CINTICA ENZIMTICA

Las fuentes ms importantes como materia prima para la obtencin de energa son los
polisacridos, el almidn y el glucgeno. En los vegetales el almidn constituye el
polisacrido de reserva ms abundante, sintetizndose en los cloroplastos de las
clulas fotosintticas y en los amiloplastos de las clulas del parnquima de
almacenamiento
El almidn es un polisacrido compuesto por unidades de glucosa con dos
componentes; uno, mayoritario, llamado amilasa, de estructura lineal (las unidades
estn unidas, exclusivamente, por enlaces -1,4-glucosdicos), y otro, minoritario,
amilopectina, de estructura ramificada (cada cierto nmero de eslabones lineales hay
una ramificacin, que encabeza una glucosa unida mediante enlace -1,6-glucosdico
a una de las glucosas de la estructura lineal). La prctica se aprovecha, para seguir la
degradacin del almidn por -amilasa salival, de que amilasa forma un complejo azul
con iodo, cosa que no pueden hacer los productos de su degradacin.
Objetivos

Realizar extraccin a partir de material biolgico vivo vegetal

Se analizar la actividad amiloltica, por medio de la reaccin del extracto
enzimtico obtenido, a travs del producto coloreado que se obtiene en la reaccin
Se estudiar el efecto de la temperatura, del pH, de la concentracin de la enzima
y la concentracin de sustrato en la reaccin
Determinacin la cintica enzimtica de la Amilasa extrada de vegetales con
respecto a la amilasa salival.

MATERIALES Y REACTIVOS.

Solucin de enzima Salival: Se prepara colectando 1 ml de saliva (previo enjuague de

la boca con agua destilada) diluida en 20 ml con agua destilada.
Solucin de Almidn al 0,5 %. (Preprela disolviendo el almidn en agua a 50 o 60
C)
Lugol: Se prepara disolviendo 1 g de iodo, 2 g de KI en 200 ml de agua destilada.
Disoluciones buffer de pH 5,0; 6,0, 7.0 y 8,0. (fosfato de sodio)
Tubos de ensayo, vasos de precipitado
Cronmetro.
Semillas de 5 das de germinacin
Mortero.
Reactivos de Fehlling, Benedict.
Gradillas
Matraz aforador de 100 ml
Pipetas de 1 y 5 ml.
Planchas de calentamiento
Glicerina
Vidrios reloj

Hidrxido de sodio
K2HPO4
pH metros o papel indicador

PROCEDIMIENTO:
1. INFLUENCIA DE [E] EN LA CINTICA
Tubos
1
2
3
4
5
Solucin de almidn al 0.5%(ml)
10
10
10
10
10
Solucin de Enzima (ml)
0.5
10
1.5
2.0
2.5
1. Despus de adicionar la enzima al ltimo tubo accione el cronmetro y en intervalos
de 1 minuto tome 1 ml del tubo con una pipeta Pasteur y le agrega unas gotas de
Lugol. Observe y anote el color para cada tiempo y cada tubo ensayados.
2. Determine por el procedimiento anterior el tiempo que tarda cada uno de los tubos en
reaccionar con el lugol, la mezcla de las dos gotas debe quedarse del color original del
Lugol.
3. Realice un control, tomando 1 ml de agua destilada y adicionndole unas gotas de
lugol.
4. Con los datos obtenidos construya la siguiente tabla:
Tubos Volumen de Enzima
Velocidad Reaccin (1/t)
Tiempo (min.) pH

5. Con estos datos construya un grfico de [E] en el eje de las ordenadas contra
velocidad de reaccin (1/t) en el eje de abscisas.
6. Repita la experiencia con los extractos de semillas vegetales.
2. INFLUENCIA DE [S] EN LA CINTICA
PROCEDIMIENTO:
Tubos
1
2
3
4
Solucin de almidn al 0.5%(ml)
1.0
2.0
3.0
4.0
Agua destilada (ml)
4.0
3.0
2.0
1.0
Solucin de Enzima (ml)
0.5
0.5
0.5
0.5
1. Incube los tubos a 40 grados Celsius durante 10 minutos
2. A intervalos de 1 minuto determinar la presencia de almidn mediante la
Lugol.
3. Con los datos obtenidos construya la siguiente tabla:
Tubos

Volumen de Sustrato (ml)

Velocidad Reaccin
(1/t)

5
5.0
0.0
0.5
reaccin con

Tiempo total de reaccin

(min.)

4. Con los datos de la tabla construya un grfico de velocidad de reaccin (volumen /

tiempo) en el eje ordenado contra volumen de sustrato en el eje de abscisas
3. INFLUENCIA DEL pH. EN LA CINTICA
PROCEDIMIENTO:
Tubos
1
2
3
4
Solucin buffer (ml)
2 (pH 5.0) 2 (pH 6.0) 2 (pH 7.0) 2 (pH 80)
Solucin de almidn al 0.5%(ml)
2
2
2
2
Solucin de Enzima (ml)
2
2
2
2
Volumen final (ml)
6
6
6
6
1. Incube a 40 grados Celsius por 10 minutos y ensaye la reaccin con el Lugol,
tomando 1 ml cada minuto
2. Con los datos obtenidos establezca las conclusiones sobre el rango de pH en el cual
la enzima muestra su actividad ptima.
INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA EN LA CINTICA
PROCEDIMIENTO:
Tubos
1
2
3
4
5
Solucin de almidn al 0.5%(ml)
5
5
5
5
5
Solucin de Enzima (ml)
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
Volumen final en cada tubo
6.0
6.0
6.0
6.0
6.0
1. Hierva durante 5 min. y reponga el volumen de agua perdida por evaporacin en el
tubo. Incbelo a 40 grados Celsius y determine la presencia de almidn en l a
diferentes intervalos de tiempo.
2. Incube un segundo tubo a 40 grados Celsius y un tercero a 50 grados Celsius, y
ensaye en ellos la reaccin con Lugol a intervalos de 1 minuto. Anote el tiempo que se
demora en desaparecer la coloracin azul.
3. Un cuarto tubo incbelo en un bao de hielo y ensaye tambin la reaccin con Lugol.
4. El ltimo tubo djelo a temperatura ambiente del laboratorio y ensaye con el Lugol
hasta la desaparicin de la reaccin positiva en intervalos de 1 minuto.
5. Con los datos obtenidos en el ensayo complete la siguiente tabla,

Tubos
1
2
3
4
5

Velocidad Reaccin
(Vol./tiem)

Tiempo Reaccin
(min.)

Color observado

EXTRACCIN DE AMILASAS DE SEMILLAS

PROCEDIMIENTO:
1. Prepare 30 ml de un macerado acuoso con 10 g de semillas de frijol germinadas
teniendo en cuenta que el agua debe estar caliente (50 grados). Adicione 5 gotas de
glicerina para extraer lo ms posible los enzimas.
2. Deje reposar de 15 - 20 minutos de 30 - 45 grados Celsius y filtre el extracto.
3. Para reconocer la presencia de azcares reductores (maltosa y glucosa), realizar la
reaccin con los reactivos de Fehling, Tollens o Benedict de una muestra de 1 - 2 ml
del sistema de reaccin.
4. Realice los ensayos tanto con amilasa salival como con amilasa del extracto de
semillas

INMOVILIZACION DE ENZIMAS
INTRODUCCION
Los procesos catalizados por enzimas en la industria son cada da ms numerosos, ya
que presentan una serie de ventajas frente a los catalizadores convencionales no
biolgicos, presentan una gran actividad cataltica; muestran una gran especificidad de
sustrato (incluso estereoselectividad y regioespecificidad); son muy activos a temperatura
ambiente y presin atmosfrica. A pesar de estas claras ventajas, el empleo de enzimas
no se ha generalizado en los procesos qumicos industriales, debido a que la mayora de
las enzimas no son estables en las condiciones de trabajo. Por otra parte al ser solubles
en agua, la separacin de los sustratos y productos, es difcil, y por tanto, no se pueden
reutilizar.
Con la inmovilizacin de las enzimas se han podido superar estos ltimos inconvenientes,
permitiendo que el proceso biotecnolgico sea econmicamente rentable.
OBJETIVOS

Establecer la efectividad de enzimas inmovilizadas y sin inmovilizar

Determinar el tiempo de residencia del sustrato en el sistema de la enzima
inmovilizada
Establecer tiempos de catlisis de la enzima en cada uno de los sistemas
(inmovilizada y sin inmovilizacin)

ASPECTOS GENERALES SOBRE LA INMOVILIZACIN DE ENZIMAS

La inmovilizacin de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la enzima en
una regin definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su
actividad cataltica y que pueden ser reutilizadas repetidamente. Como ventajas del
empleo de enzimas inmovilizadas podemos destacar:

El aumento de la estabilidad de la enzima.

La posible reutilizacin del derivado, por lo que disminuyen los costes del proceso.
La posibilidad de disear un reactor enzimtico de fcil manejo y control, adaptado a
la aplicacin de la enzima inmovilizada.

Los diferentes tipos de biorreactores enzimticos aparecen en la Figura 1. Estos con

enzimas inmovilizadas permiten el empleo de cargas elevadas de enzima, la cual
mantendr su actividad durante ms tiempo. Estos sistemas pueden incluir el reciclado, lo
que permite la obtencin de productos con mayor pureza.
Los principales inconvenientes del proceso de inmovilizacin son:

La alteracin de la conformacin de la enzima respecto de su estado nativo.

La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir distintas

fracciones de protenas inmovilizadas con un diferente nmero de uniones al soporte.
Siempre suele haber una prdida de actividad de la enzima durante la movilizacin.
El biocatalizador es ms caro que la enzima nativa.

FIGURA 1.- Biorreactores que emplean enzimas inmovilizadas.

INMOVILIZACIN DE ENZIMAS POR RETENCIN FSICA (ATRAPAMIENTO)
Consiste en la retencin fsica de la enzima en las cavidades interiores de una matriz
slida porosa constituida generalmente por prepolmeros fotoentrucruzables o polmeros
del tipo poliacrilamida, colgeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano.

FIGURA 2. Mtodos de inmovilizacin mediante retencin fsica.

El proceso de inmovilizacin se lleva a cabo mediante la suspensin de la enzima en una
solucin del monmero. Seguidamente se inicia la polimerizacin por un cambio de
temperatura o mediante la adicin de un reactivo qumico. El atrapamiento puede ser en
geles o en fibras, que suelen ser ms resistentes que los geles. En el primer caso, la
enzima queda atrapada en el interior de un gel, mientras que en el segundo caso la
enzima se encuentra ocluida dentro de las microcavidades de una fibra sinttica. El
atrapamiento, de gran sencillez desde el punto de vista experimental, requiere poca
cantidad de enzima para obtener derivados activos. Como ventaja adicional, la enzima no
sufre ninguna alteracin en su estructura. De todas formas, el atrapamiento requiere un
control riguroso de las condiciones de polimerizacin, as como la comprobacin de que la
naturaleza qumica del proceso no altera los grupos reactivos de la protena.
MATERIALES Y REACTIVOS
Si no se tiene agar-agar, el atrapamiento se puede hacer con Alginato de Sodio
Buretas de 300 ml
Jeringas desechables de 20 o 50 ml o Pipetas partidas de 5 ml
Columnas de Vidrio o PVC
Solucin de Enzima (quimosina animal del Cuajo)
Atrapamiento en Alginato
Alginato de Sodio al 1%
Buffer de Acetato de sdio 0.1 M pH 6.0
Acido Actico
Solucin de CaCl2 0.2 M
Atrapamiento en Agar
Aceite Vegetal Fri
Agar-Agar
Plancha de calentamiento
Termmetro

PROCEDIMIENTO
Atrapamiento en Alginato.
El extracto enzimtico se inmoviliza con Alginato de sodio. El alginato es un polisacrido
producido por algas solubles en agua, en una solucin con iones bivalentes como Ca2+
polimeriza ya que los iones producen entrecruzamiento de los polisacridos. Al
polimerizar una solucin de alginato de sodio, conteniendo enzimas, estas quedan
atrapadas dentro de las esferas que se generan.
Para la inmovilizacin se colocan 10 ml del extracto enzimtico en un beaker y se le
agrega alginato de sodio al 1%. Se homogenizan y se toma con una jeringa de 50 ml. Se
hace gotear la solucin en un beaker que contiene la solucin de CaCl 2, 200 mM. Para
producir esferas de 3 5 mm de dimetro, que polimerizan al entrar en contacto con la
solucin de CaCl2. Las esferas se estabilizan durante 1 Hora en la solucin CaCl 2, a
temperatura ambiente. Las esferas se lavan con buffer de acetato sodio 0.1M, pH: 6.0
Atrapamiento en Agar-Agar
Preparar una solucin de 3% de agar, Calentar hasta 200 grados para disolver el agar,
Bajar la temperatura a 40 C una vez disuelto el agar (confirmar temperatura con
termmetro) Para la inmovilizacin se adicionan 10 ml del extracto enzimtico en el
beaker con el agar, solo cuando la temperatura este por debajo de 45 C, para que no se
de una desnaturalizacin de la enzima. Homogenice las soluciones: con una jeringa de 50
ml tome de la solucin, gotee la solucin de enzima-agar sobre una probeta llena de
aceite vegetal frio. Si desea tamaos de esferas ms grandes gotee solucin varias veces
sobre el mismo sitio hasta obtener el tamao de esfera deseado. Repita esto hasta
obtener un volumen adecuado de esferas. Lave las esferas con abundante agua (Agua de
la llave), utilizando tela o tamiz de plstico.
Determinacin del titulo de la Enzima
Determine el titulo de la enzima (fuerza para ejercer su catlisis) y la dosis necesarias sin
caer en los errores que conlleva emplear dosis bajas o muy altas a las necesarias.
El ttulo o fuerza de cuajo se define como la cantidad de leche en mililitros que cuaja a
35 C en 40 minutos, cuando se le adiciona un gramo o mililitro de enzima. Se puede
calcular mediante la siguiente formula:
V x 2400
C xt
F: Fuerza de la enzima, V: Cantidad de leche, C: Cantidad de Enzima y t: tiempo tardado
en coagular la leche.
F

Cuando se conoce la fuerza, se puede calcular la cantidad necesaria a utilizar por medio
de la siguiente formula:
L x 34 x 40
C
F xTxM

F: Fuerza de la enzima, L: Volumen de leche, C: Volumen de la Enzima, T: Temperatura

en C y M: Duracin en minutos.
Tome 10 ml de leche cruda y adicinele 2 ml de la enzima del cuajo, con un cronmetro
establezca el tiempo que demora la enzima en catalizar el sustrato, calcule el titulo y el
volumen de la enzima sin inmovilizar
Empacamiento de la columna
Determine la longitud de la columna de vidrio o PVC, y rellene hasta el 75 % de esta. Con
las esferas creadas. Figura 3

Haga circular el sustrato a catalizar, se puede realizar con bomba peristltica o

manualmente si no se posee. Mida el tiempo que tarda la enzima en catalizar el sustrato.
Monte tres columnas empacadas
minutos, segn la tabla siguiente
Columna
empacada
1
2
3

y haga circula el sustrato (leche), durante varios

Tiempo de residencia del sustrato

en la columna (min.)
15
30
45

Tiempo de catlisis

CURVAS DE CALIBRACIN

PRODUCTO, SUSTRATO Y MICROORGANISMOS

Preparacin del Biuret

Sustancia
CuS04. 5H20
EDTA
Kl
Na(OH) (2.5N)

Cantidad
1.5 g
6.0 g
1.0 g
300 mL

Solucin Estndar BSA: Albmina suero bovino (10g/L 10mL) Preparar las soluciones
como se muestra:
Tubos

Solucin (ml)

1
8.0
2.0
0.0

Biuret
Solucin Estndar BSA
H2O

2
8.0
1.6
0.4

3
8.0
1.2
0.8

4
8.0
0.8
1.2

5
8.0
0.4
1.6

6
8.0
0.0
2.0

Mezclar bien, dejar reposar por 30 minutos y luego leer en el colormetro a una longitud de
onda (. = 550 nm). Realizar la curva Absorbancia versus concentracin.
NOTA: Absorbancia = 2 - Lg Tramitancia

ALCOHOL

Partir de una solucin de etanol al 99.9 % y preparar las soluciones como se muestra:
Tubos

Reactivos
Etanol (ml)
H2O (ml)

1
1
10

3
1
8

4
1
6

5
1
4

6
1
2

1
0

Mezclar bien, luego leer en el refractmetro el ndice de refraccin. Realizar la curva

ndice de refraccin versus concentracin.

SUSTRATO - DETERMINACIN DE GLUCOSA Y AZCARES REDUCTORES CON

DNS (cido dinitro saliclico).

Pasos para preparar DNS:

Disolver 1.6 g de NaOH en H2O destilada.

Adicionar 30 g de tartrato de Na y K
Adicionar 1 g de DNS
Aforar a 100 mL con H2O destilada
Almacenar en frascos mbar a 4 C

Stock de glucosa 4 mg/mL, preparar 50 mL y distribuirlos en ependorf, almacenar a 4C

Curva:
No Dilucin
Glucosa mL stock
H2 destilada mL
Volumen total

1
0.025
0.475
0.5

2
0.05
0.450
0.5

3
0.075
0.425
0.5

4
0.1
0.4
0.5

5
0.125
0.375
0.5

6
0.15
0.35
0.5

Muestras:
Tomar 0.5 mL de cada dilucin y agregar 0.5 mL de reactivo DNS.
Preparar una muestra blanco por dilucin de 0.5 mL de H20 destilada a 0.5 ml del
reactivo de DNS.
Agitar todas las muestras.
Colocar a ebullir las muestras en bao mana por 5 minutos.
Enfriar con hielo.
Adicionar 5 mL de H20 destilada.
Agitar y dejar en reposo 15 min.
Leer a 540 nm.
Realizar la curva Absorbancia versus concentracin.
NOTA: Absorbancia = 2 - Lg Tramitancia

DETERMINACIN DE BIOMASA - LEVADURAS , HONGOS y BACTERIAS

MTODO COLORIMETRICO
Preparar una solucin de 1g / L de levadura (100 mL)

Diluir la muestra patrn como se muestra

Tubos

Solucin (ml)

1
10
0

Solucin de Levadura
H2O

2
1
10

4
1
8

5
1
6

6
1
4

0
10

Leer en el colormetro a una longitud de onda (\= 640 nm). Realizar la curva Absorbancia
versus concentracin.
NOTA: Absorbancia = 2 - Lg Tramitancia
MTODO: CONTEO DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIA
Sembrar 1 ml por vaciado en 5 cajas de petri, las muestras del 1 al 5, luego de 24 horas
contar las colonias en cmara cuenta colonias.
Las unidades resultantes al hacer las lecturas de colonias en esos equipos son:
Ufc/ml (unidades formadoras de colonia / ml).
CMARA DE NEWBAUER:
Se lee en el microscopio a 40X. La cmara est dividida en secciones as:
Se cuentan los campos 1, 3, 7,9, el nmero de microorganismos y se divide por 1 mm2, y
por la profundidad dada en la cmara.

Los microorganismos resultantes se dividen por 4.

Si se cuanta en el campo No 5, se calcula el numero de microorganismos y se divide por
1 mm2, y por la profundidad dada en la cmara.

DETERMINACIN DE BIOMASA - HONGOS

Se realiza por tos mtodos:

 Peso seco
Volumen de centrifugado

FERMENTACIN AEROBIA
OBJETIVO GENERAL:
Medir todos los Parmetros Cinticos de la Fermentacin y Proponer un modelo cintico.
OBJETIVOS ESPECFICOS:
Determinar la concentracin de Biomasa, Producto (Protena) y Sustrato (Glucosa) a
lo largo de la fermentacin.
Hacer las curvas de calibracin respectivas.
Hacer la curva de crecimiento y determinar los parmetros cinticos.
Proponer modelos que se ajusten a la fermentacin, proponer los parmetros cinticos
apropiados.
MEDIO DE CULTIVO MRS
REACTIVO
Peptona Universal
Extracto de levadura
Extracto de carne
D(+)-Glucosa
K2HP04
Hidrogencitrato diamnico
Acetato sdico
Sulfato de manganeso
MgS04
Tween 80

(g/L)
10
4
8
20
2
2
5
0.04
0.2
1

INOCULO
Ser suministrado por el profesor a partir de un cultivo en medio lquido MRS de
Lactobacllus sp. El inoculo debe ser el 10% del volumen final de la fermentacin.

FERMENTACIN AEROBIA
Realizar el montaje tal como lo muestra la Figura 1

Figura 1. Montaje de la fermentacin

Nota: La aireacin puede ser suministrada mediante un compresor o por agitacin.
TOMA DE MUESTRAS
Se toman 10 mL de muestra cada hora durante 1 das. Inmediatamente despus de la
recoleccin las muestras deben ser centrifugadas durante 5 min.; el sobrenadante debe
cambiarse a otro tubo de ensayo para evitar que la biomasa centrifugada siga
aumentando. Almacene las muestras, tanto el centrifugado como el sobrenadante,
a
4C.
DOSIFICACIN DE LAS MUESTRAS
El sobrenadante es empleado para medir sustrato (glucosa), producto (protena) y pH. El
precipitado es resuspendido en 10 mL de agua destilada para medir biomasa
(Lactobacillus sp.). (Procedimientos similares a las de las curvas de calibracin).
DILUCIONES
De cada una de las muestras para cuantificar sustrato y producto, hacer una dilucin 1/5,
1/10, 1/100. Leer protena, sustrato y biomasa en el colormetro a sus respectivas
longitudes de onda.
INFORME
Hacer la curva de Crecimiento de Biomasa.
Graficar X, S, P, pH vs tiempo.
Determinar Max y Ks.
Encontrar los parmetros cinticos tanto de crecimiento como de formacin de
Productos de los siguientes datos tomados en el laboratorio X, S, P y t.

LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

MICROPROPAGACION

INTRODUCCION.
Una tcnica del cultivo de tejidos vegetales que sea til en el mejoramiento de las plantas
y en los programas de produccin de semillas, es el procedimiento de la propagacin in
Vitro, basado en la proliferacin de explantes de pices o en la produccin de pices
adventicios.
Cientos de plantas idnticas (clones) pueden ser producidos de hibridaciones y/o de
semillas en un periodo relativamente corto usando estos procedimientos. Las lneas
obtenidas pueden incluir esterilidad masculina, tipos de flores femeninas, y lneas que
sean autoincompatibles.
La tcnica de la propagacin in Vitro podra por ejemplo, eliminar la necesidad de guardar
lneas restauradoras o poblaciones de plantas las cuales segregan por virtud del rgimen
de las restauradoras.
Dos mtodos son comnmente usados para lograr una
multiplicacin rpida de una planta seleccionada. Primero, mediante la proliferacin de
yemas sub-terminal de los pices o en segundo lugar, colocando tejidos de la planta en
cultivo e inducir pices adventicios. En un esquema de propagacin donde la integridad
de la capa histognica debe ser mantenida, los pices son los que deben ser empleados.
OBJETIVO

Familiarizarse con la tcnica del cultivo de tejidos, equipos, formulacin de medios y

estrategias para llevar a cabo la propagacin in Vitro va la formacin de pices
adventicios en tomate de rbol y lulo.

MATERIALES Y METODOS
Los estudiantes trabajarn independientemente en la ejecucin de los experimentos. A
cada estudiante se le suministrar el material necesario, medio de cultivo semislido
preparado y el equipo indispensable.
Preparacin de los explantes.
1.

Los explantes a usar sern de plntulas in Vitro, de modo que no necesitarn de

limpieza del tejido.

2.

Tome de la plntula microestacas (explantes) con al menos dos nudos y simbrelos

en el medio de cultivo.

3.

Cuide de mantener la polaridad adecuada de la plntula.

4.

Mantenga siempre la asepsia mientras se encuentre trabajando.

Tratamientos.
1
2
3
4
5

1. MS
2. MS + 0.5 BAP + 0.5 IBA
3. MS + 0.1 BAP + 0.5 IBA
4. MS + 0.5 BAP + 0.1 IBA
5 repeticiones por tratamiento y 5 explantes por unidad experimental, siendo la unidad
experimental un frasco tipo compota.

TOMA DE DATOS Y REPORTE

Use el formato para reportar sus resultados y observaciones.

Responda las preguntas sobre la Micropropagacin.
Examine sus cultivos peridicamente para determinar las respuestas a las
concentraciones y combinaciones de los reguladores de crecimiento.

LABORATORIOS

BIOTECNOLOGIA

UNIVERSIDAD PONTIFICIA BOLIVARIANA

FACULTAD DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
MONTERIA