Lab 3y 4

UNIVERSIDAD DE LOS LLANOS
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS Y RECURSOS NATURALES

INGENIERIA AGRONOMICA
MICROBIOLOGIA AGRICOLA
LABORATORIO N3 Y N4. AISLAMIENTO DE BACTERIAS A PARTIR DE
MATERIAL VEGETAL, PRUEBAS BIOQUIMICAS Y OBSERVACION
MICROSCOPICA DE BACTERIAS
Len Burgos, Andrs F.*EIA1
Mosquera Sabogal-Talissa A.*EIA2
__________________________________________________________
RESUMEN
Unas de las formas ms sencillas de realizar el cultivo puro de bacterias es a
partir de los aislamientos, que se realiz a travs del fruto de tomate que
presentaba una pudricin blanda, implementando el mtodo masivo y por
agotamiento, la siembra se estipulo sin desinfeccin por el mtodo de
agotamiento y se desinfecto con etanol e hipoclorito de sodio, para iniciar con
la inoculacin bacteriana, tomando el asa bacteriolgica en la cual se extrajo la
muestra. Se realiz evaluaciones despus de 48 horas, donde se observaron
colonias de bacterias de consistencia mucosa, presentando una coloracin
amarilla brillante. Por otro lado
la identificacin y observacin
de los
microorganismos, la determinacin de su morfologa juega un papel

fundamental.
Diferencias
en
cuanto
tamao
coloracin
de
los
microorganismos, entre otros, hacen que se presente variaciones en las

tcnicas de montajes, por
esta razn mediante esta prctica
a travs de
algunas pruebas de tincin para la observacin de bacterias, que fueron

extradas del fruto de tomate y sometidas a varios tipos de tinciones, con los
1 Estudiante de ingeniera agronmica, facultad de ciencias agropecuarias y
recursos naturales, escuela de ciencias agrcolas, Villavicencio-Colombia.
2 Estudiante de ingeniera agronmica, facultad de ciencias agropecuarias y
recursos naturales, escuela de ciencias agrcolas, Villavicencio-Colombia.
1

cuales
se busca identificar aquellas variaciones de los montajes y su
morfologa, usando el objeto 100X y aceite de inmersin. Las pruebas ms
significativas fueron la de KOH y catalasa puesto que todas las bacterias
presentaron resultados positivos. En conclusin, las pruebas bioqumicas se
realizan para fermentar azcares, la presencia de enzimas, la degradacin de
compuestos, la produccin de compuestos coloreados, con el fin de llegar a la
identificacin del microorganismo.
INTRODUCCION
Las bacterias asociadas a las plantas pueden ser benficas o dainas
(fitopatgenas). Las bacterias se encuentran entre los microorganismos que
colonizan a las plantas de forma sucesiva a medida que estas maduran.
Poblaciones grandes de bacterias se vuelven visibles en forma de agregados
en medio lquido, como biofilms en plantas, suspensiones viscosas taponando
los vasos de las plantas. Generalmente se requiere poblaciones de 10 6 UFC
(unidades formadoras de colonia/militro) o mayores para que las bacterias
funcionen como agentes de control biolgico, con fines beneficiosos, o como
patgenos, causando enfermedades infecciosas (Agrios, 2005)
De manera general las bacterias como patgenos vegetales pueden causar
enfermedades graves y econmicamente dainas, ocasionando desde
manchas, mosaicos, pstulas en hojas y frutos, o podredumbres malolientes de
tubrculos hasta la muerte de las plantas. Algunas causan distorsin en las
hojas y tallos relacionada con hormonas, llamado agalla de corona, una
proliferacin de clulas vegetales produciendo un abultamiento en el cuello de
las plantas y sus races (APS, 2013).
Entre las principales caractersticas de las bacterias se encuentran su tamao,
forma, estructura y tipo de agrupacin. Todas estas caractersticas van a
constituir la morfologa propia de las clulas bacterianas. Las bacterias son de
pequeo tamao, por lo que para su observacin es necesario el microscopio.
2

Su tamao se mide en micras (1 m = 10-6 m) y oscila entre 0,2 m de algunos
cocos y las 5-8 m de largo por 1,5 m de ancho de los bacilos. El tamao es
una caracterstica para cada tipo bacteriano y se puede medir con gran
exactitud y fiabilidad, en
Cuanto a su forma, una bacteria como organismo individual viene dada por la
rigidez de su pared. Es igualmente una caracterstica de cada tipo bacteriano. Las
bacterias suelen adoptar fundamentalmente alguna de las formas siguientes:
esfrica, cilndrica, helicoidal, filamentosa o formas intermedias de los casos
anteriores.
Los rasgos morfolgicos (estructurales) han ayudado a los taxonomistas por
muchos aos a clasificar organismos. Los organismos superiores tienen rasgos
anatmicos tan diferentes que pueden ser fcilmente utilizados en su
clasificacin, pero con respecto a los microorganismos, stos lucen bajo el
microscopio tan similares que se dificulta su clasificacin, es decir, que estos
microorganismos que se ven tan parecidos bajo un microscopio, pueden diferir en
propiedades bioqumicas, fisiolgicas y/o serolgicas. Sin embargo, aun cuando la
morfologa celular dice poco sobre las relaciones filogenticas, sigue siendo til
para la identificacin bacteriana. Por ejemplo: la presencia de endosporas y su
localizacin resulta de mucha utilidad en la identificacin de bacilos esporulados.
(Gerard J, et al., 2007)
Por esta razn se realiza este trabajo con el fin de caracterizar las bacterias de
acuerdo a su morfologa y a los comportamientos que presenten durante las
pruebas bioqumicas con el fin de determinar caractersticas metablicas de las
bacterias objeto de identificacin.

MATERIALES Y METODOS
Agua destilada.
Aguja de asa
Mecheros con alcohol.
Porta y cubre objetos
Cultivos bacteriales.
Solucin KOH.
Alcohol 12 segundos
Solucin catalasa
Solucin Cristal violeta 30 segundos.

Alcohol 12 segundos.
Safranina.
Mecheros.
Lugol 30 segundo
Microscopio ptico
Solucin de azul de metileno al 1 %
Solucin de safranina al 1 %.
Solucin decolorante (alcohol etlico y acetona 1:1)
Solucin de I2 / I- (yodo / yoduro al 0.1 %)
PROCEDIMIENTO
I.
Aislamiento de bacterias
Las bacterias fueron aisladas del fruto de tomate que presentaba una pudricin
blanda, con el asa bacteriolgica se tomaron las muestras y se sembr en una
caja de Petri con agar nutritivo por medio del mtodo de agotamiento,
posteriormente se desinfecto un trozo del fruto agregando etanol al 70%, se lav
con agua destilada. Una vez desinfectado el tejido se introdujo en un tubo de
ensayo con agua destilada, se aadi hipoclorito de sodio al 0,5%, se lav
nuevamente con agua destilada y se agito, luego por medio de una asa
bacteriolgica se froto en el tejido y se inoculo en el medio de cultivo y se realiz
la siembre por medio del mtodo agotamiento y mtodo de siembra masiva.

Figura 1. Fruto en el cual se aisl las bacterias. (Len, 2015)

II.
Observacin microscpica y pruebas bioqumicas
Una vez realizado el frotis fijado en el portaobjeto con calor se tie 1 min con
Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solucin Yodada durante 1 - 2 min
y se lava de nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol etlico/acetona.
Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 1 2 min. Lavar y
secar.
Figura 2. Prueba de tincin. (Len A, 2015)
Gram (-) se forma un hilo con KOH

Reconocimiento de ureasa----- 7 das despus de realizarla, se observa un
cambio de color (acidez)
Reconocimiento de catalasa ---- hay formacin de burbujas
5

Reconocimiento gelatinasa----- de 2 a 7 dias se deja en la nevera, si esta
no se cuaja y permanece en forma lquida, esto confirma la prueba.
Prueba Indol------ se deja en caldo nutritivo a 34C por 48 horas, despus
de las 48 horas se aade la sustancia Kovacs , si se forma un anillo zapote
, este la confirma.
Hidrlisis almidn : se siembra la bacteria en un trozo de papa dentro de
una caja de petri a 30C por 2 das, luego se le aade lugol , se confirma si
hay cambio de color en la misma.
RESULTADOS
I.
AISLAMIENTO DE BACTERIAS
B.
c.
Figura 3. Aislamiento de bacterias del fruto de tomate. A siembra por el
mtodo masivo. B. Siembra de bacterias sin desinfeccin, C. Conteo de
colonias (Len, 2015)
I.
PRUEBAS BIOQUIMICAS REALIZADAS A LA BACTERIA 6

Tabla 1. Resultados de las pruebas bioqumicas implementadas durante la

prctica.
Bacteria
Gram
KOH
Catalasa
P.
Indol
+
Gelatinasa
SSR
Forma
Movimiento
Hidrlisis
almidon
+
E. Coli
Bacilo
Peritrical
Bacilo
Peritrical
Cocos
Peritrical
(Len A, 2015)
II.
PRUEBAS BIOQUIMICAS REALIZADAS A LA BACTERIA 6
Colonias de la
bacteria 6
Figura 4. Cultivo de la bacteria 6. (Len A, 2015)

Como se ilustra en la imagen, el Medio de cultivo de bacteria 6 Presenta un color
amarillo traslucido brillante, con bordes definidos, de apariencia mucuosa.
PRUEBA GELATINASA.

Figura 5. Resultados de la prueba bioqumica gelatinasa.
El resultado para la prueba de gelatinasa para el caso del cultivo de bacterias 6

fue negativo, ya que este se mantuvo solidificado durante y despus de la
refrigeracin. El resultado esperado era que la bacteria hidrolizara la protena
gelatina y el medio perdiera la caracterstica de ser slido y pasara a lquido
despus de haber sido refrigerada, esto confirma la ausencia de la enzima
gelatinasa.
PRUEBA DE HIDROLISIS DE ALMIDON
Figura 6. Resultados de la prueba de hidrolisis de almidon en papa.

(Len A, 2015)
8

Como se puede observar en las imgenes 4, el resultado de la Prueba de
hidrlisis de almidn fue positiva, ya que hubo manchas de diferentes colores en
el trozo de papa, lo que significa que la bacteria est aprovechando el almidn
como fuente de energa.
PRUEBA BIOQUIMICA SSR
Figura 7. Resultado de la prueba SSR en la bacteria 6

En la prueba SSR, el resultado es negativo, ya que este no tuvo un cambio de
color durante los 7 das transcurridos despus de haber sido montado. El
resultado esperado era un cambio de color, signo de que hubo una disminucin
de su pH (acidez)
PRUEBA DE CATALASA

Figura 8. Resultados de la prueba de catalasa en la bacteria 6.
(Len A,2015)
El resultado de la prueba catalasa fue positivo, esto se debe a la formacin
burbujas, provocada por la reaccin de la enzima catalasa que posee la bacteria
B6 con la hidrlisis o descomposicin del perxido de hidrogeno que se encuentra
en el medio.
Prueba de KOH
Figura 9. Resultados de la prueba KOH. (Len A, 2015)

Como se observa en la imagen, el resultado de la prueba con KOH fue positivo,
debido a la formacin de un Hilo de apariencia mucosa transparente entre el asa
bacteriolgica y el porta objeto.
PRUEBA INDOL
10

Figura 10. Resultados obtenidos en la prueba de indol.

Como se observa en la imagen 7, el resultado de
despus del montaje fue negativo.
la prueba indol 48 horas
PRUEBAS BIOQUIMICAS REALIZADAS A LA BACTERIA B2
Colonias de la
bacteria B2
Figuras 11. Cultivo bacterial B2

El Medio de cultivo de la bacteria B2 Presenta un color amarillo traslucido
fluorescente, con bordes definidos de apariencia gelatinosa, a su reverso la
bacteria presenta un color amarillo ms oscuro.
PRUEBA CATALASA
11

Formacin de
burbujas
Figura 12. Resultados de la prueba catalasa en la bacteria B2

burbujas, provocada por la reaccin de la enzima catalasa que posee la bacteria
B2 con la hidrlisis o descomposicin del perxido de hidrogeno que se encuentra
en el medio.
PRUEBA DE HIDROLISIS DE ALMIDON
Figura 13.Resultados de la prueba de hidrolisis de almidn en la bacteria B2.

Como se observa en la imagen, el resultado de la prueba hidrlisis de almidn
fue positiva, producto de la reaccin se observa la coloracin de tonalidad oscura
en ella.
12

PRUEBA GELATINASA
Figura 14. Resultados de la prueba de gelatinasa

Como se observa en la imagen, el resultado de la Prueba Gelatinasa fue
negativo, ya que la gelatina se mantuvo solidificada despus de la refrigeracin.
PRUEBA INDOL
Figura 15. Resultados de la prueba de indol.
El resultado de la Prueba Indol fue negativo, ya que no hubo cambio de color del
medio durante los 8 das despus del montaje.
PRUEBAS BIOQUIMICAS CON Escherichia coli
Presenta un color verde metalizado oscuro brillante, con bordes definidos, de
apariencia gelatinosa. A su reverso
las bacterias presentan las mismas
caractersticas pero con una tonalidad ms oscura.
13

Figura 16. Resultados de la prueba de hidrolisis de almidon en la bacteria

E.COLI.
El resultado de la prueba hidrlisis de almidn fue positiva, ya que la enzima
amilasa que posee la bacteria E. Coli, hidroliza el almidn presente en el trozo de
papa, como producto de la reaccin se observa la coloracin caf en ella.
PRUEBA DE KOH
Figura 17. Resultados de la prueba KOH.

Como se observa en la imagen, el resultado de la prueba de KOH fue positivo,
esto se debe a la formacin de un hilo de aspecto mucilaginoso.
14

PRUEBA CATALASA
Figura 18. Resultados de la prueba de catalasa

burbujas, provocada por la reaccin de la enzima.
II. OBSERVACION MICROSCOPICA
Las bacterias E. Coli y la B6 a nivel microscpico, sus clulas que presentan
una forma circular alargada, de acuerdo a esas caractersticas propias, se pueden
clasificar en el
gnero Bacillum. Mientras que la bacteria B2 sus clulas
presentan una forma totalmente redondas propias del genero Cocos. Todas
presentaron movimiento peritrical, ya que estas tienen flagelos que se proyectan
en todas las direcciones y puede lograr as una facilidad en el desplazamiento en
cualquier trayectoria.
Figura 19. Observacin microscpica de la bacteria E. coli (Len A, 2015)

Como se observa en la imagen, se determin que la bacteria E. Coli, pertenece al
grupo de las Gram negativa, debido al resultado de la tincin de Gram, ya que dio
15

una coloracin roja y segn la forma de las clulas adoptan que son cilndricas, en
el cual recibe el nombre de bacilos. Imagen microscpica observada a 100x .
Figura 20. Observacin microscpica de la bacteria B6.

Se determin que la bacteria B6, pertenece al grupo de las Gram negativa,
debido al resultado de la tincin de Gram, ya que dio una coloracin violeta y
segn la forma recibe el nombre de bacilos.
Figura 21. Observacin microscpica de la bacteria B2.

Como se observa se determin que la bacteria B2, pertenece al grupo de las
Gram
positiva, debido al resultado de la tincin de Gram, ya que dio una
coloracin morada y segn la forma de las clulas adoptan que son esfricas, en
el cual, recibe el nombre de Cocos. Imagen microscpica observada a 100x.
16

DISCUSION DE RESULTADOS
En el aislamiento de bacterias se observ ms cantidad de colonias de bacterias
en la siembra a travs del mtodo masivo, adems se determin la consistencia
mucosa y una coloracin amarilla brillante que fueron las caractersticas ms
significativas de las bacterias.
Las pruebas bioqumicas han sido ampliamente utilizadas para diferenciar
bacterias. Estas pruebas se fundamentan en demostrar si el microorganismo es
capaz de fermentar azcares, la presencia de enzimas, la degradacin de
compuestos, la produccin de compuestos coloreados, etc., 3 Por lo cual se busca
discutir a continuacin las diferencias que se presentaron durante el desarrollo de
la prctica en las pruebas bioqumicas que se estipularon en las bacterias
trabajadas en el laboratorio.
La tcnica de coloracin de Gram brinda un carcter taxonmico que permite
distinguir empricamente entre bacterias Gram + y gram-. La diferente estructura
qumica de la pared celular es la responsable de esta propiedad (Universidad
Nacional del Noroeste, 2006). En el caso de las bacterias E. coli, B6 Y B2 la
coloracin fue estipulada directamente donde la bacteria e. coli y B6, presentaron
diferencias con la B2, esto se debe a que la E.coli y B6 se tieron de color rojorosado debido a que poseen una capa de petidoglucano mucho ms delgada es
por ello que no retiene el violeta cristal y por esto las clulas se tien con
safranina y las observamos rojas. Para el caso de la bacterias B2 se tieron de
color violeta debido a que su composicin qumica de la pared celular compuesta
nicamente
3 Identificacin microbiana, disponible en,

http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/08_Te
ma_12_identificaci%C3%B3n.pdf, consultado el 01 de abril.
17

de peptidoglicano y rodeada por una membrana exterior compuesta de
fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Generalmente, 80%-90% de la
pared de la clula Gram-positiva es peptidoglicano (Santambrosio , et al., 2009).
En la prueba de gelatinasa el resultado fue negativo, para las bacterias B6 y B2
ya que el medio en el cual se inocularon, se mantuvo solidificado despus de la
refrigeracin, este anomala se presenta debido a que las bacterias no pueden
producirlaexoenzima gelatinasa, que rompelaestructuradelagelatina ylalica, esto
tambin se puede correlacionar con el grado de patogenicidad o virulencia ya que
laenzima permite moverseatravsdel tejido conectivoenelcuerpo.(Esther Z, 2002).
El resultado para la confirmacin de la presencia de la enzima, era que el medio
se mantuviera en estado lquido despus de la refrigeracin as como ocurri con
la bacteria E.Coli, (Bailon , 2003) se puede
observar la capacidad de un
organismo de producir enzimas de tipo proteoltico (gelatinasas) que licuan la

gelatina o hagan perder la propiedad de gelificar.
En la prueba de catalasa, para las bacterias E. Coli, B6 Y B2 fueron positivas,
todas las bacterias presentan la enzima catalasa (desdoblan el agua oxigenada),
ests estn
presentes
en la mayora de los microorganismos que poseen
citocromos. Las bacterias que sintetizan catalasa hidrolizan o descomponen el

perxido de hidrogeno que se encuentra en el medio lquido, en agua y oxigeno
gaseoso que se libera en forma de burbujas. (Ana Olmos, 2010)
2H2O2 2H2O
En la prueba ureasa el resultado de la bacteria E. Coli fue positiva, mientras que

en las bacterias B6 Y B2 fueron negativas, esto se debe a que la bacteria E.Coli
sintetiza la enzima ureasa. Esta enzima cataliza la hidrlisis de urea presente en
el medio a dixido de carbono y amonaco. La produccin de amoniaco provoca
una variacin en
el color del indicador de amarillo a rojo, evidenciando
la
actividad de la ureasa. En las bacterias B6 Y B2 no hubo ningn cambio en el
18

color durante los 8 das transcurridos despus del montaje. Perdurando el color
amarillo del medio.( Jean F, 2000)
CO (NH )
2
2 2+
HO
+
H +2
En la prueba indol para las bacterias E. Coli
2 NH4+ + HCO3
se confirman la presencia de
enzimas triptofanasas, capaces de oxidar o hidrolizar el triptfano, a comparacin

con la bacteria B2 y B6 , que tiene ausencia de esta enzima, y no tiene la
capacidad de oxidar el triptfano presente en la solucin. Las enzimas
triptofanasas oxidan el triptfano para formar tres metabolitos: indol, metil-indol y
cido indol-actico. El indol es un compuesto que se genera mediante la
desaminacin reductiva del triptfano (degradacin metablica del aminocido) y
esta reaccin es llevada a cabo por bacterias que poseen estas enzimas4. Para
detectar la produccin de indol con el que el indol producido, reacciona generando
una coloracin naranja intensa, el cual se observa por la aparicin de un anillo
en la superficie del medio. (Bailon, 2003)
En
la prueba de KOH
fueron positivas para todas las bacterias ya que al
mezclarse el KOH destruye las paredes celulares y se desarrolla el cido

desoxirribonucleico, por lo tanto se obtiene un hilo viscoso en el asa de
inoculacin (Richard ellner,2000)
4 Produccin de indol. Disponible en :

https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-demicrobiologia/indice/identificacion-bacteriana/produccion-de-indol
19

BIBLIOGRAFIA
Agrios, G. N, 2005, fitopatologa, 2da edicin. Mxico, Limusa, 952 p.

American phytopathological society-APS-. Introductory plant pathology
resources. APSnet. Introduction to the major pathogen groups [consultado
enero 2014].
Richard Ellner, Microbiologa de la leche y de los productos lcteos,
ediciones Diaz de Santos, S.A, pagina 117.

Esther Z, Caractersticas fisiolgicas bacterianas , disponible en,
https://ezoraya.files.wordpress.com/2010/06/pruebas-bioquimicas.pdf,
consultado el 31 de marzo
Gerard J, Tortora, introduccin a la microbiologa, 9 a edicin,
medica panamericana, pgina 292.

Jean F , Macfaddin, Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias
editorial
de importancia clnica, 3a edicin, editorial medica panamericana, pgina

407
Eduardo Santambrosio Marta Ortega, ,Pablo A. Garibaldi Tincin y

observacin de microorganismos. (2009), Universidad tecnologica
nacional. Disponible en,
http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia
/practico4.pdf
Lucia Bailon . Atlas de pruebas bioqumicas para identificar bacterias.

Universidad Nacional autnoma de Mxico. 2003, disponible en
http://www.academia.edu/4858992/Atlas_de_pruebas_bioquimicas_para_id
entificar_bacterias, consultado el 31 de marzo
Prueba
indol.
Disponible
en
:
https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-demicrobiologia/indice/identificacion-bacteriana/produccion-de-indol
Mara J. Botero O. et al., Identificacin y caracterizacin de bacteria
asociada con mancha foliar en papachina (aracea) en el pacfico caucano.
Medelln. Colombia 2008.
Ana F. Olmos et al., Mtodos de identificacin bacteriana en el laboratorio
20

de microbiologa. 2010
21

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microorganismos, la determinacin de su morfologa juega un papel

microorganismos, entre otros, hacen que se presente variaciones en las

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algunas pruebas de tincin para la observacin de bacterias, que fueron

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Solucin Cristal violeta 30 segundos.

Solucin de azul de metileno al 1 %

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Figura 1. Fruto en el cual se aisl las bacterias. (Len, 2015)

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Figura 2. Prueba de tincin. (Len A, 2015)

Gram (-) se forma un hilo con KOH

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Figura 4. Cultivo de la bacteria 6. (Len A, 2015)

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Figura 9. Resultados de la prueba KOH. (Len A, 2015)

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la prueba indol 48 horas

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Figuras 11. Cultivo bacterial B2

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Figura 12. Resultados de la prueba catalasa en la bacteria B2

Figura 13.Resultados de la prueba de hidrolisis de almidn en la bacteria B2.

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Figura 15. Resultados de la prueba de indol.

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Figura 17. Resultados de la prueba KOH.

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Figura 18. Resultados de la prueba de catalasa

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Figura 21. Observacin microscpica de la bacteria B2.

positiva, debido al resultado de la tincin de Gram, ya que dio una

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3 Identificacin microbiana, disponible en,

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organismo de producir enzimas de tipo proteoltico (gelatinasas) que licuan la

en la mayora de los microorganismos que poseen

citocromos. Las bacterias que sintetizan catalasa hidrolizan o descomponen el

En la prueba ureasa el resultado de la bacteria E. Coli fue positiva, mientras que

el color del indicador de amarillo a rojo, evidenciando