LEVADURAS AUTÓCTONAS EN VIÑEDOS Y BODEGAS

RECIENTEMENTE ESTABLECIDOS EN NEUQUEN, PATAGONIA

ARGENTINA

MARCELA SANGORRÍN1,3, RAÚL BARBAGELATA1, CHRISTIAN LOPES1,2,3, MARÍA E.

RODRÍGUEZ1, y ADRIANA CABALLERO1..Laboratorio de Microbiología, Dpto. de
Química, Facultad de Ingeniería y 2- Laboratorio de Microbiología Agrícola, Dpto. de
Biología Aplicada, Facultad de Cs. Agrarias. U.N.Comahue, Buenos Aires 1400 (8300)
Neuquén. 3- CONICET. E-mail: msangorr@uncoma.edu.ar

RESUMEN

Con el objetivo de seleccionar levaduras para uso enológico autóctonas de la nuevas

áreas vitivinícolas de la provincia del Neuquén, en este trabajo se caracterizó cualitativa y
cuantitativamente la biota de levaduras asociadas a uvas Merlot (vendimia 2005) y
Malbec (vendimia 2006) procedentes de viñedos de San Patricio del Chañar y a sus
mostos de fermentación naturales. El estudio se realizó en tres viñedos y sus respectivas
bodegas denominadas en este trabajo como FS, FM y NQ. El aislamiento se realizó en
medio completo (GPY) a pH=4,5-5,0. La identificación de especies se realizó por métodos
convencionales y moleculares (ITS1-5.8 S ADNr-ITS2 PCR/RFLP) y la caracterización de
la diversidad intraespecífica de las poblaciones de S. cerevisiae por RFLP-mtADN. Las
uvas Malbec presentaron una mayor densidad de células que las uvas Merlot aunque en
ambos varietales la biota de levaduras fue aeróbica estricta con predominancia de la
yeast-like Aureobasidium pullulans (76% vs 60%) seguida de Cryptococcus sp. (24% vs
26%). Adicionalmente, en el varietal merlot se identificaron levaduras pigmentadas de las
especies Sporobolomyces roseus (8%), Rhodotorula mucilaginosa, glutinis y graminis (2%
de c/u). Respecto de las especies asociadas al proceso fermentativo, sólo en los mostos
iniciales Merlot se identificaron levaduras fermentativas pertenecientes a la especie
Kloeckera apiculata/Hanseniaspora uvarun (15% en FS, 5% en FM, 5% en NQ), el resto
de la biota fue toda sacaromicética (Saccharomyces cerevisiae). El análisis de la
diversidad intraespecífica evidenció la presencia de 38 cepas diferentes de S. cerevisiae, 8 de
las cuales correspondieron a cultivos iniciadores utilizados en las bodegas, evidenciando que
las levaduras comerciales permanecen en el ambiente de las mismas y son capaces de
desarrollarse en otras fermentaciones. Si bien no se encontraron cepas comunes a las tres
bodegas, algunas de ellas se repiten los dos años en un número considerable de
aislamientos y sobreviviendo hasta los estadios finales de las fermentaciones. Estas cepas
indígenas se seleccionaron y están siendo evaluadas en sus propiedades enológicas.

Palabras clave: fermentaciones naturales; levaduras vinicas; diversidad; Patagonia.

1. INTRODUCCION
El reemplazo de cultivos iniciadores foráneos por el de levaduras autóctonas es una
práctica cada vez más frecuente en las diferentes regiones vitivinícolas del mundo con
el objetivo de obtener vinos de calidad superior (Querol y Ramón 1996; Pretorius 2000).
Estas levaduras autóctonas de cada región, mejor adaptadas a las características
agroecológicas del cultivar, contribuyen al control del proceso fermentativo favoreciendo
la elaboración de productos de calidad controlada y diferencial, potenciando en los vinos
las notas aromáticas y gustativas específicas de cada área o terroir (Ranieri y Pretorius
2000). La incorporación a la industria regional de cultivos iniciadores autóctonos
aparece como una herramienta estratégica para la diversificación, diferenciación y
protección de sus productos (Combina 2003), otorgándoles mayor valor agregado y
mejores posibilidades de competencia en el mercado internacional y de respuesta a las
nuevas exigencias del mercado interno. La selección de levaduras autóctonas para el
desarrollo de cultivos iniciadores autóctonos obliga previamente a relevar las
características particulares del la biota de levaduras regional asociada al proceso de
vinificación. Con el objetivo de seleccionar levaduras para uso enológico autóctonas de
la nuevas áreas vitivinícolas de la provincia del Neuquén, en este trabajo se caracterizó
cualitativa y cuantitativamente la biota de levaduras asociadas a uvas Merlot (vendimia
2005) y Malbec (vendimia 2006) procedentes de viñedos de San Patricio del Chañar y a
sus mostos de fermentación naturales.

2. MATERIALES Y MÉTODOS
El muestreo se realizó durante las vendimias 2005 (Merlot) y 2006 (Malbec) en tres
viñedos de la Pcia. del Neuquén y sus respectivas bodegas denominadas en este
trabajo como FS, FM y NQ. Las edades de los cuarteles de vid y de las bodegas
variaron entre 8 (FM) y 5 años (FS y NQ) al momento del muestreo.
2.1 OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS
• Uvas. Los racimos de uvas se recolectaron mediante muestreos en cruz de cada
cuartel, seleccionándose al azar una o dos uvas sanas por racimo. Las
suspensiones de levaduras se obtuvieron por agitación de cada baya en agua estéril
(3 mL/baya) seguida de sonicación por transmisión en agua, previa transferencia en
forma aséptica de cada baya a otro recipiente conteniendo también 3 mL de agua
estéril. Para realizar el recuento y aislamiento se juntaron ambos volúmenes.

1
 • Mostos. Las muestras fueron recolectados por el enólogo de cada bodega en
frascos estériles de 1 L en tres estadios de la fermentación: inicial (14-12 ºBmé),
medio (6ºBmé) y final (<1ºBmé). Las muestras refrigeradas se enviaron al
laboratorio y se procesaron inmediatamente. Las suspensiones de levaduras se
obtuvieron colocando 1 mL de mosto, previamente homogeneizado, en nueve
mililitros de agua destilada estéril.
2.2 AISLAMIENTO Y RECUENTO DE LEVADURAS
Alícuotas de 0,1 mL procedentes de las suspensiones de levaduras obtenidas de las
uvas y de diluciones sucesivas (10-2 a 10-6) de suspensiones de mostos se sembraron
en placas de GPY (pH=4,5-5,0) por diseminación en superficie y por duplicado. Las
placas se incubaron entre 48 a 72 h a 26°C efectuándose entonces el recuento de las
unidades formadoras de colonias (UFC). El aislamiento se realizó conforme a la
morfología de las colonias y a sus frecuencias de aparición.
2.3 IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS Y DISCRIMINACIÓN DE CEPAS
La identificación de las levaduras aisladas se llevó a cabo utilizando métodos
convencionales (Kurtzman and Fell 1998) y moleculares (ITS1-5.8S ADNr-ITS2 PCR-
RFLP, Esteve-Zarzoso et al.,1999).
Para la discriminación de cepas se realizó únicamente en aislamientos del género
Saccharomyces utilizando el método del mitDNA RFLP (Querol et al., 1992).

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados evidencian un mayor número de levaduras viables en uvas del
viñedo más antiguo (FM) y en el varietal Malbec que en el Merlot (Tabla 1), aunque la
diversidad fue mayor en este último. Tanto en el varietal Malbec como en el Merlot la
biota levaduriforme fue aeróbica estricta con predominancia de la yeast-like
Aureobasidium pullulans (76% vs 60%) seguida de Cryptococcus sp. (24% vs 26%).
Adicionalmente, en uvas Merlot se identificaron levaduras pigmentadas de las especies
Sporobolomyces roseus (8%), Rhodotorula mucilaginosa, glutinis y graminis (2% de c/u)
(Figura 1). En las fermentaciones naturales únicamente se observaron diferencias
significativas en la extensión y diversidad de la biota asociada a mostos iniciales.
Nuevamente la bodega FM presentó una mayor densidad de levaduras viables pero,
contrariamente a lo observado en uvas, la extensión fue mayor en los mostos Merlot
que en los Malbec (Tabla 1). Respecto de la diversidad, levaduras fermentativas no
sacaromicéticas de la especie Kloeckera apiculata/Hanseniaspora uvarun se aislaron de
mostos iniciales Merlot (15% en FS, 5% en FM, 5% en NQN) aunque no de Malbec. En

2
estos últimos, así como en los mostos medios y finales de ambos varietales, la biota fue
100% sacaromicética (Figura 1).

Tabla 1: Cuantificación de levaduras asociadas a uvas y mostos de viñedos del Neuquén

Uvas (CFU/uva) Mosto inicial(CFU/mL)
BODEGA
MERLOT MALBEC MERLOT MALBEC
5 4
FS 153±90 2154±415 1,7 10 ±0,9 10 4,1 104±8,7 103
FM 712±320 3819±1939 6,1 107±5,6 106 1,4 106±2,1 105
NQ 105±70 245±21 3,5 105±1,0 104 3,9 104±7,2 103
Para todos los viñedos y varietales Uvas: n=20 y Mostos n=2
.

1 PM 2 3 1 2 PM 3
1 2 PM 3 1 2 3 PM 1 2 3 PM 1 PM 2 3 E1 F1 PM E2 F2 E3 F

A B C D EyF G H

Figura 1: Perfiles de restricción obtenidos para distintos aislamientos de levaduras asociadas a uvas
y mostos del Neuquén.1: Endonucleasa CfoI; 2: HaeIII; 3: HinfI y PM: Marcador de peso molecular,
escala de ADN de 100 pb, las flechas indican las bandas de ADN correspondientes a un tamaño de
500 pb. A: Aureobasidium pullulans. B: Cryptococcus magnus C: Sporobolomyces roseus. D:
Rhodotorula mucilaginosa. E: Rhodotorula graminis. F: Rhodotorula glutinis. G: Saccharomyces
cerevisiae. H: Kloeckera apiculata.

Estudios comparativos con resultados obtenidos en viñedos y bodegas de más de

20 años de antigüedad del Alto Valle del Río Negro para los mismos varietales
evidencian que la extensión y diversidad de la biota de levaduras de uvas y mostos
iniciales reportadas en este trabajo son significativamente menores a las de aquellas
(van Broock et al , 1996; Rodríguez 1999; Lopes 2004;). Estas diferencias que podrían
estar relacionadas con la edad de estos ecosistemas artificiales.

El análisis de la diversidad intraespecífica de las poblaciones de S. cerevisiae

utilizando mitDNA-RFLP evidenció la presencia de 38 cepas diferentes, algunos de cuyos
perfiles se muestran en la Figura 2. Nuevamente la Bodega FM y las fermentaciones del
varietal Merlot presentaron mayor diversidad (Tablas 2, 3 y 4). Ocho de las cepas identifica-

3
 N FM
FS
1 2 3 4 5 PM PM 6 7 PM 8 9 10 11 PM 12 13 14 15 16 PM 17
1: Perfil XLI (cepa nativa Merlot)
2: Perfil IV (starter 5)
3,4 y 5: Perfil VI (starters 9,13,14 y 17)
6: Perfil XXXIX (cepa nativa Merlot)
7: Perfil XXXIII (cepa nativa Malbec)
8: Perfil XI (cepa nativa Merlot y Malbec)
9 y 10: Perfil XVII (cepa nativa Merlot y Malbec)
11: Perfil VI (starters 9,13,14 y 17)
12: Perfil III (starter 3)
13: Perfil XLVII (cepa nativa Merlot)
14: Perfil III (starter 3,)
15: Perfil XLV (cepa nativa Malbec)
16: Perfil XLVI (cepa nativa Malbec)

Figura 2 : DNAmit RFLP de aislamientos de levaduras asociadas a mostos naturales de bodegas de la Pcia. de
Neuquén. PM: marcadores de peso molecular.

Tabla 3: Diversidad intraespecífica de S. cerevisiae en

fermentaciones naturales de la Bodega NQ
Tabla 2: Diversidad intrespecífica de S. cerevisiae en Perfil Número aislamientos
fermentaciones naturales de la Bodega FM mtDNA-
MALBEC 2006 MER LOT 2005
RFLP)
Número de aislamientos
INICIAL MEDIO FINAL INICIAL MEDIO FINAL
Perfil
mtDNA- IV* 4 3 1 - 3 1
MALBEC 2006 MER LOT 2005 VI 3 5 5 6 6 7
RFLP
INICI MEDIO FINAL
INICIAL
MEDIO FINAL V - 1 - - - -
AL
XXXVI - - - 1 - -
I 2 XXXVII - - - 1 - -
II* 1 XXXVIII - - - - 1 -
IV 1 1 2 XXXIX - - - - - 1
V 1 XL 1 - - - - -
VI 1 4 5 XLI - - 1 - - -
VIII 1 1 TOTAL 8 9 7 8 10 9
XI 2 1 1 2 1 AISLAM.

XII 1 pm starters: números romanos cursiva.*Usado en 2005 y 2006

XIII 2 1
XIV 1 1
XV 1 Tabla 4: Diversidad intraespecífica de S. cerevisiae en
XVI 1 fermentaciones naturales de la Bodega FS
XVII 5 3 1 1 Perfil
mtDNA- Número de aislamientos
XIX 1
XX 3 RFLP MALBEC 2006 MER LOT 2005
XXI 1 INICIAL MEDIO FINAL INICIAL MEDIO FINAL
XXII 1 III* 1 1 2 - -
XXIII 2 2 VII - - - 1
XXVII 1 X LII - - - 1 2 -
XXXIII 1 XLIII - - - - 1
XXXIV 1 XLIV - - - - 1 -
XXXV 1 XLV 4 1 2 - - -
TOTAL 10 10 10 10 10 9
AISLAM.
XLVI 2 3 2 - - 1
Perfiles moleculares (pm) de starters: en números romanos XLVII - - - 1
cursiva.*Usado en 2006 XLVIII 1 1 2 7 1 5
XLIX - - 1 - -
TOTAL 8 6 9 8 6 7
AISLAM.
pm starters: en número romano cursiva.*Usado en 2006

4
das correspondieron a cultivos iniciadores utilizados en las bodegas en los años estudiados
y en años anteriores (Tablas 3, 4 y 5) evidenciando la presencia de contaminaciones
cruzadas (Tablas 3 y 4) así como también la capacidad de las levaduras comerciales de
permanecer viables en el ambiente de las bodegas y de participar en fermentaciones tiempo
después de su uso (Tabla 2 y 3, starter VI). Algunos de los perfiles moleculares detectados
en dos de las tres bodegas aparecen los dos años independientemente del varietal y en un
número considerable de aislamientos (Tablas 2 y 4). Estas cepas indígenas se
seleccionaron y están siendo evaluadas en sus propiedades enológicas. Los resultados
parecen indicar la presencia de una biota particular para cada bodega aunque resulta
necesario realizar estudios adicionales y sostenidos durante un mayor número de años para
confirmar esta hipótesis.

REFERENCIAS
COMBINA, M. (2003). “Selección de levaduras y bacterias ecotípicas como herramienta
para la diferenciación de vinos”. En: II Congreso Argentino de Microbiología de
Alimentos. Mesa redonda. Santa Fe, Setiembre 2003.
ESTEVE-ZARZOSO, B., BELLOCH, C., URUBURU, F. and QUEROL, A. (1999).
“Identification of yeasts by RFLP analysis of the 5.8S rRNA gene and two ribosomal
internal transcribed spacers”. International Journal of Systematic Bacteriology 49: 329-
337
KURTZMANN, C.P. and FELL, J.W. (1998). “The yeast, a taxonomic study”.
Amsterdam. Elseiver Science Publications. ISBN 0-444-81312-8
LOPES, C.A. (1999). “Aislamiento, cuantificación y caracterización de la flora de
levaduras asociada a uvas regionales”. Tesis de grado. Universidad Nacional del
Comahue. Neuquén. Argentina.
PRETORIUS, I.S. (2000). “Tailoring wine yeast for the new millennium: novel
approaches to the ancient art of winemaking”. Yeast 16: 675-729
QUEROL, A., BARRIO, E., HUERTA, T. and RAMÓN, D. (1992). “Strain for use as dry
yeast in fermentation of Alicante wines: selection and DNA patterns”. Journal of Food
Science 57:183-185
QUEROL, A and RAMÓN, D. (1996). “The application of molecular techniques in wine
microbiology”. Trends in Food Science and Technology 7: 73-78
RAINIERI, S. and PRETORIUS, I.S (2000). “Selection and improvement of wine yeasts”.
Annals of Microbiology 50: 15-31
RODRÍGUEZ, M.E. (1999). “Flora de levaduras y características enológicas de mostos
fermentados espontáneamente en ambientes de bodega y de laboratorio”. Tesis de
Grado. Universidad Nacional del Comahue. Argentina.
VAN BROOCK, M.R., ZAJONSKOVSKY, I.E., ASSADOURIAN, M.I., LAVALLE, T.L. and
CABALLERO, A.C. (1996). “Wine yeasts associated to Merlot type grapes from North
Patagonian Region. An ecological study”. En: 10th International Biotechnology
Symposium y 9th International Symposium on Yeasts. pp. 13-5. Sydney, Australia.