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TESIS
Que para obtener el grado de
Maestro en Ciencia en Produccin Agrcola Sustentable
DIRECTORES DE TESIS
Dra. MARA VALENTINA ANGOA PEREZ
Dra. HORTENCIA GABRIELA MENA VIOLANTE
AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer principalmente a la Dra. Mara Valentina Angoa Prez por haber
dirigido mi proyecto de maestra, por el apoyo otorgado durante estos aos, por
inspirarme y recordarme que la investigacin es ms que solo conocimiento, es
pasin, entrega y esfuerzo, adems de ser un ejemplo como profesora y amiga.
As mismo quiero agradecer a aquellas personas involucradas en el desarrollo de
este trabajo; a la Dra. Hortencia G. Mena Violante por sus contribuciones en la
investigacin, as como en mi formacin profesional y por aceptar ser la codirectora
de este proyecto; al Dr. Carlos Vctor Muoz Ruz y al Dr. Luis Fernando Ceja Torres
por su apoyo y disponibilidad en la realizacin de esta tesis y en mi formacin como
investigadora.
De la misma manera tambin extiendo mi agradecimiento a la M.C. Guadalupe
Oyoque Salcedo por su gran apoyo en la realizacin de este proyecto y por su
confianza y amistad que surgi desde mi llegada al centro de investigacin, tambin
agradezco Erendira Jazmn Medelln por su apoyo en el laboratorio y su amistad; as
como al personal administrativo. As como algunas compaeras especialmente a
Guadalupe Samano, Berenice, Martha
Agradezco tambin al Dr. Jorge Molina Torres por haberme aceptado en su
laboratorio y estar al pendiente en la realizacin de una parte importante de mi
trabajo de investigacin, as como al M. en C. Enrique Ramrez por su apoyo en el
laboratorio.
DEDICATORIA
Reza un dicho; reconoce y valora a los que estn a tu lado, ellos son en gran medida
los causantes de tus xitos.
Por lo tanto, este trabajo lo dedico especialmente a mis padres Carolina Gmez
Cervantes y Bernab lvarez Gonzlez por su apoyo y amor incondicional, por cada
palabra de aliento ante cualquier obstculo y por inspirarme a salir adelante cada da,
agradezco su confianza, consejos y valores que me han inculcado para llegar a ser la
persona que hoy soy.
Tambin le dedico este pequeo gran esfuerzo a mis hermanos: Citlalli, Jimena y
Samuel por animarme a cumplir nuevas metas. A mi ta consentida Leticia por su
apoyo y grandes consejos, a mi pequea sobrina Regina a quien espero le interese
la investigacin algn da, as como a mis abuelos y principalmente a mi abuela
Margarita a quien siempre tengo en mente y corazn y a toda mi familia por estar
conmigo siempre. As mismo, le dedico este trabajo a mi novio Luis por su apoyo en
los ltimos aos y por compartir su vida conmigo.
NDICE
RESUMEN ...11
ABSTRACT .13
1. INTRODUCCIN ...14
2. ANTECEDENTES 16
2.1.
2.3.
Botrytis cinerea 22
2.4.
2.3.3.1.
2.3.3.2.
Penetracin ...26
2.3.3.3.
2.3.3.4.
2.3.3.5.
2.3.3.6.
Esporulacin y dispersin 27
Alternativas de control 28
2.4.1.2.
2.4.1.3.
Clasificacin de agroqumicos 31
2.5.
2.6.
2.5.1.1.
Fenilpropanoides ..36
2.5.1.2.
Terpenoides ......37
2.5.1.3.
Alcaloides ...37
3. OBJETIVO 43
3.1.
4.2.
4.3.
4.4.
4.6.
4.7.
5. RESULTADOS ...50
5.1.
5.2.
5.3.
5.4.
ndice de Tablas
TABLA 1
TABLA 2
TABLA 3
ndice de Figuras
FIGURA 1
Planta de fresa ..
17
FIGURA 2
19
FIGURA 3
22
FIGURA 4
FIGURA 5
FIGURA 6
51
53
55
RESUMEN
el
crecimiento
micelial
del
patgeno.
Esta
actividad
12
ABSTRACT
13
1. INTRODUCCIN
susceptibilidad
al
ataque
de
Es por esto que en los ltimos aos se han estado buscando alternativas que
contrarresten dichos efectos, como aquellas obtenidas a partir de insumos biolgicos
como los bioproductos los cuales son elaborados a partir de organismos vivos o
recursos renovables e incluso del uso de prcticas culturales tradicionales en
combinacin con las nuevas prcticas tecnolgicas. Estos se consideran elementos
clave en el manejo integrado de los cultivos, siendo el control biolgico una
herramienta que utiliza estos recursos para mantener las poblaciones de especies
dainas en cultivos por debajo de niveles que causen daos econmicos (Gudez y
col., 2008).
Una alternativa que se ha estado evaluado desde hace ya algunos aos, es el
uso de extractos de plantas, que presenten actividad antimicrobiana, la cual es el
resultado de la presencia de distintos grupos de compuestos qumicos naturales,
conocidos como metabolitos secundarios tales, como los fenilpropanoides,
terpenoides y los compuestos nitrogenados que son producidos por la planta a partir
ante cualquier tipo de estrs generado.
Es as que el uso de plantas de fresa como insumos biolgicos para la
obtencin de extractos vegetales, con potencial antimicrobiano resulta importante
para el manejo sustentable del cultivo de fresa en Michoacn, tomando en cuenta
que en el ltimo ao el cultivo de fresa ocup una superficie sembrada de 4,325 ha
(SIAP-2012) con aproximadamente de 55 a 60 mil plantas/ha, las cuales cada ciclo
de siembra son importadas pagando regalas a las compaas productoras de
plantas, y al final de su ciclo son desechadas y muy poca cantidad es reintegrada al
cultivo como abono verde. Por lo tanto el objetivo del trabajo fue probar extractos
vegetales de la planta de fresa de ciclo productivo terminado para el control del
hongo fitopatgeno B. cinerea.
15
2. ANTECEDENTES
2.1.
Generalidades Fresa
La fresa es un fruto que se consume a nivel mundial tanto en fresco como procesado
en un gran nmero de productos, debido a su sabor y aroma, y sus propiedades
nutricionales como su contenido de vitamina A y C, y de compuestos antioxidantes.
De acuerdo a diversas investigaciones estos compuestos ayudan a contrarrestar
efectos involucrados en procesos de oxidacin que se encuentran relacionados con
algunas patologas crnico degenerativas como las enfermedades cardiovasculares,
diabetes, cncer, y enfermedades neurodegenerativas (Rivera, 2012).
2.1.1.
Descripcin de la Fresa
Las hojas son el rea fotosinttica de la planta, son trifoliadas, dentadas, blancas por
el envs y color verde brillante del haz. Poseen una gran cantidad de estomas, entre
300 y 400 mm-2 por lo que presentan una elevada tasa de transpiracin. El estoln es
un brote que se forma a partir de yemas auxiliares de las hojas, que se encuentran
situadas en la base de la corona, son rastreros, largos, delgados y pueden ser
usados fcilmente para propagacin obteniendo plantas hijas. Las flores son los
rganos reproductivos de la planta, son de color blanco, con cinco a seis ptalos.
Pueden ser perfectas con rganos femeninos (pistilos) y masculinos (estambres), o
imperfectas con solo un tipo de rgano reproductor. Las inflorescencias se
encuentran formadas con una flor al extremo de cada eje. Las inflorescencias
pueden ser de forma basal o distal y el fruto es comestible denominado
botnicamente eterio un fruto falso formado por un engrosamiento del receptculo
floral, siendo los aquenios (semillas) sobre el receptculo, el verdadero fruto (Figura
1) (Branzanti, 1985; INFOAGRO 2012).
17
2.1.2.
2.1.3.
18
19
2.2.
20
2.3.
Botrytis cinerea
22
2.3.1.
2.3.2.
cinerea
24
2.3.3.
25
2.3.3.2. Penetracin
La infeccin puede iniciar a partir de tejidos daados o que han sido infectados
previamente por algn otro patgeno, mediante la penetracin directa e incluso por
aberturas naturales como los estomas. Es as que el apresorio o el tubo germinativo
inicia la penetracin. Sin embargo, B. cinerea es capaz de producir sustancias que
tienen la capacidad de degradar el material vegetal y facilitar la penetracin. Estas
son enzimas como la cutinasa la que destruye la cutina, la primera barrera de
proteccin de la planta. La pectinasa es otra enzima que degrada la pectina de la
pared celular y las lipasas, enzimas que hidrolizan steres de cidos insaturados de
cadena larga que forman parte de la cutcula y la cera presente en este tejido
(Benito, 2000; Espinosa, 2006).
Cuando el hongo penetra el tejido vegetal, da origen a una lesin primaria que facilita
la invasin del tejido por la difusin de compuestos con actividad fitotxica como
toxinas, metabolitos secundarios e.g. botridial, dihidrobotridial y bocinolina de B.
cinerea, relacionados con las manchas necrticas. El cido oxlico al estar presente
dentro de la planta forma cristales de oxalato clcico el cual acta como quelante de
iones de calcio y cobre. La eliminacin del calcio de la pectina provoca que esta
absorba agua y se hinche causando una deformacin. Otra forma de ocasionar la
muerte celular del tejido est mediada por la produccin de especies reactivas de
oxgeno (Benito, 2000; Espinosa, 2006).
26
Durante esta fase, las condiciones son desfavorables para el hongo, ya que se
presentan los mecanismos de defensa de la planta, por lo que el hongo permanece
en un estado de latencia. Este periodo se describe en un gran nmero de frutos
aunque se presenta con mayor frecuencia en fresa, frambuesa y vid (Benito, 2000;
Espinosa, 2006).
27
2.4.
Alternativas de control
28
2.4.1.
Control qumico
29
La base de desarrollo de cada una de las plantas depende enteramente del medio
ambiente y su ecosistema, que, cuando se encuentra en desequilibrio, trae como
resultado consecuencias con un alto costo al medio ambiente y la salud humana. Es
as que el uso indiscriminado de agroqumicos afecta todo el ecosistema, suelo, aire,
agua, organismos benficos as como patgenos, incluso al ser humano.
aplicacin con respecto a la infeccin que causan los hongos y la movilidad del
producto sobre los tejidos, es as que se clasifican en tres grupos: 1) de proteccin,
2) de erradicacin y 3) sistmicos. De acuerdo a su naturaleza qumica: 1)
inorgnicos, 2) organometlicos y 3) orgnicos (Barcenas, 2005).
Los fungicidas inorgnicos se basan en el empleo de dos compuestos
qumicos de accin fungicida. El azufre que acta bloqueando las enzimas que
intervienen en el mecanismo respiratorio del hongo y el cobre incluyendo sus
derivados como el sulfato, el oxicloruro, el carbonato, xido cuproso, que actan
como iones cpricos, inhibiendo una gran variedad de grupos tiol (-SH) en las
enzimas. Tambin provocan la coagulacin del protoplasma celular y al inhibir el
desarrollo de las esporas del hongo. Los fungicidas organometlicos utilizan
elementos metlicos como: Ag, Hg, Cu, Cd, Cr, Ni, Pb, Co, Zn, Fe y Ca tomando en
cuenta que la toxicidad del mismo aumenta con la masa atmica. Los fungicidas
orgnicos pertenecen a los fungicidas actuales ms importantes. Estos fungicidas
pertenecen a diferentes grupos qumicos como: ditiocarbamatos, derivados fenlicos,
derivados
32
2.4.2.
Control biolgico
control
biolgico
hace
uso
de
parasitoides,
depredadores,
33
34
2.5.
Las plantas son organismos vivos ssiles, razn por la cual han desarrollado por
evolucin mecanismos de defensa que les permiten responder ante cualquier tipo de
estrs presente en el entorno. En general se distinguen dos tipos de estrs: el
abitico, provocado por factores ambientales, fsicos y qumicos; y el estrs bitico,
causado por la accin de otros seres vivos como patgenos, otros vegetales y
animales. Tomando en cuenta cada tipo de estrs, estos no desencadenan el mismo
mecanismo de respuesta, sin embargo, pueden presentar una respuesta comn
como la sntesis de compuestos fenlicos, debido a la estimulacin de la enzima
fenilalanina amonio liasa, que responde a elicitores biticos y a la luz UV (Herrero,
2000).
Los compuestos que le permiten a la planta defenderse y adaptarse al medio
en el cual se desarrollan, son obtenidos como productos del metabolismo primario de
la planta en el cual se generan las macromolculas esenciales para la vida. Estos
Productos conocidos como metabolitos secundarios juegan un rol importante en las
interacciones de las plantas con otros organismos y su supervivencia pues no son
considerados esenciales para el crecimiento de la planta (Croteau y col., 2000).
2.5.1.1. Fenilpropanoides
36
2.5.1.2. Terpenoides
2.5.1.3. Alcaloides
37
2.6.
secundarios
presenta una respuesta compatible, donde el patgeno infecta la planta sin activar
los mecanismo de defensa (Garca y Lozoya, 2004).
La primera barrera con la que se encuentra el patgeno son las barreras fsicas o
estructurales de la planta; la presencia de pelos, ceras, cutcula, pared celular, el
comportamiento
de
los
estomas,
lenticelas,
tejido
interno,
lignificacin
2.6.1.
Actividad
antimicrobiana
de
los
metabolitos
secundarios
uva presenta actividad antifngica (Murphy, 1999; Van Baarlen y col., 2004;
Giovinazzo y col., 2012).
Una gran variedad de compuestos terpenoides tambin presentan actividad hacia
patgenos como: aceites esenciales de albahaca (Ocimum basilicum) y la capsaicina
del chile (Capsicum annuum) presentan actividad sobre bacterias. Algunos aceites
esenciales del laurel (Laurus nobilis) presentan actividad sobre bacterias y hongos.
La terabithina del pimentero brasileo (Schinus terebinthifolius), el eugenol del clavo
(Syzygium aromaticum), el mentol de la menta (Mentha piperita), el carvacrol de la
ajedrea (Satureja montana), cido cafico del estragn (Artemisia dracunculus)
presentan actividad de amplio espectro. Timol, carvacrol, -pineno, limoneno, 1-8
cineol, linalol del tomillo (Thymus vulgaris), avenacina de avena (Avena sativa),
presentan actividad antifngica de amplio espectro (Murphy, 1999; Montes, 2009).
La presencia de algunos compuestos nitrogenado y alcaloides con actividad
antimicrobiana que se han reportado son: la berberina de brbero (Berberis vulgaris)
y la cocana de la planta de coca (Erythroxylum coca) los cuales presentan actividad
antibacteriana. La piperina del pimiento negro (Piper nigrum) presenta actividad hacia
hongos y bacterias. La cochicina del glorioso lirio (Gloriosa superba), la berberina del
sello de oro (Hydrastis canadensis), la raz serpentina (Rauvolfia serpentina) y la uva
de Oregn (Mahonia aquifolia), la reserpina de vincapervinca (Vinca minor), la
mescalina del peyote (Lophophora williamsii), el opio de la amapola (Papaver
somniferum), presentan actividad de amplio espectro. La alicina del ajo (Allium
sativum L.) presentan actividad antifngica de amplio espectro (Murphy, 1999;
Montes, 2009).
Las plantas estn compuestas de un gran nmero de metabolitos secundarios,
algunos autores mencionan que pueden llegar a existir ms de 100000 metabolitos
secundarios involucrados en la defensa de todas las especies de plantas y de los
cuales solo se conoce el 10% (Mazid, 2011).
40
2.7.
biolgico
partir
de
extractos
de
planta
que
presenten
actividad
42
3. OBJETIVO
3.1.
Objetivos especficos.
43
4. MATERIALES Y MTODOS
4.1.
Material vegetal
4.2.
44
4.3.
4.4.
Se aplicaron tres dosis diferentes de cada uno de los extractos: 125, 250 y 500 L,
mezclando con 45 mL de medio de cultivo PDA y se repartieron en tres cajas Petri.
En el centro de cada caja se coloc un trozo de 0.6 cm de dimetro de medio PDA
que contena el hongo Botrytis cinerea y se dej incubar a temperatura ambiente por
aproximadamente 10 das, hasta que el patgeno cubriera en su totalidad la
superficie de la caja. El mismo procedimiento se realiz para el tratamiento control en
el cual se aplic etanol en ausencia del extracto.
4.4.1.
un horno a una temperatura de 100 C, hasta obtener peso constante de cada una
de las muestras. El porciento de inhibicin se obtuvo a partir de la frmula descrita
por Bernal y col., (2005):
% total de Inhibicin = [(Ca-Ta)/Ca]*100
Donde:
Ca= Peso seco en el testigo despus del periodo de incubacin; Ta= Peso seco en el
tratamiento despus del periodo de incubacin.
4.5.
Visualizacin de esporas
4.6.
in vivo
Se evaluaron los extractos etanlicos de hojas de fresa elaborados con y sin alta
temperatura. Se estableci un experimento con 10 frutos de fresa por unidad
experimental y tres repeticiones por tratamiento, las cuales se colocaron en un
recipiente cubierto de papel absorbente previamente estriles, a los frutos se les
realiz una herida previa de 1 cm2 en el centro del fruto con un bistur previamente
estril y se asperjaron 10 mL de cada uno de los extractos, los cuales se dejaron
actuar durante 10 min en los frutos. Despus se asperj una suspensin de esporas
a una concentracin de 2.0X105 esporas mL-1. Un grupo de frutos nicamente
46
inoculados con el patgeno fue usado como control. Todos los frutos fueron
incubaron a 25C. A las 24 h se inici la evaluacin del ndice de severidad usando
una escala de severidad 5 niveles: 1.- Fruto sano, 2.- Fruto con 25 % de infeccin, 3.Fruto con 50 % de infeccin, 4.- Fruto con 75% de infeccin y 5.-Fruto 100%
infectado. La evaluacin se realiz diariamente durante 7 das. El ndice de severidad
se realiz utilizando la frmula descrita por Prez y col., (1995):
ndice de Severidad = [Xi(1) + Xi(2) + Xi(3) + Xi(4) + Xi(5) ]/ N
Donde:
Xi= nmero de frutos; (1, 2, 3, 4, 5)= niveles de severidad; N= nmero total de frutos.
4.7.
fresa
4.7.1. Cromatografa en capa fina (TLC) de los extractos
47
4.7.2.
vegetales de fresa
La deteccin de las fracciones de cada una de los extractos se hizo con el reactivo
de Productos Naturales para deteccin de flavonoides (Wagner y Bald, 2001). Para
su preparacin se utiliz 10mL de difenilboriloxyetilamina al 1% en metanol y 8mL de
polietilenglicol 600 al 5% en etanol. Para observar los compuestos se utiliz una
lmpara de luz UV a 365nm. La presencia de flavonoides muestra una fluorescencia
que puede ir de amarillo-verde al azul dependiendo del tipo de estructura de los
flavonoides.
4.7.3.
Purificacin de fracciones
48
4.8.
49
5. RESULTADOS
5.1.
50
Figura 4. Porcentaje de produccin de biomasa en base al peso seco de B. cinerea in vitro a partir de su
desarrollo con la aplicacin de los extractos etanlicos de planta de fresa EFEC y EFES en diferentes volmenes.
ANOVA (p=0.05), (n=3) y comparacin de medias de Tukey (letras iguales no presentan diferencias significativas)
51
Concentracin (L)
Esporulacin
EFEC
125
(+)
EFEC
250
(+)
EFEC
500
(-)
EFES
125
(-)
EFES
250
(-)
EFES
500
(+)
Esporulacin negativa = (-)
Esporulacin positiva = (+)
52
5.2.
in vivo
PorcentajedeinhibicinmicelialdeB.
cinerea
80
70
a
b
60
50
40
30
20
10
10
EFES
EFEC
CONTROL
Tratamientos
Figura 5. Efecto de extractos vegetales de fresa: EFES y EFEC sobre la inhibicin de B. cinerea
en frutos de fresa. A una (p=0.05), (n=3) y comparacin de medias de Tukey (letras iguales no
presentan diferencias significativas).
53
5.3.
Color de fluorescencia
de cada banda
EFES
EFEC
RF
RF
1.00
1.00
Amarillo
0.96
0.95
Azul
0.93
0.93
Amarillo
0.85
0.89
Verde
0.63
0.74
Amarillo
0.20
0.34
Azul
0.15
0.24
54
5.4.
45
Porcentajedeinhibicin
40
EF
DEF
35
30
CDE
25
BC
20
15
CD
BC
CD
BC
ABC
ABC
ABC
ABC
10
5
AB
A
Tratamientos
Figura 6. Efecto de las fracciones de los extracto etanlicos de planta de fresa EFEC y EFES
sobre el crecimiento radial de B. cinerea. A una (p=0.05), (n=3) y comparacin de medias de
Tukey (letras iguales no presentan diferencias significativas).
55
6. DISCUSIN DE RESULTADOS
56
Aspergillus flavus (Montes y col. 2000), tal y como fue observado en los EFEC de
este trabajo en particular.
La importancia de la actividad de los extractos radica en su capacidad para
inhibir el crecimiento del patgeno (Wilson y col., 1997; Domingo y Lpez, 2003;
Kliebenstein y col., 2005; Harish y col., 2007; Chrif y col., 2007; Hernndez y col.,
2007b; Mazid y col., 2011; Jaso de Rodrguez y col., 2011), sin embargo no todos
presentan dicha capacidad para un amplio espectro de patgenos, tal como en la
evaluacin de Stauffer y col. (2000) quienes evaluaron 98 extractos vegetales
diferentes, de los cuales solo el 10% present actividad antimicrobiana contra
hongos (Colletotrichum sp., Penicillium italicum, Aspergillus flavus, Fusarium sp.,
Rhizoctonia solani, Alternaria sp., y Pythium sp.) y bacterias (Xanthomonas
campestri), haciendo nfasis solo en aquellos extractos que presentaron la inhibicin;
de la misma manera, Arciniegas y col. (2002) realizaron una evaluacin de 20
extractos etanlicos crudos de diferentes partes de la planta pertenecientes a trece
familias, de las cuales solo ocho especies mostraron actividad antifngica hacia
Mycosphaerella fijiensis in vitro. En este mismo sentido Montes y col. (2000)
realizaron una revisin de 12 aos de investigacin sobre las propiedades
antifngicas de las plantas de 206 especies contra 26 especies de hongos
fitopatgenos, de los cuales solo entre el 32 y 51% de las plantas present un efecto
contra los hongos y la respuesta de los patgenos varo desde la estimulacin
biolgica hasta su total inhibicin. Por otro lado Mendoza y col. (2007), evaluaron 97
extractos vegetales obtenidos de 37 especies vegetales los cuales ningn extracto
present inhibicin de los patgenos Phytophthota palmivora y Colletotrichum
gloeosporioides, hecho que atribuyeron a que las propiedades que poseen los
metabolitos secundarios de las plantas, puede variar de acuerdo a su entorno, por lo
que destacaron la necesidad de evaluar la mayor cantidad de extractos posibles para
una amplia gama de organismos. En cambio Bautista y col. (2002a) evaluaron 20
especies de plantas contra hongos patgenos de los cuales los extractos de Achras
sapota, Pouteria sapota y Psidium guajava disminuyeron la produccin de biomasa
micelial en base al peso seco de Alternaria spp., mientras que los extractos de
Phitecellobium dulce, Persea americana y Annona cherimola estimularon su
57
en base al peso seco de B. cinerea, esto puede deberse al sinergismo que presentan
los compuestos fenlicos de tipo flavonoides reportado por (Cushnie y Lamb, 2005;
Ortega y col., 2011; Cushnie y Lamb, 2011). Por lo tanto en el caso de los extractos
EFEC y EFES completos y fraccionados cada uno tiene sus ventajas y desventajas
principalmente los extractos completos, reducen la produccin de biomasa en EFES
sin embargo EFES y EFEC inhiben la germinacin de esporas, y las fracciones
promueven la produccin de biomasa sin embargo reducen el crecimiento del
micelio.
Los resultados obtenidos en este trabajo son alentadores pues permiten
vislumbrar la posible utilidad de las plantas de fresa que son desechadas para
elaborar extractos con potencial biocontrolador, en este caso de B. cinerea.
62
7. CONCLUSIONES
63
8. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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