INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

Laboratorio de Bioqumica general
Aislamiento de DNA plasmidico
Integrantes: Prez Galindo Vanesa y Gustavo Misael Gmez Franco 4QM2
Introduccin:
El ADN por las siglas de Acido Desoxirribonucleico, es una molcula de gran tamao
que guarda y transmite la informacin necesaria para el desarrollo de todas las
funciones biolgicas de un organismo.
En el aislamiento de los cidos nucleicos debe tenerse en cuenta lo siguiente:

Debe romperse eficientemente la pared y membrana celular para facilitar la

extraccin del cido nucleico deseado.

Se debe trabajar en condiciones que inhiban las nucleasas (enzimas

degradativas) liberadas durante el proceso de lisis celular.
Los plsmidos son una herramienta fundamental en Biologa Molecular e Ingeniera
Gentica ya que se pueden usar como vectores para introducir en ellos cualquier

Seccin: 1

fragmento de ADN de inters y de esta forma amplificarlo de forma natural dentro de la

bacteria en la que el plsmido se replica. Las molculas de ADN plasmdico, adoptan
una conformacin tipo doble hlice al igual que el ADN de los cromosomas. A
diferencia del ADN cromosomal, los plsmidos no tienen protenas asociadas. Un
mtodo que permite visualizar ADN plasmdico o fragmentos del mismo es la
electroforesis en gel de agarosa, en la cual se separan en funcin de su tamao. Esta
tcnica consiste en someter la mezcla de molculas de ADN embebidas en un gel de
agarosa a un campo elctrico. Cuando los fragmentos se han separado, el gel se
sumerge en una solucin que contiene bromuro de etidio y luego se ilumina con luz UV.
Objetivo:
Aislar ADN plasmidico bacteriano, comprobando dicho aislamiento mediante
electroforesis en gel de agarosa

Anlisis de la tcnica:

Bacterias que
contienen
plasmido
resistente a
ampicilina
Se hacer crecen
bacterias en medio
Luria-ampicilina y se
centrifuga 1.5 ml a
13000-5 min

Desechar el sobrenadante +
100
Solucin
GTE:
Glucosa/Trisen hielo
HCl/EDTA pH=7.9
La glucosa no tiene carga pero
es un osmolito
El
EDTA
une
cationes
divalentes como Mg2+ y Ca2+
en
la
membrana
celular,
debilitando la membrana.
Tambin el Mg2+ es cofactor
de Dnasas

Solucin de lisis:
NaOH 0.2 N / SDS
1%
Esta
solucin
disuelve
los
fosfolpidos y los
componentes
protecos de las
membranas
celulares.
Se
rompe
la
membrana de las
clulas
El
NaOH
desnaturaliza
el
Agregar
200
DNA plasmdico y
cromosomal

Agregar 150

Acetato de Potasio:
Precipita el SDS junto
con
protenas
y
lpidos.
El DNA cromosomal
que se renaturaliza
se atrapa en el
precipitado
SDS/protenas/lpidos
.
Slo
el
DNA
plasmdico
y
molculas de RNA
escapan
del
precipitado
y
Se
encuentran
en
el
sobrenadante

El
isopropanol
precipita los cidos
nuclecos,
remueve sales y
remanentes
de
SDS.

centrifugar a
13000 rpm- 5
min y pasar el
sobrenadante a
un tubo
eppendorf, + 500
min en hielo

 Regulador
TrisEDTA:
su
funcin es mantener el pH del
buffer en un punto estable, por
lo general 8,0.
Dado que el Mg2+ es un
cofactor
requerido
por
la
mayora
de
nucleasas,
su
secuestro por el EDTA evita la
degradacin del DNA durante
centrifugar
la
preparacin5 miny 13000
la
rpm desechar
electroforesis.
sobrenadante y agregar 10

Preparar
agarosa
Preparacion de la
camara
de
electroforesis para
la observacion de
la purificacion del
plasmido

Preguntas extra:
Qu es agarosa?
La agarosa es una fraccin extrada del agar y es la responsable
fundamental del poder gelificante de ste. De igual forma que el agar,
presenta una histresis de gelificacin importante, dado que gelifica a
temperaturas comprendidas entre 32 - 45C y funde a temperaturas entre 80
- 95C.
La agarosa es un producto natural que forma una matriz inerte de extenso
uso en tcnicas de separacin tales como Electroforesis, Cromatografa y
otras, empleadas en el campo de la Bioqumica y Biologa Molecular.

Bromuro de etidio en electroforesis:

Se trata de un compuesto intercalante, es decir, que tiene afinidad para
unirse al DNA, pues se introduce entre sus bases apiladas. Esto se debe a
su geometra plana y su estructura aromtica, que interacciona
favorablemente con el interior hidrfobo de la doble hlice. En menor
medida, interacciona tambin con DNA monocatenario.
Su utilidad deriva asimismo de su fluorescencia, exaltada al encontrarse en
un entorno hidrfobo, es decir, al estar unido al DNA. Se excita con luz
ultravioleta de onda corta, 254 nm, y emite su fluorescencia como luz visible,
de color rosado-anaranjado.

El azul de bromofenol tiene

una movilidad mayor que la
de cualquier macromolcula y,
por
tanto,
si
se
aplica
corriente
hasta
que
el
colorante
est
a
poca
distancia del extremo inferior
del gel, se tiene la seguridad
de
que
ninguna
macromolcula se ha salido
del gel por avance excesivo.
Tomar 5-10 de DNA
plasmidico y adiconar
5-6 de azul de
bromofenol

colocar en en el pozo de gel

de agarosa y realizar
electroforesis. revelar con
bromuro
de etidio
y utiliza
observar
En la
electroforesis,
se
para "teir"
en trasluminador
el DNA, para
revelar su posicin en el gel.
Se
puede
baar
el
gel
tras
la
electroforesis en una disolucin de
bromuro de etidio, o bien incorporar ste
a la disolucin de agarosa con la que se
prepara el gel.