de 0.6 en acetato de etilo.
Pero para calcular el Rf hay que ver la mancha. Las placas de slica que se usan en
laboratorio tienen un indicador fluorescente y al introducirlas bajo una lmpara de
rayos ultravioleta brillan con color verde. Si hay algn compuesto activo en el
ultravioleta evita que el indicador absorba luz en la zona en la que se encuentra y
como resultado se ver como una mancha negra y ya podemos medir el Rf.
Otras veces, hay que emplear reveladores. El revelador es un compuesto que ha de
reaccionar con los compuestos analizar de forma que se obtenga una mancha
coloreada a simple vista.
Los reveladores ms usados son:

cido fosfomolibdico (para compuestos fcilmente oxidables)

yodo (para compuestos aromticos e insaturados)
ninhidrina (para aminocidos, aminas y aminoazucares)
permanganato potsico (compuestos insaturados o fcilmente oxidables.

El revelado puede dividirse en dos: mtodos fsicos que utilizan propiedades

particulares de los compuestos, tales como la fluorescencia y los mtodos qumicos
que consiste en hacer reaccionar a las sustancias con algn agente qumico con el que
formen algn compuesto coloreado.
11. Discuta la afirmacin: La CCD constituye un criterio parcial de identificacin para
un compuesto; es decir, no puede dar la identificacin total del compuesto.

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A travs del cromatograma de CCD es posible calcular el ndice de retencin que

permite la identificacin parcial de un compuesto. Al elegir el absorbente y el solvente
de elucin pueden lograrse valores de R f reproducibles para cada soluto. Aun as esta
reproducibilidad no es lo suficientemente confiable, puede ocurrir que dos compuestos
tengan el mismo valor de R f aun probando distintos solventes de desarrollo por eso el
Rf de la CCD se usa como criterio de identificacin por su valor negativo, en otras
palabras este ndice se emplea para descartar compuestos si el valor es diferente pero
si son iguales no asegura que se trate del mismo.
12. Cmo se afecta la separacin cromatogrfica a causa de cada uno de los
siguientes factores?
a. la aplicacin de muestra en exceso o en muy alta concentracin en la placa
o en la columna de cromatografa.
Si se sobresatura el absorbente en la zona de siembra, habr soluto que estn
absorbidos desde el primer momento, si esto ocurre en una placa se observaran
manchas deformadas que dificultaran su interpretacin. Si esto ocurre en una
columna se obtendr una zona de siembra demasiado ancha o si se siembra en
pastilla se tapara la columna al pretender eluir con un solvente poco polar en el
cual se muestra insoluble.
b. el uso de una fase mvil de alta polaridad en un sistema cromatogrfico en
fase normal.
En la fase normal, se tiene como base una fase estacionaria polar, por lo tanto un
solvente polar tendr fuerza eluyente mayor con lo cual los solutos con frente
solvente y no se lograra la separacin.
c. El uso de una fase mvil de alta polaridad en un sistema cromatogrfico en
fase reversa.
El sistema cromatogrfico de fase inversa implica que la fase mvil es ms polar
que la estacionaria, eso ocasionara que se desplacen los componentes polares y
los ligeramente polares o apolares queden retenidos, todo lo contrario al resultado
de una cromatografa en fase normal.
d. La disposicin de una cantidad excesiva de fase mvil en la cmara de
desarrollo cromatogrfico ascendente en una CCD.
Esto puede ocasionar que el solvente supere la lnea de siembra por tanto la fase
mvil disolver solutos en vez de arrastrarlos a travs de la fase estacionaria.
e. La aplicacin de la muestra muy cerca del extremo de la placa para CCD
que se sumerge en la fase mvil.
Al aplicar la muestra muy cerca al borde que se sumerge la fase mvil puede
ocurrir que la siembra quede sumergida en el solvente y este disuelva la muestra
en vez de desarrollar la cromatografa
f. La aplicacin de la muestra muy cerca de alguno de los bordes verticales
de la placa para CCD.
Este evento propiciara el efecto de borde.
g. El uso de una mezcla heterognea de lquidos con polaridad diferente como
fase mvil.
Si la fase mvil consta de lquidos inmiscibles, se registrar ms de un frente de
solvente haciendo inteligible el cromatograma y malogrando la separacin.
h. El agrietamiento o la formacin de grumos o de burbujas de gas en la
fase estacionaria.
Una capa irregular ocasionara recorridos ms rpidos o ms lentos dependientes
de la forma de la fase estacionaria, implicando un valor de ndice de retencin
aleatorio e irreproducibles.
i. El tamao, la forma y la porosidad de las partculas que constituyen la
fase estacionaria.
Al disminuir el tamao de partcula, el nmero de centros activos por unidad es
mayor y la capacidad de adsorcin se incrementa, adems mejora la resolucin.

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Cuando se utiliza el absorbente de grano ms fino, el espacio entre grnulos es

ms pequeo, el equilibrio adsorcin-desorcin se establece rpido.
j. La viscosidad de la fase mvil.
La viscosidad de la fase mvil determinara la rapidez con la que atraviesan la fase
estacionaria, y por lo tanto el tiempo dura el desarrollo cromatogrfico.
k. El flujo de la fase mvil.
Si la velocidad de flujo es muy rpida no se alcanza a establecer el equilibrio
adsorcin-desorcin y el frente de las bandas aparece deformado, y si es muy
lenta se propiciara una alta difusin y remezcla de componentes.
l. La falta de saturacin con vapor de la fase mvil dentro de la cmara de
desarrollo cromatogrfico en CCD.
Si la cmara no est debidamente saturada, el solvente, en vez de ascender por
capilaridad continuamente, tendera a evaporarse de la capa de absorbente, para
equilibrar al lquido con su presin de vapor. Esto implicara un ascenso homogneo
del frente de solvente.
m. La distribucin irregular de la fase estacionaria en la trayectoria de la
fase mvil y las variaciones irregulares del flujo de fase mvil durante la
elucin en el desarrollo cromatogrfico.
Esto ocasiona que el frente de solvente corra inclinado haciendo irreproducibles los
valores de ndice de retencin.
n. Un cambio exagerado de la polaridad en la fase mvil debido a un
gradiente intenso o a un paso de gradiente muy alto.
El cambio en la polaridad ocasionara que el solvente aumente o disminuya su
fuerza eluyente, determinando el grado de separacin de los componentes de la
muestra.
13. Cmo se adaptan la placa, la aplicacin y la cmara de desarrollo para hacer
cromatografa en capa preparativa (CCP)?
Pueden hacerse en micro placas o placas ms grandes. Ambas formas se preparan con
adsorbente de tamao de granulo entre 10 y 40 micrones. Para cubrir el soporte con la
capa se puede: suspender adsorbente en solvente voltil, donde se sumerge la placa,
y luego se seca el aire, o se puede suspender adsorbente en agua, aplicarlo con
extendedor y luego activar las placas de siembra por medio de un capilar cargado,
abierto en los extremos, ubicados en puntos de 1,5 cm del borde inferior.
14. Cmo se aplica una muestra en placa para CCP?
Una vez preparadas las placas para CCP, se siembra la solucin a la que se le
practicara la cromatografa, por medio de un capilar o una pipeta capilar controlando
gota a gota su drenaje. La siembra se realiza colocando puntos de solucin contiguos
en varias pasadas, de tal forma, que quede una lnea de siembra de 1,5 cm de borde
inferior de la placa. Entre cada secuencia de siembra se debe dejar evaporar el
solvente que est saturando el adsorbente en esa zona.
15. Para qu se recomienda disponer dentro de la cmara de desarrollo
cromatogrfico para CCP un papel filtro con un extremo sumergido en la fase
mvil?
Se recomienda recubrir las paredes de la cmara con papel filtro cuyo borde este
sumergido en el solvente de desarrollo con el fin de lograr una perfecta saturacin de
la cmara de desarrollo. Se deja que el solvente ascienda por el papel y despus de un
tiempo puede considerarse que la cmara est saturada.
16. Cmo se controla la elucin en el desarrollo cromatogrfico de una CC mediante
CCD?
En la fase inversa la fase fija solida es generalmente de partculas de gel slice, a los
que se injertan cadenas C18H37 o C18H17. A diferencia en fase normal, las partculas

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forman una fase lipfila que retiene molculas poco polares. En fase reversa, los
componentes ms polares son eluidos preferentemente y los menos polares eluyen en
ltimo lugar.
17. En un mismo esquema, muestre comparativamente el resultado de la separacin
por CCD de una mezcla de solutos operando un desarrollo cromatogrfico

Cromatografia
en columna.

Fraccion 1

Fraccion 2

Anlisis
mediante CCD

Fraccion 3

Anlisis
mediante CCD

Fraccin 1
(fracciones 1 y 2)
Compuestos menos
polares

Fraccion 4

Anlisis
mediante CCD

Anlisis
mediante CCD

Fraccin 1
(fracciones 1 y 2)
Compuestos menos
polares

El proceso consiste en evaluar cada una de las fracciones

obtenidas mediante la cromatografa de columna para identificar si se trata del mismo
compuesto o similares y de esta forma poder reunir las fracciones con las mismas
caractersticas para simplificar el proceso.
En el control de una elusin en cromatografa en columna en fase reversa el proceso
es similar, sin embargo se tendr que las primeras fracciones corresponden a los
compuestos ms polares y las ltimas sern los compuestos menos polares.