inmovilizacin

Una estrategia metodolgica interesante que se

presenta como alternativa al empleo de clulas en
suspensin es la inmovilizacin de clulas vegetales.
El primer trabajo publicado en 1966 fue sobre la
especie Umbilicaria pustulata y se emplearon geles
de poliacrilamida.
Toda la tecnologa de inmovilizacin de clulas
viables se ha desarrollado sobre la base de los
conocimientos existentes de inmovilizacin de
enzimas.

El empleo de clulas enteras inmovilizadas presenta una

serie de ventajas frente a las enzimas aisladas:
Se evita los procesos de aislamiento y purificacin
enzimtica.
Las enzimas de inters se hallan en su ambiente celular
natural con lo que aumenta su estabilidad y consecuentemente
la vida til del sistema permitiendo la reutilizacin del material
cataltico.
El ambiente celular provee a las enzimas de los cofactores,
coenzimas y dems compuestos necesarios para asegurar una
ptima actividad, adems de brindar buenas condiciones de
temperatura y pH.
Los sistemas celulares permiten el desarrollo de reacciones
multienzimticas.

Inmovilizacin celular

Condiciones bsicas que debe reunir un mtodo

Sencillez de preparacin
Baja toxicidad de la matriz y de los elementos de
preparacin
Bajo costo
Alta resistencia mecnica
Baja o nula interferencia en los procesos de
purificacin de productos
Posibilidad de alternar ciclos de crecimiento y ciclos
de produccin y/o biotransformacin

Inmovilizacin celular
Por adsorcin

Adsorcin a
soportes inertes

Por entrampamiento

Inclusin en estructuras
preformadas
Entrampamiento en matrices
polimricas

Inmovilizacin celular

Adsorcin a soportes inertes

Bolillas de vidrio
Virutas de madera, etc
Inclusin en estructuras preformadas
Biorreactores de fibra hueca
Espumas de poliuretano
Membranas de nylon

Inmovilizacin celular

Entrampamiento en matrices polimricas

Matrices que polimerizan por reacciones de radicales
libres (Geles de poliacrilamida)
Matrices que polimerizan por enfriamiento (Agar)
Matrices que polimerizan por cross-linking (Alginato,
Carragenanos, Celulosas, etc)

Las matrices que polimerizan por enfriamiento

como el agar pueden ser quebradas
mecnicamente y colocadas en una fase lquida
hidrfoba.
El problema fundamental de los mtodos que
utilizan poliacrilamida es la toxicidad de los
iniciadores y agentes de entrecruzamiento
utilizados en el proceso de polimerizacin que
en muchos casos han sido causantes de una
baja viabilidad celular.

Matrices que polimerizan por

cross-linking
El -carragenano
Heteropolisacrido no txico aislado de algas
marinas.
Esta compuesto por sulfato de -D-galactosa y 3,6anhidro--D-galactosa
Gelifica por enfriamiento o en solucin con algn
agente inductor como K+, NH4+, Ca++, Cu++, Mg++ o
Fe+++, aminas o solventes orgnicos miscibles con
agua.

Matrices que polimerizan por

cross-linking

Inmovilizacin celular:
en esferas de celulosa-polidimetilpirrolidilamonio
Sulfato de celulosa

Cloruro de polidimetilpirrolidilamonio

-O4SO

O
O

OSO4-

-O4SO

-O4SO

-O4SO

O
OSO4-

O
O
OSO4-

O
O

OSO4-

OSO4-

-O4SO
O

-O4SO

-O4SO
O
O

O
O

OSO4-

OSO4-

Matrices que polimerizan por

cross-linking
Inmovilizacin celular: en esferas alginato
Alginato (Acido manurnico 1,4)
OH

O
O

O
O

CaCl2

O
O

O
OH

Ca

Ca

O-

O-

O
O

O
O
O

O
O

O
O-

O-

Ca

Ca

O-

O-

O
O

O
O
O

O
O

O
O

O
O

O
O-

Ca

O-

Ca

Inmovilizacin celular: Metodologa de trabajo

Perlas de alginato

Mezcla de solucin de alginato

Y cultivo celular en medio libre
De agentes complejantes de Ca++

Solucin de Ca++

Perlas de alginato

Esponjas de poliuretano

Algunos ejemplos de metabolitos de inters comercial

producidos en sistemas de clulas vegetales
inmovilizadas

Especie

Matriz

Producto

Comentarios

Catharanthus roseus

Agarosa

Catelamina

Suministro
ajmalicina

Catharanthus roseus

Alginato

Alcaloides
indlicos

Prolonga capacidad
biosinttica

Catharanthus roseus

Alginato

Ajmalicina

Prolonga estabilidad y
capacidad biosinttica
(220 dias con cambio
de medio)

Catharanthus roseus

Xantanos/po Serpentina
liacrilamida

Prolonga estabilidad y
capacidad biosinttica
(180 dias con cambio
de medio)

de

Algunos ejemplos de metabolitos de inters comercial

producidos en sistemas de clulas vegetales
inmovilizadas

Especie

Matriz

Producto

Comentarios

Daucus carota

Alginato

5--hidroxidigitoxigenina

Tcnica: Suministro de
precursor
(digitoxigenina)

Daucus carota

Alginato

fenoles

No hay variaciones con

respecto a cultivos
no inmovilizados

Algunos ejemplos de metabolitos de inters comercial

producidos en sistemas de clulas vegetales
inmovilizadas

Especie

Matriz

Producto

Comentarios

Digitalis lanata

Alginato

-metildigoxina Suministro de precursor:

-metildi-gitoxina

Digitalis lanata

Alginato

digoxina

Suministro de precursor:
digitoxina

Algunos ejemplos de metabolitos de inters comercial

producidos en sistemas de clulas vegetales
inmovilizadas

Especie

Matriz

Producto

Beta vulgaris

Nylon

Capsicum frutescen

Espuma de Capsaicina
poliuretano

Betacianina

Comentarios
Incrementa
acumulacin
Incrementa
rendimiento

Algunos ejemplos de metabolitos de inters comercial

producidos en sistemas de clulas vegetales
inmovilizadas
Solanum

Especie

Matriz

Producto

Comentarios

Morinda citrifolia

Alginato

Antraquinonas Incrementa acumulacin

intracelular

Talictrum minus

Alginato

Berberina

Incrementa liberacin

Solanum surretense

Alginato

Solasodina

Incrementa liberacin

Lithospermun
erithrorhysum

Fibra
hueca

fenoles

Incrementa rendimiento.

Mtodologas para inmovilizar por entrampamiento

Parmetros a controlar en un sistema

inmovilizado:

viabilidad
crecimiento celular
capacidad biosinttica

Mtodos para evaluar la viabilidad de un cultivo inmerso

en una matriz inerte
Colorimtricos: azul de Evans y diacetato de
fluorescena
Medicin de parmetros de crecimiento como consumo
de O2 y produccin de CO2 con electrodos selectivos en
cultivos no continuos.

Mtodo no destructivo de Parr et al., que permite

determinar y expresar de manera porcentual el
volumen ocupado por clulas viables en una matriz de
inmovilizacin.
Se basa en la determinacin de la dilucin diferencial de dos molculas
marcadas radioactivamente.
Una de ellas no debe penetrar a las clulas y la otra debe difundir libremente
La primera es manitol u otro polialcohol no metabolizable marcado con 14C
y la otra es agua marcada con 3H.
El mtodo determina el "volumen viable" expresado como el espacio
porcentual que excluye manitol pero no agua expresado de otra manera las
clulas viables se sacan de la relacin entre el 3H y el 14C puesto que
excluyen al manitol y utilizan el agua.

Tambin pueden monitorearse por RMN la

cantidad de metabolitos fosforilados como
ndice de actividad metablica
este es un mtodo no invasivo que se basa en
cuantificar la cantidad de ATP o el uptake de
fosfatos por medio de 31P-RMN.

Capacidad biosinttica: Debe ser evaluada

especficamente
de acuerdo con el
propsito del sistema en particular
ya sea en su capacidad de producir un
metabolito determinado por sntesis de
novo, o a partir de precursores sistemas o
bien en su actividad enzimtica especfica
para producir reacciones de bioconversin.

El empleo de clulas inmovilizadas ofrece una serie de ventajas

vinculadas al estado fisiolgico y al diseo y modo de operacin del
proceso fermentativo.
El entrampamiento en matrices inertes permite un gran contacto
intercelular y la generacin de gradientes fsicos y qumicos que
conducen a un mayor grado de diferenciacin.
Al estar minimizada la tasa de reproduccin celular la inestabilidad
gnica se disminuye notablemente.
Se alcanzan fases estacionarias prolongadas lo cual es muy importante
cuando la produccin esta asociada a la idiofase o al final de la etapa
exponencial

Estos sistemas permiten desacoplar las fases de crecimiento y

produccin facilitando el empleo de estrategias como la elicitacin
bitica y abitica o la permeabilizacin para incrementar la
produccin
Es posible realizar ciclos alternantes de rejuvenecimiento/crecimiento
para mantener la viabilidad y capacidad biosinttica.
las clulas inmovilizadas permiten operar en sistemas continuos a
altas velocidades de disolucin sin riesgo de lavado de los cultivos
Es posible controlar el tamao de los agregados celulares en caso de
ser importante esa variable para la acumulacin y/o produccin de
metabolitos.

Con la biomasa entrampada es ms sencillo trabajar con procesos en

dos fases, lo ms comn es realizar una de crecimiento previo a la
inmovilizacin y la segunda de produccin inmovilizando cuando el
cultivo ha llegado a su etapa estacionaria.
En cultivos inmovilizados se facilita la remocin de inhibidores
metablicos
se protege a las paredes celulares de las fuerzas de corte

Con inmovilizacin es posible lograr: sistemas de produccin de

metabolitos de una vida til prolongada puesto que se puede
reutilizar la biomasa y realizar una recuperacin continua de los
productos.
Es posible inducir la liberacin al medio extracelular los metabolitos de
inters que naturalmente no son excretados mediante el empleo de
agentes permeantes, especialmente DMSO
El empleo de estos sistemas se encuentra limitado a la produccin de
compuestos secundarios y la realizacin de procesos de
bioconversin dnde los productos de inters se liberen al medio de
cultivo.