1FUNDAMENTOS DE

ESPECTROMETRIA DE MASA
Orlando Lucas A.

Evolucin histrica de la instrumentacin analtica

2012

2012
Cromatografa

Cromatografo Liquido acoplado a Espectrmetro de

Masa (LC-MS)

LC-MS: combina el poder de separacin de la
cromatografa Liquida con el poder de deteccin de
la espectrometra de masa.

Espectrmetro de Masa: forma, identifica y separa
iones en fase gaseosa de acuerdo a su valor m/z

Porque acoplar la Cromatografa con MS?

Para superar las limitaciones de la deteccin no especfica.

Porque acoplar la Cromatografa con MS?

Para Incrementar la especificidad del detector para una

mejor identificacin y cuantificacin de los picos.

Componentes del Espectrmetro de Masa

Flujo HPLC

INTRODUCCIN
DE MUESTRA

Columna HPLC

MS

API

1FUENTE DE
IONES

INTER
FASE

Alto Vacio

2ANALIZADOR
DE MASA

3DETECTOR

SISTEMA
DE DATOS

Funcionamiento del Espectrmetro de Masa

1- Fuente de Ionizacin

3- Detector
2- Analizador de Masa Cuadrupolar

LC-MS produce informacin en 3-D

Cromatograma de
Cromatograma
Ion Total
- TIC de

Espectro individual de
Barrido al Minuto 1.453

Abundancia %

Ion Total -TIC

Espectro continuo

Minuto

Versin reducida Centroide

Tipos de Espectrmetro de Masa

COMPONENTE

FUENTE DE
IONES

ANALIZADOR
DE MASA

TIPO

Impacto Electrnico EI
GC
Ionizacin Qumica CI
Ionizacin por Electrospray ESI
LC (API)
Ionizacin Qumica a Presin Atmosfrica APCI
Fotoionizacin a Presin Atmosfrica APPI
Desorcin/ionizacin por Lser asistida por una matriz MALDI

Cuadrulopo Q
Trampa de Iones Trap
Tiempo de vuelo TOF
Sector Magntico
Resonancia Ion-Ciclotron con Transformada de Fourier FT-MS
Analizadores hbridos Q-Tof, Q-q-Q, Q-Trap,

INTRODUCCIN DE MUESTRA

1- FUENTE DE
IONES

INTERFASE

2-ANALIZADOR
DE MASA

3-DETECTOR

Alto vacio

SISTEMA DE DATOS

Ionizacin a Presin Atmosfrica-API

La muestra es desolvatada e ionizada bajo
condiciones de presin atmosfrica.
 Ionizacin Qumica a Presin Atmosfrica- APCI.
 Fotoionizacin a Presin Atmosfrica-APPI.
 Ionizacin Electrospray- ESI.

Ionizacin Electrospray-ESI
Envuelve la aplicacin de un campo elctrico a
travs de una interface que forma una celda
electroqumica.
 Los iones en solucin son transferidos a la fase
gaseosa.


Reduccin

Oxidacin

Electrones

Alto Voltaje

Electrones

Proceso ESI
1. NEBULIZACIN: Produccin y expulsin de gotas
cargadas hacia la regin de desolvatacion.
2. DESOLVATACIN: Eliminacin de solvente de las gotas.
3. PRODUCCIN DE IONES EN FASE GASEOSA.
Zona de
produccin
de ion en fase
de gas

Zona de desolvatacin donde

se produce la Fisin
Coulumbica

Punta del capilar

Cono de muestra

1- Nebulizacin ESI
Cono de Taylor

Los siguientes factores

interactan para establecer
un ESI reproducible:
Alto Voltaje






CAPILAR: dimetro interno y externo, forma de la

punta y material de construccin (metlico, silica, etc)
VOLTAJE DEL CAPILAR (Vc).
ELUYENTE HPLC: Flujo, tensin superficial y
concentracin de electrolitos.
GAS DE NEBULAZACION: Flujo y temperatura.

Voltaje del capilar (Vc)

Modo Spray Axial (Voltaje optimo)

Modo Rim Emission (Seal inestable)
Descarga de corona (Baja relacin seal/ruido)

Potencial
Electrosttico (kV)

2- Desolvatacin ESI
GAS DE DESOLVATACION
(Drying Gas):
Gas nitrgeno
200500o C. 5-50 L/min.

Punta del capilar

FISION COLUMBICA

Zona de
produccin
de ion en
fase de gas

Zona de desolvatacin

3- Produccin de iones en fase gaseosa.

Factores que determinan el numero de cargas dentro
de la gota (N) y el radio de la gota (R):

ELUYENTE HPLC: Flujo y composicin

GAS DE NEBULIZACION : Tipo y flujo

GAS DE DESOLVATACION: Temperatura y flujo

CAPILAR: Voltaje

Diseo Ortogonal ESI

VENTAJAS:

Reduce el tiempo de inactividad de la fuente con
menor requerimiento de limpieza (ROBUSTEZ)

Muestreo de menos gotas en relacin a los iones

Tolera flujos altos (Hasta 1mL/min)

Diseo Ortogonal Zeta Spray Waters

Gas de desolvatacion en la sonda

Punta del capilar

Capilar Electrospray

Efecto del gas de cono o Curtain Gas en ESI:

Previene el ingreso de iones cluster al analizador de masa:

Efecto de la fragmentacin por voltaje de cono

Obtener informacin estructural de la fragmentacin
de iones en la fuente

Ayuda a eliminar iones cluster (Ion Declustering),
para incrementar la relacin seal/ruido en LC-MS

Efecto del gas de cono: reduccin de clusters

Ionizacin por Electrospray

ESI (+)

ESI (-)

Analitos disponibles para ESI

COMPUESTOS:
 Que contienen Heteroatomos (Cl , Br)

Clorpirifos

Atrazine

Que producen una carga a travs de un efecto

inductivo (Azocompuestos, ftalatos, opiaceos)

Compuestos capaces de contener

mltiples (protenas, pptidos)

cargas

Analitos disponibles para ESI

COMPUESTOS:
 Ionizables (cidos, bases, etc)

Carbofuran

2,4-D

Que tienen un fuerte momento dipolar pero que

no se pueden ionizar (Aldehidos, eteres, etc).
Formacin de aductos Na, K o MeCN.

Ionizacin en solucin en ESI

IONES POSITIVOS: Son producidos por la adicin de un
in positivo ( H+, NH4+, Na+).aductos.
+H+
+
H
Carbofuran

IONES NEGATIVOS: Son frecuentemente producidos por la

remocin de un protn (Ion hidrogeno) de una molcula.

2,4-D

- H+

Ionizacin en solucin en ESI

 ESI trabaja mejor en
soluciones
con
alto
porcentaje de solventes
orgnicos (acetonitrilo o
metanol),
aunque
la
solucin debe tener algo
de contenido acuoso y
algunos iones.

Reduccin
Oxidacin

Electrones

Alto Voltaje

Electrones

 Las molculas con gran tendencia a la ionizacin

presentan seales de electrospray ms fuertes; por
ello ciertos aditivos de la fase mvil, como la adicin
de cido frmico, pueden mejoran las seales en
el ESI+.

Solventes y aditivos usados en LC-MS-API

CRITERIOS DE SELECCIN:
Ionizacin.
Volatilidad: Es mejor usar buffers voltiles.
cidos: H2SO4, HCl, Acido metasulfonico. Pueden
daar el instrumento y no deben ser usados. Se debe
usar cidos orgnicos voltiles (TFA, frmico, actico)
Formacin de aductos: Sodio, Amonio, Acetato
Surfactantes: Afecta la formacin del spray,
evaporacin de la gota y compite con la ionizacin.

la

Concentracin de buffers: Mantenerlo tan bajo como

sea posible (en el orden de mM). Si el buffer es muy alto
puede ocurrir supresin inica.

Solventes y aditivos comunes en LC-MS-API

Agua

Metanol

Acetonitrilo

Acido Frmico (<0.1%)

Acido Actico (<0.1%)

Acido Trifluoroacetico (<0.1%)

Acetato de Amonio (<10 mM)

Formiato de Amonio (<10 mM)

Intercambio de polaridad ESI

Ionizacin Qumica a Presin Atmosfrica-APCI

BLOQUE DE CALENTAMIENTO
(450 - 550C)
Al
analizador
de Masa

Desde el
LC

Vacio
Gas nebulizador
(Alta velocidad)

Gas de
Desolvatacin

Aguja de descarga de corona (2 - 3.5 kV) (corona pin)

APCI versus electrospray

APCI

Electrospray

Ionizacin ms vigorosa. Ionizacin suave.

Fragmentacin Se producen ms
Se producen menos
fragmentos
fragmentos.
Tipos de
muestras
Cargas
Tasa de flujo

Bajo PM< 1000. Puede

ser menos polar
Usualmente de carga
simple.
0.2 2 mL/min
Fuente : 120-140C

Temperatura

Sonda. 450-550C

Molculas pequeas y grandes.

Tiende a ser ms polar.
Puede ser de carga mltiple.
0.001 1 mL/min.
Infusin: Fuente: 80C ,
Desolvatacin: 120C
HPLC: Fuente: 120C,
Desolvatacin: 350C

Dominios y aplicaciones de los tipos de ionizacin

POLARIDAD

ALTA

ESI

MEDIA

APCI
APPI

BAJA
1 kD

10 kD
PESO MOLECULAR

100 kD

INTRODUCCIN DE MUESTRA

1- FUENTE DE
IONES

INTERFASE

2-ANALIZADOR
DE MASA

3-DETECTOR

Alto vacio

SISTEMA DE DATOS

Tipos de Analizadores de masa

Cuadrulopo Q
Trampa de Iones Trap
Tiempo de vuelo TOF
Sector Magntico
Doble Sector magntico-elctrico
Analizadores hbridos Q-Tof, Q-q-Q,
Q-Trap, etc

Resonancia Ion-Ciclotron con
Transformada de Fourier FT-MS

Ion mobility

Orbitrap

Analizador de masa cuadrupolar

Los iones de diferente m/z son separados mediante una
combinacin de voltajes dc y rf (radiofrecuencia)

A un determinado valor de voltajes solamente una molcula de
valor de m/z tiene una trayectoria estable
Ion resonante
Ion no resonante

Detector

Rf y -dc

Voltajes Dc y Rf

Fuente

Rf y +dc

Analizador de masa cuadrupolar

VOLTAJE DC

Diagrama de estabilidad del cuadrupolo

PENDIENTE= WIDTH GAIN

LINEA DE SCAN

924

923

WIDTH
OFFSET

922

VOLTAJE RF

Uso de cuadrupolo como filtro de masas

(U, V varan linealmente)

Uso de cuadrupolo como filtro de masas Ejemplo

de una mejor lnea operacional (mejor resolucin)

Uso de cuadrupolo como filtro de masas Ejemplo

de una lnea operacional ptima (ptima resolucin)

Resolucin de masa
Representa la habilidad para separar dos masas adyacentes.
Mtodo de Ion Individual

Mtodo de Ion Doble

Ancho total a la mitad de la altura mxima

(FWHM) o a 50% de la altura del pico.

2 picos de iones adyacentes con un valle

mximo de 10%

50%
m= 0.3 Daltons de
ancho de pico

R=

m
m

R = 279/0.3 = ~ 1 000

R=

m
mr

R = 1 000/1 = ~ 1000

Resolucin y exactitud de masa

3 compuestos diferentes
Misma masa nominal
Baja resolucin

3 compuestos diferentes
3 diferentes masas exactas
Alta resolucin, alta exactitud.

249.0479

R=

m
mr

R = 249.07/0.0120 = ~ 20 000

Separacin de Masas a baja y alta Resolucin

319.8965

100%
80

319.9329

Resolution = 10,000

60
40
20
0
319.8

100%

319.9

320.0

320.1

Mass

319.9

320.0

320.1

Mass

Resolution = 1,000

80
60
40
20
0
319.8

INTRODUCCIN DE MUESTRA

1- FUENTE DE
IONES

INTERFASE

2-ANALIZADOR
DE MASA

3-DETECTOR

Alto vacio

SISTEMA DE DATOS

Detector

Tubo Fotomultiplicador
Los electrones inciden dentro de la luz emitiendo fsforo
que esta pticamente acoplado a un fotomultiplicador.
dinodo
fsforo
fotomultiplicador

Multiplicador de electrones
Se utiliza un dinodo de conversin para convertir ya sea los
iones positivos o negativos en electrones. En el dinodo de
conversin se usa altos potenciales para acelerar los iones
de masa elevada y de esta manera mejorar la sensibilidad.
IONES

ELECTRONES

Gracias por su atencin

Orlando Lucas A.