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ESCUELA DE CIENCIAS BSICAS, TECNOLOGA E INGENIERA


CONTENIDO DIDACTICO DEL CURSO: 401539 Espectroscopa

2.

UNIDAD 2. MTODOS BASADOS EN LA EMISIN DE ENERGA

Introduccin
Como se explic en la unidad anterior, cuando una sustancia qumica absorbe un
tipo de radiacin, sus electrones pasan de un estado basal a un estado electrnico
excitado. Al suceder el fenmeno de absorcin muchas sustancias disipan el
exceso de energa en forma de calor, sin embargo, solo un grupo de especies
pierde una cantidad del exceso de energa en forma de calor, y emite la energa
restante en forma de radiacin electromagntica de distinta longitud de onda que
la absorbida, a una longitud de onda mayor, puede utilizarse con fines analticos.
De acuerdo con este fenmeno de emisin remanente de energa con que
cuentan las especies qumicas luego de ser irradiadas, es que se puede emplear
la espectroscopia de emisin atmica (E.E.A.) y la espectroscopa de
Fluorescencia tanto para la identificacin de sustancias atmicas como para la
cuantificacin de las mismas. Al igual que la tcnica instrumental de absorcin
atmica, la E.E.A. genera espectros de emisin conformados por picos muy
estrechos, los cuales explican las transiciones energticas de los electrones que
conforman los tomos de un elemento en particular. Tambin, estos espectros
representan una huella digital inequvoca de los elementos metlicos, al igual que
cualquier otra propiedad fsica, como por ejemplo, el punto de fusin, el ndice de
refraccin, etc.
En el ltimo captulo se abordaran algunas tcnicas espectroscpicas modernas
de caracterizacin y anlisis de superficies actualmente utilizadas como son
espectroscopia fotoelectrnica de rayos X (XPS), microscopia electrnica de
barrido (SEM) y Microscopia Electrnica de Transmisin (TEM).
En la presenta unidad se abordar la informacin necesaria para entender el
fenmeno de emisin de energa a escala atmica y todo lo relacionado con la
tcnica de anlisis instrumental de superficies.

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CAPITULO 4: ESPECTROSCOPA DE EMISIN ATMICA


Leccin 16: La radiacin electromagntica
Es de vital importancia enfatizar en algunos aspectos sobre la radiacin
electromagntica, por su repercusin en la espectroscopia en general, haciendo
nfasis en la de emisin atmica. La radiacin electromagntica es un tipo de
energa que se transmite a enormes velocidades por el espacio y que adopta
muchas formas; entre las ms conocidas se encuentran la luz y el calor radiante.
Muchas de las propiedades de la radiacin electromagntica se describen con
certeza segn el modelo clsico de los fenmenos ondulatorios. Este modelo
considera la radiacin electromagntica como una serie de ondas constituidas por
un campo elctrico perpendicular entre s y a la direccin de propagacin de dicha
onda.

Figura 54. Ondas electromagnticas


Ciertos fenmenos suceden cuando interacciona la radiacin electromagntica
con la materia, como la absorcin y emisin de dicha radiacin. Para explicar
estos fenmenos es necesario considerar que la radiacin electromagntica es
una corriente de paquetes discretos de energa. Estos paquetes de energa se
comportan como partculas individuales, llamadas fotones. Cada fotn se

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caracteriza por una frecuencia. Estas dos formas de ver la radiacin


electromagntica como partcula y como onda no se excluyen sino que se
complementan.
La espectroscopia es la medicin e interpretacin de la radiacin electromagntica
absorbida, dispersada o emitida por tomos, molculas u otras especies qumicas.
Estos fenmenos estn asociados con cambios en los estados de energa de las
diferentes especies; por consiguiente, dado que cada especie posee estados
energticos caractersticos, la espectroscopia puede utilizarse para identificarlas.
El mtodo espectroscpico se ha usado durante largos aos para el
reconocimiento sensible de muchos elementos. El anlisis del espectro con fines
cuantitativos fue introducido por Lockyer y Roberts en 1873, pero estos tuvieron
poca repercusin. Posteriormente la introduccin del principio de estandarizacin
interna propuesta por Gerlach en 1925 determina un nuevo perodo en la
elaboracin de procedimientos analticos cuantitativos.

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Leccin 17: Principios bsicos de la espectroscopia de emisin atmica


(E.E.A).
Los mtodos espectroscpicos atmicos se basan en la interaccin entre la
radiacin electromagntica y la materia. La espectroscopia de emisin atmica
(E.E.A.), es un mtodo instrumental de anlisis qumico, que se fundamenta en el
estudio de la radiacin emitida por tomos en todas las regiones del espectro.
Cuando estos absorben energa, se excitan y en dicho estado permanecen un
tiempo muy corto (del orden de 10-6 s.), luego el tomo o molcula vuelve a su
estado fundamental o no excitado emitiendo el sobrante de energa en forma de
luz o cuantos luminosos.

B
Figura 55. A. Explicacin de las transiciones electrnicas; B. Espectro de emisin
del hierro.
Esto ocurre cuando una muestra es sometida a una descarga elctrica
suministrada por una fuente de excitacin. El proceso descrito puede expresarse

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de acuerdo a la condicin de frecuencia de Bohr. Si E 1 y E2 son los estados inicial


y final respectivamente, la energa emitida se expresar como:

Ecuacin 2.1
Donde:

= Frecuencia de la radiacin emitida

Los iones o molculas gaseosas, cuando se excitan trmica o elctricamente


emiten una radiacin caracterstica en la zona del ultravioleta visible que puede
ser medida y utilizada para el anlisis cualitativo y cuantitativo, ya que la
intensidad de las lneas es proporcional cantidad de tomos excitados, en
dependencia de las condiciones de excitacin y a la concentracin de la muestra.
Mientras que la mayora de las tcnicas espectroscpicas sirven para el anlisis
de molculas y de tomos, la espectroscopia de emisin slo sirve para anlisis
de tomos. Esto se debe a la gran energa que se necesita para excitar la mayora
de las especies qumicas, de forma que esta energa disocia los compuestos en
tomos o iones. La espectroscopia no al ser excitada la muestra, se rompe la
estructura e ioniza el tomo. Como consecuencia de lo sealado anteriormente se
puede concluir que, esta tcnica no es til para la determinacin del estado
qumico de combinacin.
En Espectroscopia de Emisin Atmica la cantidad fsica que es usada para
caracterizar y medir la concentracin que ser determinada, se refiere como
intensidad.
El anlisis cuantitativo determina la concentracin o cantidad de una sustancia a
partir de una medicin, que puede ser la lectura de un voltmetro, que se refiere a
la energa radiante, en mediciones fotogrficas. En la prctica no es necesario
decir que tipo de energa radiante se est midiendo. Entonces la expresin
intensidad puede ser empleada para expresar la fuerza relativa de una lnea
espectral. Luego la intensidad de una lnea espectral o del fondo es una expresin
relativa al referirse a la cantidad medida por el receptor de dicha seal. La
dimensin es pues la unidad, sin embargo, no es necesario referirse a unidades
pues queda explcito en el trmino intensidad por su valor relativo respecto a otra
lnea de referencia interna en el espectro usado.
La base del anlisis cuantitativo por emisin atmica lo constituye la simple
relacin emprica entre el contenido de un elemento en la muestra y la intensidad
de la lnea espectral de dicho elemento, caracterstico para una longitud de onda

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determinada, en la zona del espectro analizada. Esta relacin se conoce


usualmente como la ecuacin de Lomakim-Scheibe:
Ecuacin 2.2
Donde,

I = Intensidad lineal espectral.


c = Contenido del elemento.
a = Coeficiente de proporcionalidad

donde se asume en principio que la intensidad es proporcional a la concentracin.


Las desviaciones de esta proporcionalidad estn causadas fundamentalmente por
la autoabsorcin, tomada en cuenta a travs del exponente b. Cuando el registro
es fotogrfico, la ecuacin se representa grficamente en coordenadas
logartmicas
Ecuacin 2.3
En la espectroscopia de emisin, son los electrones de valencia de los elementos
los que se excitan, para dar lugar a espectros atmicos formados por picos bien
definidos y estrechos, emplendose como lneas analticas las lneas ltimas o de
referencia

4.17.1

Ventajas

Este mtodo tiene una serie de ventajas que se describen a continuacin:

Excelente mtodo para el anlisis de trazas (contenidos <1 mgl-1)


Empleado la determinacin de metales, metaloides y otros elementos
Se requiere una pequea cantidad de muestra (un nanogramo)
Determinacin simultneamente de varios elementos, sin necesidad de
separaciones previas.
Es un mtodo rpido y fcilmente automatizado.
La exactitud y la precisin suele ser del 2 %

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4.17.2

Desventajas

Este mtodo tambin posee una serie de desventajas como lo son:

4.17.3

Equipamientos relativamente caros.


Destruccin total de la muestra, cuando es en polvo.
Se realiza solo la determinacin en forma de elementos.

Fuentes de energa.

Las fuentes de energa para la emisin pueden ser provocadas por energa
trmica o elctrica. Esta fuente ejerce una gran influencia en el tipo de
intensidades de los picos que constituyen el espectro de cada uno de los
elementos. De acuerdo a lo anterior se puede decir que la fuente de energa tiene
dos funciones:

Debe proporcionar suficiente energa como para convertir los compuestos


en tomos e iones gaseosos. En este proceso es importante que la
distribucin de los elementos en el vapor se relacione reproduciblemente
con la concentracin y la distribucin en la muestra.
Debe proporcionar suficiente energa como para excitar los electrones de
los tomos gaseosos de forma tambin reproducible.

Al excitar a una sustancia se obtiene un espectro de emisin tpico, parecido al de


una llama de O2 y H2, donde se observan tres tipos de radiacin o espectros:

De lneas estrechas y bien definidas.


De bandas.
Continuo.

Los espectros de lneas se deben a emisiones atmicas o inicas. En relacin a


ello se expone que slo existen niveles electrnicos en los tomos y, por lo tanto,
las emisiones procedentes de ellos sern picos ms o menos estrechos y bien
definidos.
Por su parte Skoog, indica que los espectros de bandas se deben a emisiones de
radicales o molculas sencillas. Pero en realidad, son espectros de lneas que se
superponen y que el instrumento no es capaz de resolver. Estos espectros de
bandas se eliminan utilizando fuentes de energa a mayor temperatura, que
rompern los radicales.

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4.17.3.1

Energa de excitacin

Resulta evidente que para que un elemento en estado de oxidacin cero emita
una nica lnea espectral, es necesario que previamente haya absorbido una
energa equivalente a su potencial de excitacin, que es la energa necesaria para
subir un electrn del estado fundamental al primer estado excitado; pero para que
un elemento muestre una emisin completa, debe absorber una energa
equivalente a su potencial de ionizacin. Como cada fuente de energa tiene una
cantidad de energa fija, los potenciales de ionizacin pueden servir como va para
conocer las sensibilidades relativas de los distintos elementos en espectroscopia
de emisin. As, aquellos elementos que tienen bajos potenciales de ionizacin,
como son los alcalinos, se podrn determinar con gran sensibilidad, mientras que
los elementos no metlicos con alto potencial de ionizacin, se determinarn con
poca sensibilidad.
Por lo expresado anteriormente se puede concluir que la complejidad de los
espectros de emisin depender de la configuracin electrnica del elemento, por
lo que los metales alcalinos presentan espectros muy simples, mientras que los de
transicin los presentan muy complejos.

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Leccin 18: Instrumentacin de la E.E.A.


Los componentes bsicos de un espectrmetro de emisin son: una fuente de
excitacin, que proporcione energa a la muestra, un monocromador, que
seleccione las diferentes radiaciones emitidas y un sistema de deteccin.

4.18.1

Fuentes de excitacin

La energa suministrada para la excitacin de la muestra en anlisis


espectroqumico procede de una descarga elctrica entre dos electrodos. Uno de
ellos normalmente contiene la muestra, pulverizada, en forma slida, o el residuo
procedente de una disolucin.
Si la muestra es un metal o una aleacin, uno de los electrodos, normalmente el
inferior, constituye la propia muestra. Cuando la muestra no es conductora, suele
colocarse en una pequea cavidad practicada en un electrodo de grafito. Tambin
se utilizan como soporte varillas de cobre y plata cuando estos elementos no
deben analizarse. El otro electrodo (contra-electrodo) suele ser grafito en todos los
casos.
Cuando se trata de muestras lquidas o disoluciones, lo normal es evaporar una
determinada cantidad depositada sobre el propio electrodo.
Para la excitacin de la muestra se utilizan los siguientes dispositivos: la llama, el
arco elctrico de corriente alterna, el arco elctrico de corriente directa, y la chispa
elctrica. Cada uno tiene ventajas y aplicaciones especiales. Sin embargo, la
funcin de cada unidad de excitacin es que la muestra se vaporice y excitar los
electrones en los tomos vaporizados a niveles de energa superiores.

4.18.1.1

La llama

Proporciona una menor temperatura por lo que solo se excitarn unas cuantas
lneas, principalmente los elementos con baja energa de ionizacin, como los
metales alcalinos y alcalinos trreos, pero esto puede constituir una ventaja, ya
que las interferencias que pueden producir otros elementos quedan eliminadas al
estos no emitir energa.

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4.18.1.2

El arco elctrico con corriente directa

Producido por un voltaje entre 50 - 300 Voltios, es un mtodo comn para


introducir la muestra en la descarga. La vaporizacin tiene lugar por el
calentamiento causado por el paso de la corriente. Las temperaturas del arco
estn en un rango de 4000 - 8000 K. Las lneas de emisin producidas son,
principalmente, aquellas debidas a tomos neutros. Esta fuente es muy sensible,
con una buena relacin lnea-fondo. Generalmente se usa para la determinacin e
identificacin de sustancias presentes en una muy baja concentracin, ya que
puede detectar elementos con bajo lmite de deteccin.

4.18.1.3

El arco elctrico con corriente alterna de alto voltaje.

En este caso se utiliza una corriente alterna entre 2000 y 5000 V. con intensidades
comprendidas entre 1 y 5 amperios. El arco se establece entre los electrodos,
separados alrededor de 1 mm, sin necesidad de contacto previo.
Si la frecuencia de la corriente es 50 Hz, el arco se extingue e invierte su direccin
100 veces por segundo, lo cual mejora considerablemente la reproducibilidad
respecto al arco de corriente continua, pues el arco se establece ("pica") en una
zona nueva en cada ciclo. Sin embargo, la naturaleza intermitente de la descarga
hace que la temperatura alcanzada sea inferior a la que se consigue con el arco
de corriente continua, con la correspondiente disminucin de la sensibilidad. De
cualquier forma, este dispositivo no se utiliza demasiado en el trabajo analtico
ordinario.

4.18.1.4

La chispa elctrica con corriente alterna

Da energas da excitacin mucho ms altas que el arco, con menor efecto de


calentamiento. Se ha comprobado que una chispa intermitente que siempre se
propaga en la misma direccin, proporciona mayor precisin que los mtodos
considerados anteriormente. En la Figura 57 se muestran los componentes
esenciales de un circuito para una fuente de chispa.

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Figura 56. Circuito para una fuente de chispa.

La lnea de voltaje se ajusta a 1040 kV con un transformador. El circuito


secundario contiene un condensador, C, y un motor, M, cuya rotacin es
sincrnica con las alternancias de la lnea de corriente. Durante medio ciclo el
condensador almacena la carga y cuando est cargado al mximo, el rotor
sincrnico permite que el circuito se cierre y salte la chispa, producindose una
descarga amortiguada.
La intensidad mxima puede ser hasta de 2000 A, pero la corriente media es solo
de unos pocos amperios o menos.
La excitacin de la muestra con este tipo de fuente se produce por bombardeo de
electrones, en lugar de ser trmica, como en otras fuentes de excitacin. Los
electrodos se mantienen relativamente fros y la cantidad de muestra vaporizada
es muy pequea.
No se trata de una fuente muy sensible, y por ello, no demasiado conveniente para
anlisis cualitativo. Sin embargo, es una fuente muy estable y reproducible,
resultando muy adecuada para anlisis cuantitativo. Operando con esta fuente se
pueden llevar a cabo anlisis de forma rpida y precisa. Por ejemplo, en anlisis
de control de calidad de aceros se puede efectuar un anlisis en menos de 10
segundos.

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4.18.1.5

La microsonda lser

es una fuente de excitacin, que se encuentra comercializada, y que parece muy


prometedora. En esta fuente (Figura 58) se utiliza el lser para vaporizar la
muestra en el espacio entre dos electrodos de grafito, que se utilizan como fuente
de excitacin de chispa.

Figura 57. Microsonda lser


El dispositivo permite analizar materiales no conductores y, posiblemente la mayor
ventaja sea el poder enfocar sobre determinadas zonas de tamao muy pequeo,
entre 10 y 50 m de dimetro.

4.18.2

Monocromadores.

Como elementos dispersantes en espectrometra de emisin se emplean prismas


y redes, cuyas caractersticas se consideraron en el captulo 3. Actualmente
parece que las redes tienden a desplazar a los prismas, por una serie de razones,
entre las que se incluye el precio y, sobre todo, el hecho de que las redes
proporcionan dispersiones lineales, con lo que el problema de la identificacin de
las lneas espectrales sobre una placa fotogrfica se simplifica considerablemente.
La desventaja que supone la presencia de distintos rdenes de difraccin se
elimina fcilmente utilizando filtros adecuados.

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4.18.3

Detectores.

Los espectrgrafos utilizan una pelcula fotogrfica para registrar la radiacin


emitida por la muestra problema, mientras que en los espectrmetros, la deteccin
se lleva a cabo por mtodos fotoelctricos.
Deteccin fotogrfica. Casi todos los antiguos instrumentos de emisin utilizan
emulsiones fotogrficas para detectar la energa radiante. Estos mtodos se
pueden usar con fines cualitativos y cuantitativos. Su empleo en anlisis cualitativo
se considerar ms adelante (ver: aplicaciones), mientras que aqu se
mencionarn algunas de sus caractersticas para su empleo en medidas
cuantitativas.
Cuando una pelcula fotogrfica se expone a radiacin electromagntica, y
posteriormente se revela, la imagen obtenida se mide normalmente como la
densidad de ennegrecimiento (peso de plata metlica producida por unidad de
rea).
Una vez revelada la placa, la densidad de ennegrecimiento, D, (similar a la
absorbancia) se mide con un micro-fotmetro llamado densitmetro. Para ello, se
mide primero en una parte de la pelcula no impresionada, Io, y despus sobre la
lnea de inters, obteniendo la intensidad de radiacin transmitida, I. La densidad
es:
Ecuacin 2.4
La densidad de ennegrecimiento est relacionada con la exposicin, E, que se
define por
Ecuacin 2.5
donde I es la intensidad de la radiacin a una longitud de onda
de exposicin.

y t es el tiempo

Para convertir densidad de ennegrecimiento, D, de una lnea, en exposicin, es


necesario obtener experimentalmente la denominada curva de trabajo o curva H y
D, que consiste en una representacin grfica de D en funcin de log t (Figura 59)

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Figura 58. Curva caracterstica H y D para una emulsin fotogrfica a dos


longitudes de onda.

La medida de la pendiente de la zona lineal de la curva se conoce como gamma


de la emulsin y es una medida del contraste, el cual depende, a su vez, de la
longitud de onda.
Con ayuda de la curva caracterstica puede relacionarse la densidad de
ennegrecimiento con el tiempo de exposicin, y si ste se mantiene constante
(que es como normalmente se opera con fines analticos) con la intensidad
relativa. Estas intensidades relativas son el parmetro dependiente de la
concentracin. Por supuesto, que en espectroscopia analtica, las intensidades
relativas deben relacionarse con las concentraciones a travs de la curva de
calibrado.
Deteccin fotoelctrica. En los espectrmetros se utiliza como sistema de
deteccin una serie de tubos fotomultiplicadores, en lugar de una placa fotogrfica.
Esto requiere la colocacin precisa de toda una serie de rendijas de salida a lo
largo de la curva focal del espectrmetro, para seleccionar lneas espectrales
individuales, o grupos de lneas, con objeto de detectar muchos elementos
simultneamente.
Normalmente, los espectrmetros tienen espacio para unas 90 rendijas, si bien,
solo entre 20 y 35 detectores y lectores, llamados canales, se utilizan para un
determinado anlisis. Estos instrumentos se denominan de "lectura directa".

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Asociado a cada tubo fotomultiplicador se dispone un sistema electrnico que


integra la seal del detector durante un periodo de tiempo, almacenada en un
condensador, leyndose al final de la exposicin.
La medida de la pendiente de la zona lineal de la curva se conoce como gamma
de la emulsin y es una medida del contraste, el cual depende, a su vez, de la
longitud de onda.
Con ayuda de la curva caracterstica puede relacionarse la densidad de
ennegrecimiento con el tiempo de exposicin, y si ste se mantiene constante
(que es como normalmente se opera con fines analticos) con la intensidad
relativa. Estas intensidades relativas son el parmetro dependiente de la
concentracin. Por supuesto, que en espectroscopia analtica, las intensidades
relativas deben relacionarse con las concentraciones a travs de la curva de
calibrado.

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Leccin 19: Espectrometra de emisin atmica con fuente de plasma


Las fuentes de excitacin consideradas como tradicionales, y que se han
considerado anteriormente, presentan una serie de inconvenientes, entre los que
destacan:
Llamas. La temperatura que se alcanza en las llamas es relativamente baja,
por lo que resulta difcil, si no imposible, analizar elementos refractarios o
elementos con grandes energas de excitacin. Adems, los productos de
combustin y los gases de la llama dan lugar a interferencias qumicas y
espectrales.
Arco y chispa. Los arcos y las chispas son capaces de proporcionar altas
temperaturas de excitacin, pero la naturaleza de la descarga elctrica es
afectada fuertemente por el tipo de muestra. As, pequeas variaciones en la
composicin pueden originar cambios importantes en las condiciones de
excitacin.
Para tratar de evitar estos inconvenientes, se ha venido desarrollando una tcnica
para el anlisis multi-elemental por espectroscopia de emisin atmica basada en
el empleo de plasmas.
Las fuentes de plasma ofrecen varias ventajas comparadas con los mtodos de
llama y electrotrmicos. Una de las ventajas constituye la de ser una tcnica para
elementos mltiples y tiene un amplio rango de trabajo. Las fuentes de plasma
actuales brindan un mtodo mucho ms fcil para la manipulacin de muestras
gaseosas y lquidas. El espectro para docenas de elementos puede ser registrado
al mismo tiempo, algo muy importante cuando la muestra es pequea.

Figura 59. Espectrmetro de emisin con plasma de acoplamiento inductivo

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Las altas temperaturas alcanzadas aumentan el nmero de elementos que se


pueden determinar, tanto cualitativa como cuantitativamente, ya que la
temperatura se puede estabilizar. Presenta una gran versatilidad, exactitud y
reproducibilidad, permitiendo trabajar con pequeos volmenes de muestra,
rebajando considerablemente los lmites de deteccin. Se emplea en el anlisis de
metales, lquidos biolgicos, usndose junto a la cromatografa de gases en la
determinacin del plomo en sangre, arsnico, antimonio, plomo en aire y agua.
Un plasma se define como un gas ionizado, esto es, una mezcla gaseosa que
contiene una concentracin significativa de cationes y de electrones. El plasma de
argn es el que se utiliza para la mayora de los espectrmetros, puede llegar a
tener una temperatura de 10000 K, establecindose el siguiente equilibrio:

Ar

Ar + + e-

En funcin de como se aporte esta energa externa, se han desarrollado tres tipos
de fuentes de alimentacin: una fuente de corriente continua (DCP), consistente
en dos electrodos sumergidos en la corriente de gas argn, y otras dos que
utilizan potentes campos de microondas (MIP) y de radiofrecuencia (ICP). De las
tres, la de radiofrecuencia (ICP) es la ms interesante desde el punto de vista
analtico.

Bobina de induccin
de radiofrecuencia

Muestra en forma de
aerosol o vaporizada
en argn

Flujo tangencial que soporta


el plasma de argn

Figura 60. Tpica fuente de plasma de acoplamiento inductivo

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La Figura 61 muestra un esquema de una fuente tpica de plasma de


acoplamiento inductivo denominada antorcha. Esta consiste en tres tubos
concntricos de cuarzo a travs de los cuales fluyen corrientes de argn.
El gas argn fluye a travs de un tubo de cuarzo de unos 2.5 cm de dimetro,
rodeado en su extremo superior por tres o cuatro anillos de una bobina de
induccin alimentada por un generador de radiofrecuencias. La frecuencia de
operacin estndar es de unos 27 MHz y la potencia de 1 a 3 kW.

Figura 61. Representacin esquemtica de la formacin del plasma.

La corriente de alta frecuencia fluyendo a travs de la bobina de induccin genera


campos magnticos oscilantes cuyas lneas de fuerza estn orientadas axialmente
en el interior del tubo. La ionizacin del argn que fluye por el interior del tubo se
inicia por medio de una descarga producida por una bobina Tesla. Los iones
originados en esta descarga y sus electrones asociados interaccionan entonces
con el campo magntico oscilante, como consecuencia de lo cual hace que se
muevan en trayectorias anulares cerradas, encontrando resistencia a ese
movimiento, lo que origina un calentamiento hmico. El plasma, una vez formado,
se auto-mantiene, y el resultado es un gas altamente ionizado con temperaturas
entre 6000 y 10000 K. Por el mecanismo explicado anteriormente, se origina una
especie de "llama" fuertemente luminosa, pero no hay combustin.
En el plasma pueden distinguirse dos zonas: un ncleo blanco brillante que
termina en una cola en forma de llama. En el ncleo tiene lugar una intensa
emisin continua procedente de la recombinacin de los electrones con los iones
argn. Esta emisin se desvanece unos 10 mm por encima del ncleo, por lo que
la regin situada entre unos 15 y 20 mm es pticamente transparente, y es donde
se llevan a cabo las medidas analticas. La antorcha de plasma est constituida
por tres tubos concntricos. La muestra, normalmente en disolucin, es aspirada
por un sistema nebulizador y transportada por el tubo central, arrastrada por el gas

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portador (argn) a una velocidad relativamente pequea (1 mL/min). Como la


temperatura obtenida es muy elevada, es necesario aislar trmicamente el plasma
para evitar el sobrecalentamiento del tubo de cuarzo. Para ello, se introduce argn
tangencialmente por el tubo ms externo a la velocidad de 10 -15 L/min. Este flujo
de argn enfra las paredes internas del tubo de cuarzo externo, y a la vez,
estabiliza y centra el plasma.

Figura 62. Plasma acoplado inductivamente


4.19.1

Introduccin de la muestra

Aunque la muestra puede ser introducida en el plasma en forma gaseosa, lquida,


o incluso como polvo muy fino, casi siempre se usan dispositivos semejantes a los
que se emplean en los mtodos de llama.

Figura 63. Nebulizador concntrico

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En la Figura 64, se muestra un nebulizador concntrico acoplado a la antorcha de


plasma. Aunque este tipo de nebulizadores se utiliza muy extensamente en ICP,
se han desarrollado otros con objeto de aumentar el rendimiento. As, con
nebulizadores ultrasnicos, se incrementa la sensibilidad entre 3 y 10 veces.

4.19.2

Caractersticas del plasma de acoplamiento inductivo (ICP)

La fuente ICP proporciona gran calidad en anlisis multi-elemental, pues


con ella se obtienen ptimos resultados para muchos elementos. Adems,
es posible trabajar con casi las mismas condiciones de operacin para
muchos de ellos.

La mayor temperatura del ICP, comparada con la combustin en las llamas,


permite la determinacin de elementos refractarios, tales como P, B, W, Zr,
U.

Los lmites de deteccin para muchos elementos son excelentes. Suelen


ser mejores que con llama, arco o chispa, si bien no siempre ms
favorables que con horno de grafito.

La mayor temperatura alcanzada, y tambin el mayor tiempo de residencia


del analito en la antorcha de plasma, hace que la atomizacin sea ms
completa y haya menos problemas de interferencias qumicas. Este hecho
tambin est favorecido porque la atomizacin tiene lugar en un medio
inerte, que evita la formacin de xidos.

Por otra parte, a pesar de la mayor temperatura, hay menos problemas de


interferencias de ionizacin. Ello se debe al efecto tampn de los electrones
procedentes de la ionizacin del argn.

En la zona del plasma situado entre 10 y 30 mm por encima de la bobina de


induccin, la emisin debida al fondo es mnima.

Al no haber electrodos, no hay problemas relacionados con su


contaminacin, como en los mtodos de arco o chispa.

La fuente presenta una gran estabilidad durante largos periodos de


operacin. Por ello, no es necesario un recalibrado frecuente, a diferencia
de los mtodos de llama, arco o chispa.

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4.19.3

La temperatura en la seccin transversal del plasma es relativamente


uniforme y como consecuencia de ello, no se producen los efectos de autoabsorcin y auto-inversin, por lo que se obtienen curvas de calibrado con
amplios mrgenes lineales. Este gran margen lineal permite la
determinacin simultnea de constituyentes mayores, menores y de trazas,
sin necesidad de diluciones ni otras operaciones sobre la muestra.

Aplicaciones de la ICP

Las fuentes de plasma acoplado inductivamente proporcionan datos analticos


mejores que otras fuentes de emisin. La calidad de estos resultados radica en la
gran estabilidad, bajo ruido, poca radiacin de fondo y en la ausencia de
interferencias de las fuentes, cuando se opera en las condiciones experimentales
apropiadas.
Esta tcnica se emplea para una amplia variedad de aplicaciones, ya que un gran
nmero de elementos pueden ser determinados rpidamente a niveles traza (ppm,
ppb), y porque una amplia variedad de tipos de muestras pueden ser analizados
utilizando esta tcnica.
Agricultura y alimentos:
Anlisis de suelos, fertilizantes, materias vegetales, alimentos...
Requiere una rigurosa preparacin de la muestra.
Biologa y clnica:
El mayor problema de los ensayos de este campo, est en la contaminacin
de las muestras antes del anlisis. Ejemplos de determinaciones:
- Cr, Ni y Cu en orina.
- Al en sangre.
- Cr en heces.
- Ni en leche materna.
- B, P y S en huesos.
Geologa:
Las aplicaciones van desde los elementos mayoritarios, minoritarios y las
trazas.
Medio ambiente y aguas:

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Se requiere un tratamiento previo de la muestra con digestiones cidas,


microondas... Incluyen anlisis de suelo, sedimentos, tejidos animales y
vegetales, adems de varios tipos de aguas.
Metales:
Una dificultad asociada es el gran nmero de interferencias espectrales de
algunos metales. Aun as, se obtienen buenos resultados.

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Leccin 20: Espectroscopia de emisin con fuentes de arco y chispa


Fueron los primeros mtodos instrumentales utilizados en el anlisis. Estn
basados en la obtencin mediante la excitacin del espectro de emisin de los
elementos por medio de arco elctrico o chispa elctrica. Estos espectros permiten
la determinacin cualitativa y cuantitativa de elementos metlicos en varios tipos
de muestras incluyendo metales, aleaciones, suelos, minerales y rocas.
En las fuentes de arco y chispa, la excitacin de la muestra se produce en el
pequeo espacio existente entre un par de electrodos. El paso de electricidad
entre los electrodos a travs de este pequeo espacio proporciona la energa
necesaria para atomizar la muestra y producir tomos o iones en el estado
electrnico excitado.

4.20.1

Tipos de muestra y manipulacin de la muestra

En esta tcnica se utilizan muestras slidas y se clasifican en muestras metlicas,


y no metlicas. En las muestras metlicas, si el metal es una aleacin, uno o
ambos electrodos se pueden preparar fresando, torneando o vertiendo el metal
fundido en un molde. Para algunas muestras es ms conveniente emplear la
superficie plana pulimentada de un trozo grande de metal como uno de los
electrodos y tomar una varilla de grafito o de metal como el otro.
En caso de muestras solidas no metlicas la muestra se coloca a menudo sobre
un electrodo cuyo espectro de emisin no interfiera en el anlisis. Los electrodos
de carbono son ideales para muchas aplicaciones.
Los fabricantes ofrecen electrodos de carbono de muchos tipos, tamaos y
formas. Normalmente, uno de los electrodos tiene forma cilndrica con un pequeo
crter abierto en uno de los extremos, en el cual se introduce la muestra finamente
pulverizada. El otro electrodo es, en general, una varilla de carbono en forma
cnica, con la punta ligeramente redondeada. Esta configuracin, proporciona el
arco o la chispa ms estables y reproducibles.

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Figura 64. Algunas formas caractersticas de los electrodos de grafito.


Otro mtodo se normalmente se utiliza para la atomizacin de muestras
pulverizadas consiste en la compactacin, conocida tambin como briquetting, o
peletilizacin de la muestra. En este caso la muestra finamente triturada se mezcla
con una cantidad relativamente grande de polvo de grafito, cobre u otra sustancia
conductora y compresible. La mezcla resultante se comprime a elevada presin
para darle la forma de un electrodo.

4.20.2
chispa

Instrumentos para la espectroscopia con fuentes de arco o de

Las fuentes de arco y de chispa, debido a su inestabilidad, requieren integrar las


seales de emisin durante al menos 20 s, y a menudo, durante un minuto o ms.
Este requisito hace que el empleo de espectrmetros secuenciales no sea prctico
para la mayora de las aplicaciones y esto exige instrumentos multicanal
simultneo. Se han aplicado 2 tipos de instrumentos multicanal a la
espectroscopia de arco y chispa, los cuales son: espectrgrafos y espectrmetros
multicanal.

4.20.3

Espectroscopia de emisin con fuente de arco

La fuente de arco usual para un anlisis espectroqumico est constituida por un


par de electrodos de grafito o de metal separado por unos milmetros. El arco se
enciende por una chispa de baja intensidad de corriente que provoca la formacin
momentnea de iones que transforman en conductor el espacio entre los
electrodos, una vez iniciado el arco, la ionizacin trmica mantiene la corriente,
luego se separan a la distancia deseada.

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4.20.3.1

Caractersticas de las fuentes de arco

La electricidad es producida en un arco mediante el movimiento de los electrones


y los iones que se forman por ionizacin trmica; la elevada temperatura que se
produce es el resultado de la resistencia de los cationes a este movimiento en el
espacio donde se produce el arco, por tanto, la temperatura del arco depende de
la composicin del plasma que a su vez depende de la velocidad de formacin de
partculas atmicas a partir de la muestra y de los electrodos. Esta temperatura del
plasma se encuentra en un rango de 4000 a 5000 K.
En el caso de tomos, los espectros obtenidos en un tpico arco son ricas en
lneas intensas y contienen un nmero menor de lneas en el caso de especies
inicas.

4.20.3.2

Bandas espectrales debido al ciangeno

Cuando con un electrodo de carbono o grafito se produce el arco en una


atmosfera de aire, se emiten unas bandas muy intensas de ciangeno, por eso se
utiliza una atmosfera controlada de nitrgeno o dixido de carbono para controlar
esas emisiones.

4.20.3.3

Velocidad de emisin

Se ha demostrado experimentalmente que la velocidad a que las especies se


volatilizan y se excitan diferente considerablemente unas que otras. Los espectros
de unas especies aparecen pronto y despus desaparecen a medida que la
muestra se consume; los espectros de otras especies alcanzan su mxima
intensidad a tiempos mayores. Por ello es necesario integrar seales de emisin
por un minuto ms.

4.20.3.4

Aplicaciones de la fuente de arco

Las fuentes de arco son muy tiles para el anlisis cualitativo y semicuantitativo de
muestras no metlicas, como suelos, muestras vegetales, rocas y minerales.
Normalmente, de 2 a 50 mg de muestra en forma de polvo, molienda, pequeos
trozos o limaduras se mezclan con una cantidad pesada de grafito y se introducen
en la cavidad de los electrodos de grafito, donde generalmente, el electrodo
portamuestras hace de nodo y el segundo contraelectrodo acta de ctodo.

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En el anlisis cualitativo de muestras no rutinarias, se utiliza de manera habitual el


registro fotogrfico obtenindose varios espectros en una placa moviendo
verticalmente la cmara tras cada excitacin.
La excitacin con arco tambin se utiliza para anlisis cuantitativo. Sin embargo, la
precisin obtenida con el arco es significativamente ms pobre que con la chispa y
mucho ms pobre que con el plasma o la llama. Adems, las intensidades de
emisin de las muestras slidas dependen en gran medida de la muestra y debido
a esto es necesario igualar la matriz en los patrones y en las muestras para
obtener resultados satisfactorios.

4.20.4

Fuentes de chispa y espectros de chispa.

Se han desarrollado diversos circuitos que producen chispas de alta tensin para
espectroscopia de emisin. Una chispa intermitente que siempre se propaga en la
misma direccin proporciona mayor precisin y menor deriva de la emisin
radiante. Se utiliza un conjunto de circuitos de estado slido para el control de la
frecuencia y la duracin de la chispa que por lo general con una corriente de 60 Hz
se producen cuatro descargas de chispa por cada semiciclo.
Con una chispa de alta tensin. La corriente promedio es generalmente bastante
menor que en un arco tpico. Por otra parte, en la fase inicial de la descarga, la
corriente instantnea puede sobrepasar los 1000 A; en este caso, la electricidad
circula por un canal estrecho que ocupa una minscula parte del espacio total en
el que se produce la chispa. La temperatura en esta regin puede llegar a ser de
40 000 K. As, mientras la temperatura media de una fuente de chispa es mucho
menor que la de un arco, la energa en el pequeo volumen del canal puede ser
varias veces mayor. Como consecuencia, los espectros los espectros de iones son
ms pronunciados en una chispa de alta tensin que en un arco.

4.20.4.1

Aplicaciones de la espectroscopia con fuente de chispa

Los anlisis cuantitativos con chispa requieren el control preciso de muchas


variables que intervienen en la preparacin y excitacin de la muestra, y tambin
en el procesado de la pelcula en los espectrgrafos. Adems, las medidas
cuantitativas requieren la preparacin cuidadosa de una serie de patrones para el
calibrado los cuales deberan aproximarse lo ms posible a la composicin y
propiedades fsicas de las muestras a analizar.

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Actualmente, la principal aplicacin de la espectroscopia de emisin con fuente de


chispa es la identificacin y anlisis de metales y otros materiales conductores. La
deteccin se realiza normalmente con un policromador equipado con tubos
fotomultiplicadores. Los espectrmetros con fuente de chispa, y en menor grado
los de fuente de arco, se utilizan habitualmente y de manera importante en
fundiciones, fbricas, chatarreras e industrias metalrgicas. Los instrumentos
utilizados en estas aplicaciones son con frecuencia mviles y estn equipados con
una pistola porttil con la fuente de arco o chispa que el operador puede poner en
contacto con la superficie metlica para producir la excitacin. Dichos equipos se
utilizan para la identificacin rpida de aleaciones y para el anlisis de la mezcla
fundida antes de obtener la pieza de fundicin.

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Ejercicios (Unidad 2 Captulo 4)

1.

Cul de las siguientes afirmaciones NO es cierta para la espectroscpica


de emisin atmica?
a. Es un buen mtodo para anlisis de trazas con concentraciones del
orden de ppm.
b. Se necesita mucha cantidad de muestra.
c. Las muestras pueden analizarse sin preparaciones, sin separaciones
qumicas previas.
d. Ninguna de las anteriores.

2.

Cul de las siguientes NO hace parte de la instrumentacin de un equipo


de emisin atmica?
a.
b.
c.
d.
e.

3.

La llama
El arco elctrico con corriente directa
La chispa elctrica con corriente alterna
Los prismas
La microsonda lser

Cul de las siguientes es una aplicacin de la emisin atmica?


a. Anlisis de suelos, fertilizantes, materias vegetales, alimentos, entre
otros.
b. Deteccin de elementos presentes en la superficie.
c. Investigaciones geomineras, cristalogrficas, mineralgicas y
petrolgicas.
d. Control de calidad y estudio de fatiga de materiales, caractersticas
texturales.

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4.

El plasma de argn es el que se utiliza para la mayora de los


espectrmetros, puede llegar a tener una temperatura de 10000 K. cul de
los siguientes equilibrios se establece para el argn?
a.

b.

c.

5.

Cul NO hace parte de la emisin atmica


a.
b.
c.
d.
e.

Fuente de plasma
Plasma de acoplamiento inductivo
Can electrnico
Fuentes de chispa
Fuentes de arco

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CAPTULO 5: ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA

Introduccin
La espectroscopia de fluorescencia atmica (AFS) es una tcnica de emisin que
ofrece una gran sensibilidad en la regin ultravioleta. Sin embargo, su sensibilidad
es mucho menor en la regin visible debido a las intensas interferencias que
experimenta en la lnea base y a procesos de quenching en esta zona espectral.
Para que pueda producirse el proceso de emisin fluorescente, previamente debe
haber tenido lugar un proceso de absorcin que implicar dos o ms transiciones
electrnicas. El proceso emisivo fluorescente puede producirse de diversas formas
lo que implica que existan distintos tipos de fluorescencia: fluorescencia
resonante, fluorescencia sensibilizada, fluorescencia Stokes o anti-Stokes,
fluorescencia retardada.
La fluorescencia es un proceso de emisin en el cual las molculas son excitadas
por la absorcin de radiacin electromagntica. Las especies excitadas se relajan
al estado fundamental, liberando su exceso de energa en forma de fotones. Una
de las caractersticas ms atractivas de los mtodos de fluorescencia es su
sensibilidad inherente, la cual es, con frecuencia, de uno a tres rdenes de
magnitud mejor que las de la espectroscopia de absorcin. No obstante, los
mtodos de fluorescencia se aplican mucho menos que los mtodos de absorcin
debido al nmero relativamente limitado de sistemas qumicos que se pueden
hacer fluorescer.

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Leccin 21: Teora de la fluorescencia molecular


Normalmente, el tiempo de vida media de una especie excitada es breve porque
hay diversas formas en las cuales un tomo o una molcula excitada liberan su
exceso de energa y se relajan a su estado fundamental. Dos de las ms
importantes de estos mecanismos son la relajacin (desactivacin) no radiante y la
relajacin fluorescente.

Relajacin vibracional
Relajacin no radiante
Conversin interna

5.21.1 Fenmeno de relajacin vibracional


Sealada por las flechas onduladas cortas entre los niveles de energa
vibracionales, tiene lugar durante las colisiones entre molculas excitadas y las
molculas del disolvente. Durante estas colisiones el exceso de energa
vibracional se transfiere a las molculas del disolvente en una serie de etapas
como se indica en la Figura 66.

Figura 65. Diagrama parcial de energa para un sistema fotoluminiscente

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La ganancia de energa vibracional del disolvente se refleja en un ligero


incremento de la temperatura del medio. La relajacin vibracional es un proceso
tan eficiente que el tiempo de vida promedio de un estado vibracional excitado es
de 10-15 s aproximadamente.
Tambin puede ocurrir el relajamiento no radiante entre el nivel vibracional inferior
de un estado electrnico excitado y el nivel vibracional superior de otro estado
electrnico. Este tipo de relajacin llamado algunas veces conversin interna, se
ilustra por las flechas onduladas largas. En la figura se ilustra el otro proceso de
relajacin: la fluorescencia. Se puede observar que las bandas de radiacin son
producidas cuando las molculas fluorecen debido a que las molculas
electrnicamente excitadas se pueden relajar a cualquiera estados vibracionales
del estado electrnico fundamental. De igual forma que las bandas de absorcin
molecular, las bandas de fluorescencia molecular estn formadas por una multitud
de lneas espaciadas tan estrechamente que son muy difciles de resolver. El
camino ms probable hacia el estado fundamental es aquel que minimiza el
tiempo de vida media del estado excitado. Por tanto, si la desactivacin por
fluorescencia es rpida con respecto a los procesos sin radiacin, se observa tal
emisin. Por otro lado, si un camino sin radiacin tiene una constante de velocidad
favorable, la fluorescencia no tiene lugar o es menos intensa.
La fotoluminiscencia est limitada a un nmero relativamente pequeo de
sistemas que incorporan caractersticas estructurales y ambientales que hacen
que la velocidad de los procesos de desactivacin sin radiacin se reduzcan hasta
el punto que la reaccin de emisin puede competir cinticamente.
Se observa que las bandas de fluorescencia molecular estn formadas
principalmente por bandas que tienen longitudes de onda ms largas y, por tanto,
energas menores que la banda de radiacin responsable de su excitacin. Este
desplazamiento hacia longitudes de onda mayores se llama desplazamiento de
Stokes. En aquellos casos en los que la radiacin absorbida sea emitida sin
cambio en la longitud de onda (misma energa) se conoce como radiacin de
resonancia o resonancia fluorescente.
Debido a que las diferencias de energa entre los estados vibracionales es
aproximadamente el mismo, tanto para el estado fundamental como para el
excitado, la absorcin, o espectro de excitacin, y el espectro de emisin o
fluorescencia de un compuesto frecuentemente aparece como una imagen
especular de uno a otro con una sobreposicin que ocurre en la lnea de
resonancia.

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Figura 66. Espectro de fluorescencia de antraceno en alcohol.


(a) espectro de excitacin; (b) espectro de emisin.

5.21.2

Variables que afectan la fluorescencia

5.21.2.1

Rendimiento cuntico

El rendimiento cuntico o la eficacia cuntica de la fluorescencia es simplemente


la relacin entre el nmero de molculas que emiten fluorescencia respecto al
nmero total de molculas excitadas. Las molculas altamente fluorescentes, por
ejemplo, la fluoresceina, tienen eficiencias cunticas que, en ciertas condiciones,
se aproximan a la unidad. Las especies no fluorescentes tienen eficiencias que
son prcticamente cero.

5.21.2.2

Estructura

La fluorescencia ms intensa y la ms til es la que presentan los compuestos que


contienen grupos funcionales aromticos. Los compuestos que contienen
estructuras alifticas y alicclicas de carbonilo o estructuras con dobles enlaces
muy conjugados pueden presentar tambin fluorescencia. La mayora de los

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hidrocarburos aromticos no sustituidos son fluorescentes en disolucin, la


eficacia cuntica aumenta con el nmero de anillos y con su grado de conjugacin.
La sustitucin en un anillo aromtico causa desplazamientos en la longitud de
onda de absorcin mxima y los cambios correspondientes en los picos de
fluorescencia. Adems, la sustitucin afecta frecuentemente la eficiencia de la
fluorescencia como se demuestra en la Tabla 5.

Tabla 5. Efecto de la sustitucin en la fluorescencia del benceno


Compuesto

Frmula

Longitud de onda de
la fluorescencia, nm

Intensidad relativa de
la fluorescencia

Benceno

C6H6

270-310

10

Tolueno

C6H5CH3

270-320

17

Propilbenceno

C6H5C3H7

270-320

17

Fluorobenceno

C6H5F

270-320

10

Clorobenceno

C6H5Cl

275-345

Bromobenceno

C6H5Br

290-380

Iodobenceno

C6H5I

Fenol

C6H5OH

285-365

18

Ion fenolato

C6H5O

310-400

10

Anisol

C6H5OCH3

285-345

20

Anilina

C6H5NH2

310-405

20

Ion anilinio

C6H5NH3

Acido benzoico

C6H5COOH

310-390

Benzonitrilo

C6H5CN

280-360

20

Nitrobenceno

C6H5NO2

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5.21.2.3

Rigidez estructural

Empricamente se encuentra que la fluorescencia est particularmente favorecida


en molculas que poseen estructuras rgidas. Por ejemplo, las eficacias cunticas
para el fluoreno y el bifenilo estn prximas a 1'0 y 0'2, respectivamente, bajo
condiciones similares de medida.

Fluoreno

Binefilo

La influencia de la rigidez tambin tiene importancia en el aumento de la


fluorescencia de ciertos quelatantes orgnicos cuando estn formando un
complejo con un ion metlico. Por ejemplo, la fluorescencia de la 8hidroxiquinolena es mucho menor que la de su complejo con zinc.

5.21.2.4

Temperatura y disolvente

La eficacia cuntica de la fluorescencia disminuye en muchas molculas con el


aumento de la temperatura, ya que el aumento de la frecuencia de las colisiones a
temperatura elevada hace aumentar la probabilidad de desactivacin no radiante
(conversin externa). Una disminucin en la viscosidad del disolvente tambin
aumenta la probabilidad de conversin externa y produce el mismo resultado.

5.21.2.5

Efecto del pH

La fluorescencia de un compuesto aromtico con sustituyentes cidos o bsicos


en el anillo depende normalmente del pH. Tanto la longitud de onda como la
intensidad de emisin son probablemente diferentes para la forma ionizada y no
ionizada del compuesto. Por lo tanto ser muy frecuente en los mtodos
fluorimtricos el control estricto del pH.

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5.21.2.6

Efecto de la concentracin

La potencia de la radiacin fluorescente F es proporcional a la potencia radiante


del haz de excitacin que es absorbido por el sistema.
(

Ecuacin 2.6

Donde P0 es la potencia del haz incidente sobre la disolucin y P es su potencia


despus de atravesar la longitud b del medio. La constante K' depende de la
eficacia cuntica del proceso de fluorescencia. Con objeto de relacionar F con la
concentracin c escribimos la ley de Beer as:
Ecuacin 2.7
Sustituyendo nos queda:
(

Ecuacin 2.8

Si desarrollamos el trmino exponencial como una serie de Maclaurin ser;


[

Ecuacin 2.9

Siempre que 2'303bc < 0'05 podemos escribir que,


Ecuacin 2.10

y si P0 se mantiene constante,
Ecuacin 2.11
Cuando c es suficientemente elevada como para que la absorbancia multiplicada
por 2'303 sea mayor que 0'05, los trminos de mayor orden de la expresin
anterior no son despreciables y la linealidad se pierde. Este efecto es un resultado
de autoapagamiento, en el cual las molculas del analito absorben la fluorescencia
producida por otras molculas de analito.

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Leccin 22: Instrumentacin


Como la mayor parte de los instrumentos utilizados en los mtodos
espectroscpicos, los componentes principales de un fluormetro son: una fuente
de radiacin, un sistema selector de longitudes de onda (filtro o monocromador),
una clula conteniendo la muestra, y un detector. Sin embargo, una diferencia
importante entre la fluorimetra (tambin la fosforimetra) y los dems mtodos
espectroscpicos es la presencia de dos filtros (o dos monocromadores); uno para
seleccionar la longitud de onda de excitacin y otro para la de emisin.
En la Figura 67 se han representado los componentes bsicos de un fluormetro.
En espectrmetros de luminiscencia se necesitan fuentes de radiacin ms
intensas que las lmparas de volframio o de deuterio que se utilizan en las
medidas de absorcin. Anteriormente se indic que la intensidad de fluorescencia
es directamente proporcional a la potencia del haz incidente.
La lmpara de arco de xenn presenta un espectro esencialmente continuo que se
extiende por las regiones ultravioleta y visible, siendo muy utilizada en espectrofluormetros de red. Por otra parte, en los fluormetros de filtro, suele utilizarse la
lmpara de arco de mercurio, la cual emite un intenso espectro de lneas sobre un
fondo continuo. El uso de esta fuente puede implicar una mayor sensibilidad,
debido a la alta intensidad de las lneas del mercurio.

Figura 66. Componentes bsicos de un fluormetro

Los sistemas para seleccionar la longitud de onda ms empleados en


instrumentos de luminiscencia son filtros y redes. De hecho, los instrumentos se
clasifican en fluormetros de filtro y espectrofluormetros de red. De los primeros,

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los ms utilizados son los filtros de interferencia, por proporcionar pequeas


anchuras de banda.
Por lo que respecta a las redes, ofrecen las ventajas de presentar resolucin
uniforme y dispersin lineal a todas las longitudes de onda. El mayor
inconveniente es que pasan varios rdenes espectrales, lo cual puede evitarse
usando filtros en el camino ptico.

5.22.1

Los prismas

Se usan poco en instrumentos para luminiscencia, porque, aunque proporcionan


una gran dispersin en el ultravioleta, es en el visible donde se realizan muchas
medidas, y, adems, para obtener una sensibilidad adecuada se necesitara un
prisma muy grande, lo cual no es econmico.

5.22.2

Las cubetas

Son utilizadas para contener la muestra, suelen ser de cuarzo para permitir el
paso de la radiacin ultravioleta. Las ms tpicas son de 1 cm de espesor, como
las utilizadas para medidas de absorcin, excepto que todas las caras son
transparentes a la radiacin (estn pulidas), ya que generalmente las medidas de
fluorescencia se realizan en un ngulo de 90 respecto a la radiacin incidente; a
otros ngulos, la dispersin por la disolucin y las propias paredes de la cubeta
puede originar mayor ruido de fondo.

5.22.3

Los detectores

La mayor parte de los fluormetros y espectrofluormetros actuales usan tubos


fotomultiplicadores como sistemas para detectar la radiacin de fluorescencia.
Finalmente, mencionar que mientras que los ms precisos espectrofotmetros de
absorcin ultravioleta y visible utilizan un dispositivo de doble haz, esta operacin
no es prctica en instrumentos de luminiscencia. Por ello, hay que tener en cuenta
siempre los problemas inherentes al empleo de haz sencillo.

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Leccin 23: Relacin entre intensidad de fluorescencia y concentracin


La intensidad de fluorescencia, If, es directamente proporcional a la concentracin,
C, de la sustancia absorbente, pero solo a concentraciones relativamente bajas, lo
cual puede demostrarse como sigue: la fraccin de radiacin transmitida, segn la
Ley de Beer, es:
Ecuacin 2.12
donde,

Po = potencia del haz incidente


P = potencia del haz transmitido
= absortividad
b = espesor de la cubeta (camino ptico)
C = concentracin

La fraccin de radiacin absorbida es:


Ecuacin 2.13
y la cantidad de radiacin absorbida es:
(
)
Ecuacin 2.14
La intensidad de la radiacin fluorescente, If, est relacionada con la cantidad de
radiacin absorbida de la forma siguiente:
(

Ecuacin 2.14

Donde k es una constante de proporcionalidad, que depende de parmetros


instrumentales (eficacia del sistema detector y geometra) y f es el rendimiento
cuntico de la fluorescencia (relacin entre el nmero de fotones emitidos y los
absorbidos por unidad de tiempo).
El trmino 110bC puede desarrollarse como una serie de McLaren,
Ecuacin 2.15

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[
(

Ecuacin 2.16

de donde,
[

Ecuacin 2.17

Para bajas concentraciones, cuando el trmino bC sea menor que


aproximadamente 0.05, todos los trminos de la Ecuacin 2.17, excepto el
primero, son muy pequeos, y la expresin se reduce a
Ecuacin 2.18
As, para disoluciones muy diluidas, la intensidad de fluorescencia ser
directamente proporcional a la concentracin:
Ecuacin 2.19
En la Figura 68 se muestra una representacin grfica de la variacin de la
intensidad de fluorescencia con la concentracin.

Figura 67. Relacin entre la intensidad de fluorescencia y la concentracin

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A concentraciones relativamente altas, los trminos de mayor orden de la


Ecuacin 2.19, pueden ser lo suficientemente importantes, para que se pierda la
linealidad, como ya se coment anteriormente. Sin embargo, existen otras causas
para la no linealidad a concentraciones altas. Son las siguientes:

5.23.1

Autoatenuacin.

Se produce como consecuencia del choque entre molculas excitadas, lo cual


origina una desactivacin en forma de energa no radiante. Lgicamente, al
aumentar la concentracin, aumentar la probabilidad de que se produzcan esas
colisiones.

5.23.2

Autoabsorcin.

En este caso, la fluorescencia de una molcula es absorbida por otra molcula del
mismo soluto en estado fundamental, y la probabilidad de tales eventos crece al
aumentar la concentracin. La auto-absorcin reduce la intensidad de
fluorescencia, salvo que f sea la unidad. Por ello, la representacin grfica de If
frente a C puede hacerse incluso descendente para altos valores de C.
Como ya se vio, If es proporcional a la absortividad molar: a mayor absorcin,
mayor fluorescencia. Sin embargo, cuando la absorcin es demasiado grande y la
disolucin bastante concentrada, la porcin de la disolucin ms prxima a la
fuente luminosa absorbe mucha radiacin, de forma que queda muy poca
disponible para el resto. Si la concentracin es tan grande que toda la radiacin
incidente es absorbida, If = k f (Po P) = k f Po, en cuyo caso, If tiende al valor
de k Po (ver Figura 68).
Muchas molculas aromticas (especialmente aquellas con grupos funcionales
capaces de unirse por enlaces de hidrgeno) forman dmeros u otros agregados
en disolucin. Esta tendencia, lgicamente ser mayor a altas concentraciones de
soluto. Considerando que, con frecuencia, los dmeros son menos fluorescentes
que el correspondiente monmero, se observar un descenso de I f como
consecuencia de la formacin de estas especies dmeras.

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Por otra parte, ciertos compuestos en estado singulete excitado tienen tendencia a
formar asociaciones con molculas de su misma especie en estado fundamental.
El espectro de emisin de estas asociaciones suele estar desplazado hacia
mayores longitudes de onda respecto al del correspondiente monmero.

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Leccin 24: Aplicaciones de los mtodos de fluorescencia


En cuanto a las aplicaciones de los mtodos fluorimtricos, y ante la imposibilidad
de dar cuenta de todas ellas, se citarn algunos ejemplos especficos, dentro de
los grupos que se relacionan seguidamente.

5.24.1

Sustancias inorgnicas

Las sustancias inorgnicas pueden determinarse por los mtodos siguientes:

5.24.1.1

Anlisis directo

Aunque, bastantes especies inorgnicas presentan fluorescencia en estado slido,


pocos son los sistemas de este tipo aplicables analticamente. En disolucin,
tampoco son demasiado numerosas las determinaciones directas; prcticamente
se circunscriben a compuestos de uranilo (las sales de uranio tetravalente y los
uranatos no son fluorescentes), algunos elementos pertenecientes a las tierras
raras [Ce(III), Eu(III), Tb(III), Dy(III)] y Tl(I). Este ltimo, en presencia de cloruro
(TlCl43) muestra una intensa emisin fluorescente a 450 nm. Un ensayo
cualitativo para Tl(I) se basa en su fluorescencia violeta en presencia de KCl.

5.24.1.2

Formacin de quelatos fluorescentes.

La formacin de quelatos fluorescentes por combinacin de un in metlico con un


ligando orgnico proporciona uno de los mtodos ms sensibles y selectivos para
la determinacin de muchos elementos. En la Tabla 6 se muestran algunos
ejemplos.
La mayor parte de las aplicaciones inorgnicas de la fluorimetra se han
desarrollado para elementos que no son de transicin, pues aunque muchos iones
metlicos de transicin forman quelatos muy estables y complejos con ligandos
aromticos, un nmero relativamente pequeo de ellos son fluorescentes. Ello se
debe a lo siguiente: en primer lugar, muchos iones de transicin son
paramagnticos, lo cual favorece el cruzamiento entre sistemas y, en

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consecuencia, disminuye la probabilidad de desactivacin por fluorescencia.


Adems, muchos complejos de metales de transicin poseen una gran cantidad
de niveles energticos poco espaciados, lo cual aumenta la probabilidad de
desactivacin por conversin interna.

Tabla 6. Determinacin fluorimtrica de especies inorgnicas.

Reactivo

Sensibilidad (g/mL)

Butilrodamina S

0.01

3+

Morina

0.05

3+

Rojo de alizarina

0.007

Luminocupferrn

0.1

8-hidroxiquinolena

0.2

Flavonol

0.1

Especie
Ag
Al
Al

2+

Cu

Li

4+

Sn

Determinaciones indirectas
Reactivo

Sensibilidad (g/mL)

Nitrato de uralino

1.0

Al-morina

0.2

Al-morina

0.05

Especie
Cl
F

3-

PO4

5.24.1.3

Determinaciones indirectas.

Algunos aniones, tales como F o CN pueden determinarse indirectamente por


medida de la disminucin de la intensidad de fluorescencia de un determinado
quelato (Ver Tabla 6). As, por ejemplo, el fluoruro puede determinarse
indirectamente mediante el descenso de la fluorescencia que su presencia ejerce
sobre la fluorescencia del complejo aluminiomorina, con un lmite de deteccin de
0.2 g/mL. En otros casos tiene lugar la liberacin de un ligando y la formacin

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posterior de un quelato fluorescente con otra especie. As, es posible la


determinacin de cianuro mediante el proceso descrito en la Figura 69.

Figura 68. Determinacin fluorimtrica del cianuro.

5.24.2

Sustancias orgnicas

Existe una amplia variedad de compuestos orgnicos que pueden determinarse


por mtodos fluorimtricos a niveles inferiores a 1 ppm (g/mL), y algunas de las
especies ms fluorescentes, tales como la fluorescena o la quinina a niveles
considerablemente inferiores.
Hay que recordar que, en principio, presentarn fluorescencia molecular especies
altamente absorbentes, como compuestos no aromticos altamente conjugados,
aromticos y heterocclicos. Por eso, gran cantidad de hidrocarburos, colorantes,
cidos, aldehdos, alcoholes, compuestos nitrogenados, hidratos de carbono,
pesticidas, porfirinas, esteroides, frmacos, etc. son susceptibles de ser
detectados o determinados por mtodos fluorimtricos.
A modo de ejemplo, puede citarse la determinacin de vitaminas, interesante
desde el punto de vista histrico, por ser uno de los primeros grupos de
compuestos biolgicamente activos para los que se describieron mtodos
fluorimtricos. Muchos de estos compuestos tienen estructuras que presentan
fluorescencia nativa, mientras que otros pueden convertirse en fluorforos por
procedimientos sencillos (Tabla 7).

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Tabla 7. Determinacin fluorimtrica de vitaminas


Vitamina

Reactivo

ex

em

Fluorescencia nativa

340

480

B1

+ ferricianuro

365

445

B2

Fluorescencia nativa

370

440

B6

+ KMnO4

350

450

B12

Fluorescencia nativa

275

305

Ac. Dehidroascrbico +
o-fenilendiamina

350

430

D3

+ Ac. tricloroactico

390

480

Fluorescencia nativa

270

370

--

--

--

D2

La vitamina A puede determinarse aprovechando la fluorescencia nativa que


presenta, midiendo la radiacin emitida a 480 nm.

Figura 69. Estructura qumica de la vitamina A.

Dentro del grupo de vitaminas B, las hay que presentan fluorescencia nativa, como
la B2 (riboflavina) y la B12 (cianocobalamina), mientras que otras, como la B1
(tiamina) y la B6 (piridoxina) necesitan una transformacin previa, lo cual se
consigue por oxidacin con ferricianuro y permanganato respectivamente.

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La vitamina C requiere la transformacin previa en cido dehidroascrbico y


posterior condensacin con o-fenilendiamina, para originar un fluorforo azul. Por
su parte, las vitaminas D2 y D3 dan productos altamente fluorescentes cuando se
tratan con cido tricloroactico y otros cidos.
El tocoferol (vitamina E) puede determinarse fluorimtricamente haciendo uso de
su fluorescencia nativa, o bien, puede condensarse con o-fenilendiamina, despus
de oxidacin para dar un derivado fluorescente de fenacina.
Para la vitamina K no se han descrito mtodos fluorescentes debido a que sufre
descomposicin a la luz ultravioleta.
Dentro de este epgrafe general en el que se trata de las aplicaciones de la
fluorimetra a la deteccin y determinacin de compuestos orgnicos, se indican
seguidamente algunas aplicaciones dentro de campos concretos.

5.24.3

Qumica clnica

La ms extensa aplicacin de los mtodos fluorimtricos, en trminos de nmero


de anlisis realizados por da, tiene lugar, probablemente, en qumica clnica.
Muchas determinaciones clnicas importantes se realizan rutinariamente por estos
mtodos en muchos laboratorios. La alta sensibilidad, simplicidad y bajo coste de
la instalacin son factores importantes en la adopcin de estos mtodos. De los
centenares de mtodos descritos para decenas de compuestos diferentes, se
citan, a modo de ejemplo, y como curiosidad algunos de ellos.
La determinacin de fenilalanina es posible fluorimtricamente usando solamente
25 L de suero. Es importante esta determinacin para la prevencin de ciertos
tipos de subnormalidad, ya que, la incapacidad para metabolizar este aminocido
hace que tenga lugar su acumulacin en los tejidos, originando daos en el
cerebro y retraso mental progresivo.
Asimismo, pueden determinarse estrgenos en orina, en concentraciones del
orden de 0.05 g/mL, corticosteroides, de gran importancia para evaluar la funcin
de las glndulas suprarrenales, catecolaminas, importantes por su influencia sobre
el sistema vascular, porfirinas en orina, que pueden servir para indicar defectos en
la mdula sea, trastornos hepticos e incluso envenenamiento por plomo, as
como otras especies de gran importancia prctica en muchos casos de inters
clnico.

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La fluorimetra tambin se utiliza con xito en anlisis bioqumico. As, por


ejemplo, es posible la determinacin de la secuencia de nucletidos en el ADN
con marcas fluorescentes, lo cual es fundamental para la elaboracin de los
cdigos genticos. La forma de proceder consiste en "marcar" las unidades
fundamentales de terminacin de cadena con grupos fluorescentes que emitan a
longitudes de onda determinadas.

5.24.4

Anlisis forense

La gran sensibilidad de muchos mtodos fluorimtricos hace que sean


particularmente adecuados en muchas determinaciones relacionadas con anlisis
forense. Como ejemplo se muestra seguidamente la forma de detectar huellas
digitales latentes por fluorescencia producida por lser.
Cuando un dedo presiona sobre una superficie, aproximadamente 0.1 mg
de material permanece adherido a ella. De l, el 98-99 % es agua, que se
evapora, quedando un residuo del orden de 1 g. Aproximadamente, la
mitad son sustancias inorgnicas (por ejemplo, NaCl) y el resto una mezcla
de sustancias orgnicas (aminocidos, lpidos, vitaminas). La deteccin de
los restos de aminocidos se lleva a cabo por tratamiento con ninhidrina (I),
la cual reacciona con ellos originando un producto prpura (II), no
fluorescente, invisible si la cantidad es muy pequea (ver Figura 71).

Figura 70. (I) Ninhidrina reactivo empleado en la deteccin de huellas; (II)


producto obtenido de la reaccin con ninhidrina.
Posteriormente, por tratamiento con cloruro de cinc, se forma un producto
fluorescente (III) que se pone de manifiesto mediante su fluorescencia
inducida por lser.

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Figura 71. Producto fluorescente obtenido en la reaccin realizada en la deteccin


de huellas.

5.24.4 Frmacos y drogas


La fluorimetra tambin encuentra amplia aplicacin en el anlisis de frmacos y
drogas. Su importancia se basa en la gran sensibilidad y selectividad de las
tcnicas fluorimtricas. Hay que considerar que la farmacologa requiere mtodos
analticos capaces de distinguir entre varios medicamentos y sus productos
metablicos. Debido a que muchos frmacos se administran en dosis muy
pequeas, con frecuencia inferiores a 100 g diarios, los mtodos analticos deben
ser altamente sensibles, sensibilidad que debe ser suficiente para detectar las
pequeas cantidades expulsadas del organismo.
En la Tabla 8 se muestran algunos ejemplos de determinaciones fluorimtricas
para este tipo de sustancias.

Tabla 8. Determinacin fluorimtrica de frmacos y drogas


Sustancia

Condiciones

ex (nm)

em (nm)

Sensibilidad (g/mL)

Adrenalina

pH 1

295

335

0.1

Ac. saliclico

pH 11

310

435

0.1

Ampicilina

Hidrlisis

346

422

0.05

Aspirina

HAc-CHCl3

280

335

0.01

Atropina

eosina

365

556

1.0

Codeina

pH 1

245.285

350

0.1

Digital

HCl-glicerina

350

465

0.1

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Estreptomicina

pH 13

366

445

0.1

LSD

pH 7

325

365

0.002

Morfina

pH 1

285

350

0.1

Pentotal

pH 13

315

530

0.1

Quinina

pH 1

350

450

0.002

5.24.5

Qumica Agroalimentaria

Tambin se utilizan las tcnicas luminiscentes con cierta extensin. As, por
ejemplo, los antioxidantes son sustancias que se aaden a los alimentos que
contienen grasas o aceites para evitar su degradacin durante el proceso de
elaboracin. Una de las sustancias empleadas es el hidroxianisol butilado (BHA).
Esta sustancia est permitida por la legislacin vigente y puede separarse por
destilacin con arrastre en corriente de vapor y determinarla directamente en el
destilado por espectrofluorimetra ( ex=293 nm; em=323 nm).

5.24.6

Contaminacin ambiental

Muchas aplicaciones de los mtodos fluorimtricos en relacin con la


contaminacin atmosfrica se refieren a la determinacin de hidrocarburos
aromticos polinucleares, muchos de los cuales son cancergenos. En ocasiones,
pueden cuantificarse productos no fluorescentes mediante una reaccin previa
que origine un fluorforo y en combinacin con tcnicas de separacin
cromatogrfica. As, por ejemplo, se han encontrado isocianatos alifticos (muy
perjudiciales para la salud) en el aire de lugares de trabajo donde se emplean
espumas de poliuretano. El procedimiento consiste en tratar con 1-naftilmetilamina para formar derivados fluorescentes que pueden separarse por
cromatografa lquida.

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Figura 72. Mtodo fluorimtrico para la determinacin de hidrocarburos


aromticos polinucleares.

Respecto a la contaminacin de aguas, se encuentra un interesante ejemplo en


el uso del espectro de fluorescencia casi como "huella digital" para la identificacin
de crudos y otros materiales petrolferos procedentes de vertidos. La tcnica,
relativamente moderna, proporciona unos resultados tan dignos de confianza, al
menos, como los obtenidos por procedimientos de identificacin convencionales,
habiendo sido adoptada por los servicios de guarda costas de algunos pases.

Ejemplo
Se desea analizar vitamina B1 en un preparado comercial de 2.000 g por el
mtodo del tiocromo. Se extrae con HCl y fosfatasa y se diluye a 100 mL. Se
purifica una alcuota de 15 mL pasndola por una columna cromatogrfica, y por
causas inherentes al proceso se diluye a 25 mL. De la anterior solucin, se forman
dos porciones de 5 mL, una de ellas se trata con ferricianuro y ambas se aforan a
10 mL para examen fluorimtrico. Una solucin de referencia de 0.2 ppm de
tiamina se somete al mismo tratamiento que la muestra problema, con excepcin
de que la porcin introducida en la columna conserva su volumen original. Se
toman dos alcuotas de 5 mL y una se oxida y ambas se aforan a 10 mL. Se mide
la fluorescencia de ambas muestras dando lugar a intensidades de fluorescencia
de 18 y 13 unidades de fluorescencia, respectivamente. Calcular los ppm de
vitamina B1 en la muestra.
Solucin:
Como el tratamiento del patrn y de la muestra problema son idnticos, salvo la
dilucin de 15 a 25 mL en la columna cromatogrfica, hacemos referencia a la
concentracin de patrn de 0.2 ppm de tiamina, que da una fluorescencia de 13

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unidades. Por tanto, 18 unidades de fluorescencia se corresponden a una


concentracin de tiamina de:

Esta concentracin debe ser corregida por la exclusiva dilucin cromatogrfica que
sufre la muestra problema. Luego la concentracin de tiamina en los 100 mL es:
(

Para obtener los mg de tiamina en la muestra, se multiplica la concentracin por el


volumen expresado en litros:
mg de tiamina en 100 mL o 2 gramos de muestra = 0.4615 (mg/L) * 0.1 L =
0.04615 mg.
Para obtener los ppm (mg analito / Kg muestra) de tiamina en la muestra:
ppm de tiamina en la muestra = 0.04615 (mg) / 2x10-3 Kg = 23.1 ppm

Ejemplo
En ausencia de autoabsorcin, la intensidad de fluorescencia de una muestra es
proporcional a la concentracin, solo a concentraciones bajas. Calcular el
porcentaje de error que se comete suponiendo que la respuesta es lineal cuando
se mide la intensidad relativa de fluorescencia de disoluciones 2.5x10 -5 y 2.5x10-6
M de un compuesto cuya e=4000 L mol-1 cm-1 si el valor de b es 1 cm.
Solucin:
Tericamente, la intensidad de fluorescencia, IF, es proporcional a la eficacia
cuntica, F, y a la intensidad de radiacin absorbida por la muestra (I0-I),
diferencia entre la intensidad incidente y la intensidad transmitida:
(

Ecuacin 2.20

Por otra parte, la transmitancia se define como la relacin entre la Intensidad


transmitida, I, y la intensidad incidente I0, siendo la Absorbancia, A, el logaritmo
decimal de la transmitancia cambiado de signo:

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Por tanto:
(

10-bc se puede aproximar, a concentraciones bajas a la serie de Taylor. Para ello


es necesario hacer un cambio de base:
(

por lo tanto

El desarrollo de la serie de Taylor para ex cuando x tiende a cero es:


( )

( )

( )

( )

( )

( )

( )

De tal manera que, cuando x tiende a cero (bajas absorbancias):

Entonces
(

Si la absorbancia es pequea, (A < 0.05) se pueden despreciar los trminos de


orden 2 y superiores, por tanto:

y la intensidad de fluorescencia aproximada;


(
El porcentaje de error que se comete:

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(
)

- Si la concentracin es 2.5x10-5 M:
que supera el valor de 0.05
(

- Si la concentracin es 2.5x10-6 M:

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Ejercicios (Unidad 2 Captulo 5)

1.

La forma reducida del dinucletido de nicotinamida y adenina (NADH) es


una coenzima importante y muy fluorescente. Tiene un mximo de
absorcin de 340 nm y un mximo de emisin a 465 nm. Las soluciones
patrn de esta sustancia generan las siguientes intensidades de
fluorescencia:

La ecuacin de calibracin de los anteriores datos, para hallar la


concentracin del NADH en funcin de las intensidades relativas es:
a.
b.
c.
d.

2.

Irel
Irel
Irel
Irel

=
=
=
=

19,45 cNADH
20,65 cNADH
22,35 cNADH
21,43 cNADH

+
+
+
+

2,8 x 10-4
6,1 x 10-4
3,6 x 10-4
2,5 x 10-4

De acuerdo con el enunciado del ejercicio 1. calcule la desviacin estndar


de la pendiente y la que corresponde a la regresin de la curva.
a.
b.
c.
d.

0,1747 y 0,2696
0,2134 y 0,2576
0,1853 y 0,2787
0,2046 y 0,2448

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3.

Con los datos consignados en la tabla del enunciado 1 desarrolle el


siguiente ejercicio: una solucin desconocida tiene una fluorescencia
relativa de 12,16. Cul ser su concentracin en NADH?
a.
b.
c.
d.

4.

0.614 M
0.454 M
0.735 M
0.544 M

En algunos mtodos fluorimtricos, el amortiguamiento de la fluorescencia


es proporcional a la concentracin de las especies deseadas, por ejemplo,
el metal X puede suponerse que amortigua la fluorescencia del ligando L.
En una serie de medidas se obtuvieron los siguientes datos:

La relacin molar del complejo formado entre X y L es:


a.
b.
c.
d.

6,42 x 10-34 M
3,46 x 10-34 M
2,36 x 10-34 M
5,63 x 10-34 M

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5.

A cuatro alcuotas de 10,0 mL de una muestra de agua se adicionaron 0.00,


1.00, 2.00 y 3.00 mL de una solucin estndar de NaF que contena 10.0
ppb de F- tal y como se muestra resumido en la tabla. Se adicionaron a
cada una 5.00 mL exactos de una solucin que contena un exceso de
complejo de Al con el rojo de Alizarina R, un complejo fuertemente
fluorescente, y las disoluciones se diluyeron a 50.0 mL. La intensidad de de
fluorescencia de las cuatro disoluciones y de un blanco fueron las
siguientes:

Las partes por billn (ppb) de F en la muestra son:


a. 0,361 ppb
b. 0,634 ppb
c. 0,381 ppb
d. 0,564 ppb

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CAPTULO 6: ANLISIS DE SUPERFICIES POR MTODOS


ESPECTROSCPICOS

Introduccin
Mediante ste captulo se pretende introducir al estudiante en una nueva rama de
la qumica analtica: la qumica analtica de superficies o anlisis de superficies. Su
presentacin como entidad propiamente dicha, ha surgido gracias a dos
eventualidades preponderantes: 1. El desarrollo de tecnologas cada vez ms
complejas ha permitido el diseo y utilizacin de instrumentos poderosos que
pueden revelar la estructura atmica y la composicin qumica de las superficies;
2. la informacin que se obtiene a partir de los anlisis de superficies e interfaces,
se ha constituido como una base potente para conocer procesos qumicos
fundamentales de gran importancia, tales como: corrosin, adsorcin,
quimisorcin, reactividad, oxidacin, pasivacin, o difusin entre otros, lo que ha
permitido avanzar enormemente en el desarrollo de otras ramas de la Ciencia y la
Tecnologa
(produccin
de
catalizadores,
semiconductores,
circuitos
microelectrnicos, polmeros, etc.).

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Leccin 25: Espectroscopia fotoelectrnica de rayos X (XPS)

6.25.1 Descripcin de la tcnica


La espectroscopia fotoelectrnica de rayos X (XPS), es el mtodo de
caracterizacin de superficies ms ampliamente utilizado hoy en da. La
popularidad de esta tcnica deriva del alto contenido de informacin que
suministra y la flexibilidad para ser utilizada en una gran variedad de muestras.

La tcnica XPS se cataloga dentro de las tcnicas analticas de espectroscopias


electrnicas, denominadas de este modo porque se miden electrones. El ms
bsico anlisis XPS de una superficie puede proporcionar informacin cualitativa y
cuantitativa de todos los elementos presentes, excepto H y He.

Figura 73. Equipo de espectroscopia fotoelectrnica de rayos X

Con aplicaciones ms sofisticadas de la tcnica se obtiene informacin detallada


de la qumica, organizacin y morfologa de la superficie. La gran potencia de esta
herramienta de trabajo se vislumbra en las siguientes aplicaciones, realizadas en
los primeros 10 nm de una superficie:

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6.25.2

Identificacin de todos los elementos presentes (excepto H, He) en


concentraciones mayores al 0.1%.
Determinacin semicuantitativa de la composicin elemental de la superficie
(error < 10 %).
Informacin acerca del entorno molecular: estado de oxidacin, tomos
enlazantes, orbitales moleculares, etc.
Informacin sobre estructuras aromticas o insaturadas a partir de las
transiciones * .
Informacin de grupos orgnicos utilizando reacciones de derivatizacin.
Perfiles de profundidad de 10 nm no-destructivos y destructivos de
profundidades de varios cientos de nanmetros.
Variaciones laterales en la composicin de la superficie.
Estudio sobre superficies hidratadas (congeladas).

Interaccin de la radiacin X sobre la materia.

Para conocer la tcnica XPS se ha de comprender el efecto fotoelctrico y de


fotoemisin. Cuando un fotn se encuentra con un tomo puede ocurrir:

que pueda atravesarlo sin interaccin alguna


que sea dispersado por un electrn de un orbital atmico con lo que ocurre
una prdida de energa.
que el fotn interaccione con electrn de un orbital atmico con una
transferencia total de la energa del fotn hacia el electrn, ocurriendo la
emisin del electrn del tomo.

El segundo proceso es conocido como Compton scattering y puede ser importante


en procesos de alta energa, mientras que el tercer proceso resulta ser bsico
para la tcnica XPS. Cuando ningn electrn ha sido emitido por el tomo, se
debe a que la frecuencia de excitacin del fotn es demasiado baja. Cuando
aumentamos gradualmente la energa del fotn se comienza a observar la
fotoemisin de electrones del tomo. Una vez superada la frecuencia umbral, el
nmero de electrones emitidos ser proporcional a la intensidad de iluminacin
(mayor nmero de fotones de alta frecuencia de excitacin).

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Figura 74. (Izquierda) Superficie irradiada con una fuente de fotones de alta
energa que provoca la emisin de electrones. (Derecha) El fotn imparte su
energa a un electrn de un nivel electrnico interior, y este es emitido

Por otra parte, la energa cintica de los electrones emitidos es linealmente


proporcional a la frecuencia de los fotones excitantes, si se utiliza fotones de
energa muy superior a la umbral; el exceso de energa es transmitido al electrn
que se emite. El proceso de fotoemisin resulta ser extremadamente rpido, 10 -16
s, y su fsica bsica se describe mediante la ecuacin de Einstein:

Ecuacin 2.21
Donde EB es la energa de enlace del electrn en el tomo, h es la energa de la
fuente de rayos X, y KE es la energa cintica del electrn detectado que es
medida por el espectrmetro del XPS.
Un electrn cargado negativamente se unir al tomo por atraccin con su ncleo
positivo. Cuanto ms interno es el electrn, ms fuerte ser su enlace. La energa
de enlace de un electrn variar segn el tipo de tomo (valor absoluto de su
carga nuclear) y de los tomos que a l se unan (los cuales pueden alterar la
distribucin electrnica). En el caso de los istopos, estos poseen distinto nmero
de neutrones pero igual carga nuclear, por tanto no vara la energa de enlace.
Las interacciones dbiles entre tomos, como fuerzas de cristalizacin o enlace de
hidrgeno, no alteran suficientemente la distribucin electrnica como para que se
pueda observar un cambio en la energa de enlace medible. La energa de enlace

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que se mide por XPS se asocia siempre a enlaces de tipo inico o covalente entre
tomos.
Para los gases, la energa de enlace de un electrn es igual a su energa de
ionizacin. En cambio, en los slidos existe una influencia por parte de la
superficie, y una energa adicional es necesaria para remover un electrn de la
misma, esta energa extra es denominada funcin de trabajo. Cuando un slido es
irradiado por rayos X, tambin puede ocurrir la emisin de electrones Auger. Estos
electrones se diferencian de los fotoelectrones, y se caracterizan porque su
energa es independiente de la energa de irradiacin.

6.25.3 Energa de enlace y ajuste qumico


La energa de enlace de un fotoelectrn emitido es simplemente la diferencia de
energa entre el electrn n-1 del estado final y el electrn n del estado inicial de
energa:
(

( )

Ecuacin 2.21

Si durante el proceso de fotoemisin no ocurre un reordenamiento de electrones


en el tomo o molcula, entonces la energa de enlace ser la igual al valor
negativo de la energa orbital, -k, para el electrn fotoemitido:
Ecuacin 2.22
Pero durante el proceso de fotoemisin otros electrones en la muestra no han de
permanecer imperturbables, sino que pueden responder a la creacin del hueco
electrnico mediante un reordenamiento de las capas internas, o minimizando la
energa del tomo ionizado.
La reduccin de energa que se produce de esta manera se conoce como energa
de relajacin, y ocurre tanto para electrones del tomo que contiene el hueco
electrnico (relajacin atmica), como para electrones de tomos vecinos
(relajacin extra-atmica). De este modo la energa de enlace queda definida:

( )

Ecuacin 2.23

El estado inicial de energa es el estado fundamental de energa del tomo antes


de ser sometido a un proceso de fotoemisin. El cambio de energa de enlace es
lo que se conoce como ajuste qumico, y en principio este ajuste qumico ser el

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mismo para todos los niveles electrnicos de un elemento. Los efectos de


relajacin (atmica y extra-atmica) pueden tener una significativa importancia en
la energa de enlace medida. En todos los casos, el reordenamiento de electrones
que ocurre durante el proceso de fotoemisin resulta en una disminucin de E B.
La mayora de las componentes de la relajacin atmica derivan del
reordenamiento de los electrones de las capas ms externas, los cuales poseen
una EB menor que el fotoelectrn emitido. Los electrones ms internos y con E B
mayor que la del electrn fotoemitido, realizan una pequea contribucin a la
energa de relajacin atmica y se puede considerar despreciable. La contribucin
de la relajacin extra-atmica depende del material que se est examinando. La
magnitud de reduccin de la EB por relajacin extra-atmica es superior en
muestras metlicas que en slidos inicos.

Figura 75. (a) Ajuste qumico para el orbital 1s del S vs estado de oxidacin en
especies inorgnicas. (b) Energa de enlace del orbital 2p del S vs carga calculada
en especies inorgnicas y orgnicas de azufre.

Otros tipos de efectos sobre el estado final de energa y que contribuyen a la E B


son el desdoblamiento en multipletes y la aparicin de picos satlites. El primero

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se origina por la interaccin del hueco electrnico con electrones desapareados de


orbitales ms externos, mientras que el segundo surge cuando el fotoelectrn
emitido pierde parte de su energa cintica para excitar a un electrn de valencia
hacia un orbital desocupado (transicin *).

6.25.3.1

Energa de enlace de referencia

Dado que la EB se determina midiendo la energa cintica del fotoelectrn emitido,


esto se ha de realizar de un modo riguroso, por lo que se requiere que el
espectrmetro XPS sea calibrado y referenciado.
Se utilizan metales conductores que son colocados en contacto con el
espectrmetro, unindose ambos, muestra e instrumento, a una toma de tierra.
Esta operacin coloca el nivel de Fermi (Ef), el nivel ms alto de energa ocupado,
de ambos al mismo nivel de energa.
La suma de la energa cintica y la de enlace no es igual a la energa de la
radiacin X. La diferencia es la funcin de trabajo del espectrmetro, sp. La
funcin de trabajo se relaciona con el nivel de Fermi y el nivel al vaco (E vac) en la
forma:
Ecuacin 2.24
La funcin de trabajo es la energa mnima requerida para impulsar un electrn
hacia el ms alto nivel ocupado en el vaco. De este modo EB queda:

Ecuacin 2.25
Se necesita medir la energa cintica y conocer la funcin de trabajo del
espectrmetro, siendo EBf la energa de enlace referenciada al nivel de Fermi.
Para muestras conductoras se ajusta el espectrmetro mediante el empleo de Au
estndar, conociendo que los valores de su energa de enlace son E f = 0.0 eV,
4f7/2 = 83.98 eV. Para conseguir una linealidad en la escala de la energa de
enlace se ajusta la diferencia de energa entre lneas bastante separadas de una
muestra, por ejemplo los picos 3s y 2p3/2 del Cu.
La calibracin se realiza por medidas reiteradas y al ultra alto vaco, que nos
asegure que las superficies de las muestras no tienen contaminacin alguna.

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Decir que la tcnica XPS es sensible a la superficie. Esto se debe a que los
electrones poseen menos habilidad para atravesar slidos que los rayos X. As,
una radiacin X de 1 KeV puede penetrar ms de 1000 nm en un slido, mientras
que electrones de esta energa slo penetran unos 10 nm. Por tanto los electrones
que son emitidos por los rayos X que han penetrado ms all de las primeras
capas de la superficie, no pueden escapar de la muestra y alcanzar el detector.

6.25.4 Caractersticas de los espectros


Para realizar el anlisis de un espectro de XPS se requiere conocer las
caractersticas del mismo. En un anlisis de XPS se ha de realizar un amplio
barrido del espectro, cubriendo un rango de unos 1000 eV, y posteriormente se ha
de mirar con ms detalle rangos ms pequeos, de unos 20 eV.
En el eje horizontal se muestran valores de energa de enlace. El eje vertical
representa la intensidad o cuentas medidas. Existe un aumento del ruido de fondo
cuando se incrementa la energa de enlace. Esto es debido a que despus de
cada fenmeno de fotoemisin, existe una seal acumulativa de ruido de fondo
asociada con fotoelectrones que han perdido energa debido a colisiones
inelsticas en el slido, pero que todava tienen energa suficiente para escapar.
Sobre el ruido de fondo de este espectro se observan: picos de fotoemisin
asociados con sucesos de fotoionizacin en niveles electrnicos del tomo, y
picos correspondientes a rayos-X inducidos por emisin de electrones Auger.
Las emisiones Auger tambin se suelen encontrar tabuladas. Adems se pueden
distinguir de las lneas de fotoemisin cambiando la fuente de rayos X, ya que la
energa cintica de las lneas Auger es la misma, mientras que las lneas de
fotoemisin varan con la energa de la radiacin X. Las lneas de poca intensidad
que aparecen a bajas energas de enlace, 0 30 eV, son originadas por la
fotoemisin de los electrones de valencia (orbitales ms externos).
Como regla general, un espectro XPS se estudia realizando espectros locales de
alta resolucin sobre cada una de las zonas caractersticas encontradas en un
primer espectro de barrido amplio, corroborando toda la informacin que sea
obtenida y procurando que no existan contradicciones. Los registros XPS aportan
gran informacin tanto en el anlisis de sistemas orgnicos como inorgnicos. En
estos ltimos suelen aparecer ms caractersticas sobresalientes en los espectros,
como es la aparicin de dobletes spin-orbital, desdoblamientos multipletes y
prdidas plasmn.

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Los anlisis cuantitativos se realizan mediante estudio de la relacin de reas


encerradas bajo cada pico para los diferentes elementos. Introduciendo los
apropiados factores de correccin se puede determinar el porcentaje de cada
elemento presente (siempre en los primeros 10 nm de la superficie y exceptuando
H y He). Para estos clculos se utiliza la ecuacin:
(

( )

( )

Ecuacin 2.25

Donde,
- Iij es el rea del pico j para el elemento i.
- K es una constante instrumental que contiene magnitudes como el flujo de rayos X, el
rea de muestra irradiada, y el ngulo slido de fotoelectrones aceptado por el
analizador.
- T(KE) es la funcin de transmisin del analizador, que incluye la eficiencia de
captacin de las lentes, y la energa de analizador y eficiencia del detector.
- Lij () representa el factor de asimetra angular para un orbital j de un elemento i. Tiene
en cuenta el tipo de orbital desde el cual un electrn es emitido, y el ngulo existente
entre la radiacin X incidente y los electrones fotoemitidos.
- ij, es la seccin transversal de fotoionizacin, e indica la probabilidad en que la
radiacin X crear un fotoelectrn a partir de un orbital j de un elemento i.
- ni (z) indica la concentracin de un elemento i a una distancia z por debajo de la
superficie.
-

(KE) es la longitud promedia de camino libre inelstico.

- es el ngulo que forman los fotoelectrones medidos respecto a la normal de la


superficie.
Para evaluar la validez de la ecuacin de cuantificacin se ha de trabajar con muestras
estndar, las cuales se caracterizan por tener una composicin conocida, ser
homogneas a diferente profundidad de capas, ser relativamente estables y estar libres
de contaminantes. Estos requisitos los cumplen los polmeros politetrafluoretileno
(PTFE) y polietilenglicol (PGE).

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Figura 76. Espectro XPS del poliuretano.

6.25.5

Instrumentacin

Los componentes primarios de un instrumento XPS son el sistema de vaco, la


fuente de rayos X, un analizador de energa del electrn y un sistema de datos.
La parte central del equipo lo constituye la cmara principal de vaco en la que la
muestra es analizada. La realizacin del experimento en condiciones de vaco se
debe a:

Los fotoelectrones han de viajar desde la muestra hasta el detector sin


colisionar con ninguna partcula de fase gaseosa
Algunos componentes tales como la fuente de rayos X requieren
condiciones de vaco para mantener la operatividad.
La composicin superficial de la muestra ha de permanecer invariable
durante el experimento.

Las muestras son introducidas en una primera cmara donde se procede a vaciar
la atmsfera existente y acercarse a un vaco de 10 -6 torr. Alcanzar el ultra-alto
vaco es una operacin lenta, cuya duracin oscila entre varios minutos y horas.
La colocacin de la muestra en el interior de la cmara se realiza mediante una
barra unida a un portamuestras. Dentro de la cmara principal, la muestra puede

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ser orientada en distintas posiciones y se puede elegir la zona de la superficie a


trabajar, todo ello es controlado mediante una cmara de vdeo.
La fuente de rayos X ms utilizadas son las que emplean nodos de Al o Mg, otros
nodos son Si, Zr, Ag, Ti, Cr. La radiacin X es monocromatizada antes de llegar a
la muestra mediante el uso de un cristal de cuarzo. Esto permite aprovechar el
rango de energa en que la intensidad de la radiacin X es mxima (normalmente
un ancho de 12 eV), evitar los picos satlites de fluorescencia de rayos X, e
impedir que electrones de alta energa provoquen golpes de calor a la muestra y la
degraden.
El rea de muestra que puede ser irradiada por los rayos X vara entre zonas
circulares de unos pocos centmetros de dimetro hasta unas 50 micras. Esta
focalizacin depende de la geometra de la fuente y del tipo de can de
electrones utilizado para estimular la emisin de rayos X.
La utilizacin de un monocromador disminuye la intensidad de rayos X que
alcanzan a la muestra. Esta disminucin en el flujo energtico es compensada en
el sistema analizador, constituido por lentes eficaces de captacin de radiacin, un
analizador de energa y un sistema detector multicanal.

6.25.6

Aplicaciones de la espectroscopia fotoelectrnica de rayos X

Una de las aplicaciones fundamentales del XPS es el estudio de las superficies.


Este estudio permite detectar los elementos presentes en la superficie,
cuantificarlos y en casos particulares con los estudios adecuados se puede
obtener los estados de oxidacin y entornos de coordinacin de los elementos
presentes en esas superficies. Dentro del estudio de superficies, la caracterizacin
de los catalizadores es de gran importancia. Por ej., en la figura X se representan
los espectros XPS del Ni metal y del NiO.

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Figura 77. Diagrama esquemtico de un espectrmetro XPS.

Es muy importante en los procesos de hidrogenacin de aceites insaturados para


obtener las grasas (p. ej. Margarinas) que se deposite nquel metal sobre el
soporte y que no se oxide a NiO que es inactivo. Se puede observar un
desplazamiento de las energas de ligadura que permite identificar la especie
superficial como Ni metal o como cationes Ni2+ en el xido. Esta tcnica permite
diagnosticar problemas puesto que el proceso de hidrogenacin puede ir mal
porque no se est impregnando el soporte correctamente con Ni.

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Figura 78. XPS (nivel 2p) de Ni y NiO.


Se pueden estudiar muchos otros tipos de materiales, p. ej., electrnicos. La
miniaturizacin de los componentes electrnicos es cada vez mayor y actualmente
se crecen, en algunos casos, capas de dimensiones nanomtricas que deben ser
caracterizadas convenientemente.

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Figura 79. Perfil de composicin atmica de un contacto Au/Cr/Si en funcin del


tiempo de bombardeo de Ar+.
En la fabricacin de componentes electrnicos hay que metalizar para mejorar los
contactos pero esto no siempre es posible. Metalizar con Au una superficie de Si
presenta problemas de interdifusin. Por ello se metaliza con capas Au/Cr sobre Si
que dan mejores prestaciones.
El perfil de composiciones que se obtiene por espectroscopia XPS de la muestra
bombardeada con Ar+ se da en la Figura 80. Con estos valores se puede estimar
los tamaos de las capas as como la posible difusin atmica en el proceso de
fabricacin de los contactos. Sin embargo, traducir los tiempos de bombardeo a
profundidad de superficie es una tarea muy difcil porque cada muestra responde
de forma particular y se necesitan muchas experiencias para poder dar nmeros
con fiabilidad. Pero una vez calibrada convenientemente, la tcnica es poderosa.

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Leccin 26: Microscopia Electrnica de Barrido (SEM)

La microscopa ha sido una de las herramientas bsicas para el establecimiento


de las bases de la biologa. La microscopa ptica tiene limitaciones de resolucin
debidas a aberraciones cromticas y a la configuracin de campo. La microscopa
electrnica ofrece la posibilidad de obtener mayor resolucin que la ptica adems
de disponer de herramientas complementarias derivadas de aspectos como la
posibilidad de obtener informacin ultramicroestructural o de obtener informacin
qumica mediante el anlisis de Rayos X.
El fundamento de la tcnica consiste en la posibilidad de extraer y acelerar
electrones mediante una fuente termoinica o de emisin de campo. Se buscan
materiales metlicos con una baja funcin de trabajo.
El SEM (del ingls Scanning Electron Microscopy) se introdujo en 1965. Desde el
punto de vista biolgico su principal ventaja es que permite obtener una imagen
tridimensional (hasta entonces los anlisis pticos se realizaban sobre secciones y
carecan por tanto de perspectiva). Adems del incremento de profundidad de
campo se obtiene simultneamente un notable aumento de la resolucin . = 1
nm

Figura 80. Bacterias vistas por un SEM.

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6.26.1

Antecedentes

Los primeros instrumentos desarrollados para este propsito, fueron microscopios


pticos, porque con el ojo humano es imposible visualizar. Estos instrumentos
fueron desde una simple lupa, hasta un microscopio compuesto. Sin embargo, an
en el mejor instrumento ptico, la resolucin est limitada a la longitud de onda de
la luz que se utilice, que en este caso es la luz violeta, cuya longitud de onda es de
aproximadamente 400 nanmetros; por lo tanto, los detalles ms pequeos que
pueden resolverse, debern estar separados no menos de esta longitud. En
trminos de amplificacin, esto quiere decir que no podemos amplificar ms de
1,000 veces.
Una salida inmediata a esta limitante de resolucin, es utilizar alguna radiacin de
longitud de onda ms corta que la de la luz violeta. Los candidatos inmediatos son
los rayos X, que se caracterizan por una longitud de onda del orden de 0.15
nanmetros; desafortunadamente stos tienen la gran desventaja de ser
absorbidos rpidamente por lentes de vidrio y de no poder ser desviados por
lentes magnticas.
Otra posibilidad es aprovechar el comportamiento ondulatorio de los electrones
acelerados por alguna diferencia de potencial. Sea el caso, por ejemplo, de
electrones acelerados en un campo de 100,000 voltios que presentan
comportamiento ondulatorio con una longitud de onda de 0.0037 nm, lo que en
principio permitira tener un aparato que resolviera detalles del mismo orden, lo
cual es ms de lo que se necesita para resolver detalles atmicos, puesto que los
tomos en un slido estn separados en un orden de 0.2 nm. Sin embargo, en la
prctica, detalles inherentes a la tcnica de observacin, o defectos en el
maquinado de las piezas polares producen aberraciones.

6.26.2

Funcionamiento

En el microscopio electrnico de barrido es necesario acelerar los electrones en


un campo elctrico, para aprovechar de esta manera su comportamiento
ondulatorio, lo cual se lleva a cabo en la columna del microscopio, donde se
aceleran por una diferencia de potencial de 1,000 a 30,000 voltios. Los electrones
acelerados por un voltaje pequeo son utilizados para muestras muy sensibles,
como podran ser las muestras biolgicas sin preparacin adicional, o muestras
muy aislantes. Los altos voltajes se utilizan para muestras metlicas, ya que stas
en general no sufren daos como las biolgicas, y de esta manera se aprovecha la
menor longitud de onda para tener una mejor resolucin. Los electrones

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acelerados salen del can, y son enfocados por la lente condensadora y objetiva,
cuya funcin es reducir la imagen del filamento, de manera que incida en la
muestra un haz de electrones lo ms pequeo posible (para as tener una mejor
resolucin). Con las bobinas deflectoras se barre este fino haz de electrones sobre
la muestra, punto por punto y lnea por lnea.
Cuando el haz incide sobre la muestra, se producen muchas interacciones entre
los electrones del mismo haz, y los tomos de la muestra; puede haber por
ejemplo, electrones rebotados como las bolas de billar. Por otra parte, la energa
que pierden los electrones al "Chocar" contra la muestra puede hacer que otros
electrones salgan despedidos (electrones secundarios), y producir rayos X,
electrones Auger, etc. El ms comn de stos es el que detecta electrones
secundarios, y es con el que se hacen la mayora de las imgenes de
microscopios de barrido.
Podemos tambin adquirir la seal de Rayos X que se produce cuando se
desprenden estos mismos de la muestra, y posteriormente hacer un anlisis
espectrogrfico de la composicin de la muestra.

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Leccin 27: Instrumentacin y aplicaciones de la microscopa SEM

Un SEM consta de una columna que integra un sistema de produccin de


electrones y una serie de lentes electromagnticas (condensador, barrido y
objetivo) que conforman un haz de electrones focalizado incidente sobre la
muestra. Los electrones incidentes inducen electrones secundarios y electrones
retrodispersados en la muestra. La topografa y composicin de la muestra
inducen un gradiente de emisin que es detectado por un sistema analizador
(Trampa de Faraday+placa fotogrfica o cmara CCD).

Figura 81. Instrumentacin de la Microscopa electrnica de barrido electrnico


La regin activada tiene forma de pera y solo los electrones ms superficiales
(secundarios) consiguen escapar de la muestra (la energa restante se disipa
mediante rayos X y un incremento de T). Los electrones retrodispersados son
mucho ms energticos y proceden de lugares ms profundos de la muestra.
Salvo excepciones, no son atrapados por la trampa de Faraday (no forman la
imagen).

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6.27.1

Formacin de la imagen

La trampa de Faraday atrapa electrones en sincrona con el barrido. Los


electrones escapan de la superficie en funcin de la topografa (escape favorecido
en las cumbres y absorcin en los valles) dando lugar al contraste.
La focalizacin del haz permite definir la resolucin y la profundidad de campo. El
voltaje de aceleracin de los electrones puede regularse para contrarrestar el
efecto del nmero atmico (Z) y optimizar la dimensin del volumen de excitacin.

Las aplicaciones del microscopio electrnico de barrido son muy variadas, y van
desde la industria petroqumica o la metalurgia hasta la medicina forense. Sus
anlisis proporcionan datos como textura, tamao y forma de la muestra. Entre las
reas de aplicacin de esta tcnica, se pueden mencionar:

6.27.2

Geologa

Investigaciones geomineras, cristalogrficas, mineralgicas y petrolgicas. Estudio


morfolgico y estructural de las muestras.

6.27.3

Estudio de materiales

Caracterizacin microestructural de materiales. Identificacin, anlisis de fases


cristalinas y transiciones de fases en diversos materiales tales como metales,
cermicos, materiales compuestos, semiconductores, polmeros y minerales.
Composicin de superficies y tamao de grano. Valoracin del deterioro de

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materiales, determinacin del grado de cristalinidad y presencia de defectos.


Identificacin del tipo de degradacin: fatiga, corrosin, fragilizacin, etc.

6.27.4

Metalurgia

Control de calidad y estudio de fatiga de materiales, caractersticas texturales.


Anlisis de fractura (fractomecnica) en materiales (Ver Figura 83), un ejemplo
concreto de este tipo de aplicacin se expone en la parte de trabajo prctico.

Figura 82. Imagen de la rotura de una varilla de acero obtenida mediante un


Microscopio Electrnico de Barrido.

6.27.5

Odontologa

En este campo son muchas las aplicaciones de las caracterizaciones morfolgicas


que se pueden realizar con el microscopio electrnico de barrido.
Una aplicacin especfica de este microscopio se obtiene al estudiar la
direccionalidad de las varillas del esmalte dental. El esmalte dental posee varias
fases de formacin, en las cuales se van depositando elementos minerales que
llegan al lugar por los vasos sanguneos circundantes, producindose la
mineralizacin total en la ltima fase de su formacin. En esta etapa se forman
cristales, que al depositarse toman una disposicin en todo el tejido formado,
creando las varillas del esmalte, estructura principalmente inorgnica (98%),
adquiriendo una disposicin muy particular de acuerdo al sector que se estudie de

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la pieza dentara. Estas varillas son observadas con un microscopio electrnico de


barrido, notando que estas se disponen en diferentes direcciones con un slo
sentido desde l limite amelodentinario a la superficie, entrecruzndose en las
cspides y en ciertos sectores de las caras libres y proximales, lo que se
denomina multidireccionalidad de las varillas. Para ello se extraen piezas
dentaras humanas (con indicacin quirrgica), las que son metalizadas con oropaladio y luego son estudiadas en el SEM. De este modo se puede observar la
disposicin de las varillas, analizar los cambios de direcciones en el espesor del
esmalte y comparar la disposicin en los distintos sectores del esmalte (oclusal,
1/3 medio y 1/3 cervical).
Adems se pueden analizar a travs del SEM las alteraciones que producen los
cidos producidos por la entrada de microorganismos y restos alimenticios en las
superficies vestibulares de los dientes anteriores, ya que sobre ellos se produce la
retencin de los materiales odontolgicos en fracturas, fisuras, ferulizaciones, etc.
La entrada de los microorganismos se produce, ya que para la retencin del
material de restauracin, desde los comienzos de la odontologa, se han realizado
tallados en forma de retencin mecnica en las piezas dentarias, formndose
estos en la interfase restauracin-diente.

6.27.6

Control de Calidad

En este campo, el microscopio electrnico de barrido es de gran utilidad para el


seguimiento morfolgico de procesos y su aplicacin en el control de calidad de
productos de uso y consumo.

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Leccin 28: Microscopia Electrnica de Transmisin (TEM)

El TEM (Transmission Electron Microscopy) se introdujo en sucesivas etapas


durante los aos 1930-1940. En esta configuracin los electrones atraviesan la
muestra, que debe ser lo ms delgada posible. Aunque la exposicin electrnica
es en principio destructiva de la materia orgnica, los sistemas criognicos
avanzados han permitido aprovechar las ventajas resolutivas del TEM en
estructuras biolgicas. = 0.05 nm.
El TEM es un instrumento que aprovecha los fenmenos fsico-atmicos que se
producen cuando un haz de electrones suficientemente acelerado colisiona con
una muestra delgada convenientemente preparada. Cuando los electrones
colisionan con la muestra, en funcin de su grosor y del tipo de tomos que la
forman, parte de ellos son dispersados selectivamente, es decir, hay una
gradacin entre los electrones que la atraviesan directamente y los que son
totalmente desviados. Todos ellos son conducidos y modulados por unas lentes
para formar una imagen final sobre una CCD que puede tener miles de aumentos
con una definicin inalcanzable para cualquier otro instrumento. La informacin
que se obtiene es una imagen con distintas intensidades de gris que se
corresponden al grado de dispersin de los electrones incidentes.
La imagen del TEM tal como se ha descrito ofrece informacin sobre la estructura
de la muestra, tanto si sta es amorfa o cristalina.

Figura 83. Microscopio electrnico de transmisin

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Adems, si la muestra es cristalina, es decir, hay una estructura de planos


peridica, puede ocurrir que varias familias de esos planos cumplan la condicin
de Bragg y difracten de forma coherente la onda electrnica incidente. Esto da
lugar a un diagrama de difraccin, que es una imagen de distintos puntos
ordenados respecto a un punto central (electrones transmitidos no desviados) que
nos aportan informacin sobre la orientacin y estructura del/los cristales
presentes.
Una muestra de la capacidad resolutiva viene dada por la capacidad de aumento
de la imagen.
Ecuacin 2.26

La profundidad de campo es suficientemente grande como para que la muestra


atravesada por los electrones se proyecte en la pantalla fluorescente o incluso en
una cmara CCD inferior.

Figura 84. Esquema instrumental de un TEM. Can y lentes electromagnticas


de condensador, objetivo y proyector.

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El microscopio TEM es un instrumento relativista. Los electrones son acelerados


en campos de hasta 500 kV. En esas condiciones el electrn se comporta
dualmente como onda y corpsculo con una relacin directa entre su momento y
su longitud de onda (DeBroglie).

Las limitaciones instrumentales hacen que en realidad la resolucin experimental


est limitada a 1 A aproximadamente.
El aspecto relevante de esta longitud de onda es que, como los Rayos X, permite
obtener informacin sobre la estructura de la materia, incluso a nivel atmico.

6.28.1

Instrumentacin

6.28.1.1

Can electrnico

El tipo ms usado de can electrnico consiste de un filamento de alambre de


tungsteno (10) doblado en forma de V. El electrodo de control se denomina cilindro
de Wehndt, y tiene una apertura circular de 1 a 3 mm de dimetro centrada en el
pice del filamento. La superficie cncava hace las funciones de nodo, y
utilizando una superficie convexa la imagen de la fuente electrnica puede
reducirse en tamao respecto al electrodo cncavo. La intensidad total del haz de
ctodo a nodo puede ser de 10 a 400 microamperios, pero solamente una
pequea fraccin die ste llega hasta la muestra.

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6.28.1.2

Condensadores

Los dos condensadores son capaces de dar una amplia gama de intensidad
ajustando el can electrnico. Esto reduce el rea iluminada en la muestra. Sin
embargo, otras partes de la muestra tambin sufren los efectos del haz
electrnico. El primer condensador reduce la imagen de la fuente mientras que el
segundo condensador obtiene la adecuada intensidad de iluminacin.

6.28.1.3

Plataforma para la colocacin de la muestra

La plataforma para colocar la muestra est situada en frente del objetivo. Se


introduce la muestra en la columna del microscopio a travs de una abertura.

6.28.1.4

Objetivo

El objetivo es la lente ms importante en el microscopio electrnico. La distancia


focal de esta lente est comprendida entre 1 y 5 milmetros, siendo 1,1mm la ms
frecuente. Cuanto menor es la distancia focal, mayor es la resolucin. Debido a
que el haz de imagen tiene la mxima apertura angular en el primer objetivo, esta
lente controla la calidad de la imagen producida. Se puede corregir la aberracin
esfrica usando un "stigmator", que es un dispositivo que permite introducir metal
para compensar la inhomogeneidad inherente de la lente, y obtener elevada
resolucin. Otro accesorio importante, permite regular la apertura del objetivo, la
cual limita la dispersin de los electrones, evitando as la degradacin de la
imagen. Esta apertura mejora el contraste siendo 20 y 40 micrmetros (pm) los
ms frecuentes.

6.28.1.5

Lente intermedia

La lente intermedia puede aumentar o disminuir la imagen. Se puede conseguir


esto, aumentando o disminuyendo la potencia de la corriente a esta lente.

6.28.1.6

Lente de proyeccin

La lente (de proyeccin corresponde al ocular del microscopio ptico. Su funcin


es la de proyectar la imagen real sobre la pantalla fluorescente, y permite una
amplia gama de aumentos. Se puede variar la ampliacin de 100 X hasta 300.000
X usando lentes intermedias y de proyeccin.

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6.28.1.7

Cmara de observacin

La cmara de observacin y la pantalla fluorescente estn situadas en el fondo de


la columna. La imagen se enfoca sobre un punto marcado y el enfoque fino se
consigue con unos binoculares de 6 y 20 X. El dimetro del punto de enfoque es
de 100 m, por lo tanto la imagen debe ser mayor que este dimetro para ser
resuelta. La cmara de observacin est protegida por un vidrio grueso de plomo
para evitar la emisin de rayos X.

6.28.1.8

Cmara fotogrfica

La cmara fotogrfica est situada debajo de la pantalla fluorescente. La pantalla


fluorescente est sujetada por m lado, y al quitar el paso del haz electrnico la
imagen se centra sobre la pelcula fotogrfica. Se pueden usar varios tipos de
pelculas y placas de vidrio.

6.28.2

Modos de formacin de la imagen

Existen diferentes modos de formacin de la imagen en un microscopio de


transmisin: si la imagen se forma a partir del haz transmitido, que no ha sufrido
dispersin, entonces la imagen del objeto es oscura sobre un fondo brillante. Si,
por el contrario, se utilizan los electrones dispersados en este caso la imagen
aparece brillante sobre un fondo oscuro. Por ello estas dos tcnicas se denominan
formacin de imagen en campo claro y en campo oscuro respectivamente, la
primera es la ms utilizada.

Figura 85. Formacin de la imagen.

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Por otra parte con este microscopio se puede obtener un diagrama de difraccin
de la muestra, lo que nos aporta una valiosa informacin sobre la estructura
cristalina de la misma. Esto es posible si hacemos incidir el haz de electrones
sobre un cristal con un ngulo capaz de satisfacer la ley de Bragg para una
determinada distancia entre planos atmicos dhkl. Ya que la longitud de onda de
los electrones es muy pequea ese ngulo tambin lo es por lo que el haz debe
incidir prcticamente paralelo a los planos reticulares. El diagrama de difraccin
est formado por los puntos de corte de los haces difractados y transmitido con el
plano de la pantalla. Representa, por tanto, la seccin de la red recproca del
cristal en el plano normal al haz de electrones.

Figura 86. Proceso de formacin del diagrama de difraccin

La posibilidad de combinar la difraccin de electrones con los distintos modos de


formacin de la imagen hace del microscopio de transmisin una de la mejores
herramientas en el estudio de la red cristalina y sus defectos.

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Leccin 29: Aplicaciones de la Microscopia Electrnica de Transmisin

Se utiliza fundamentalmente en dos campos: el de las Ciencias de Materiales en el


que analizan semiconductores, metales, aleaciones, aislantes, cermicas, etc. y
en el campo de la Biologa en el que se estudian bacterias, virus, macromolculas,
tejidos, etc.

6.29.1 Aplicaciones del TEM en Biologa


Se utiliza fundamentalmente en dos campos: el de las Ciencias de Materiales en el
que analizan semiconductores, metales, aleaciones, aislantes, cermicas, etc. y
en el campo de la Biologa en el que se estudian bacterias, virus, macromolculas,
tejidos, etc.

En cuanto a su aplicacin prctica, el microscopio electrnico de transmisin


representa una herramienta fundamental para el anlisis estructural de las clulas
eucariotas, que son aquellas que contienen el material hereditario fundamental y la
informacin gentica. Adems, la adaptacin de mtodos de deteccin de
protenas y de cidos nuclicos a la microscopia electrnica permite la localizacin
simultnea de diversos componentes moleculares.
Este equipo, de gran utilidad en la investigacin biomdica, utiliza un haz de
electrones para visualizar muestras biolgicas que precisan una preparacin
especial y cuenta con una cmara digital de alta resolucin para la adquisicin de
imgenes de gran calidad. Por este motivo, este microscopio electrnico de
transmisin se convierte en una herramienta imprescindible en muchos campos de
la biologa y la medicina para el estudio de la ultraestructura de las clulas y
tejidos. Adems de contribuir significativamente el estudio de la organizacin
estructural, molecular de las clulas y tejidos, la microscopia electrnica de
transmisin ha permitido avanzar en el anlisis de bacterias y virus.
TEM es un importante instrumento de diagnstico de enfermedades virales debido
a su rpido procesamiento. Uno de los principales beneficios es la identificacin de
virus gastrointestinales como adenovirus, calicivirus, astrovirus y coronavirus, as
como de otros virus para los cuales no se tiene disponibilidad de pruebas
diagnsticas comerciales o aquellos que no son cultivables. Por esta razn, la
deteccin de virus entricos mediante la TEM es esencial para realizar un
diagnstico epidemiolgico correcto de las infecciones gastrointestinales no

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bacterianas. En el campo de las patologas humanas, estos estudios tienen gran


valor en el diagnstico preciso de algunas enfermedades neuromusculares,
renales y pulmonares, y en la tipificacin de determinados virus patgenos.
Otras aplicaciones de la microscopia electrnica de transmisin estn
relacionadas con la biologa animal y vegetal, el estudio de la conformacin de
complejos macromoleculares y la investigacin de nuevos materiales.
Un ejemplo de otra aplicacin del TEM se puede observar en el siguiente grfico:

En ellas se muestran estructuras globulares de protena (B, C, D, E) del virus


herpes ORF6 y su autoorganizacin en filamentos helicoidales. (Soporte en la
replicacin del ADN y formacin de capside en el interior 300 nm de la clula
infectada).

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Ejercicios (Unidad 2 Captulo 6)

1.

2.

Los anlisis cuantitativos se realizan mediante estudio de la relacin de


reas encerradas bajo cada pico para los diferentes elementos. Cul es la
ecuacin correcta para determinar el porcentaje del elemento presente?
(

( )

( )

( )

( )

( )

( )

Cul de los siguientes componentes primarios NO hace parte de un


instrumento XPS?
a.
b.
c.
d.
e.

3.

Sistema de vaco,
La fuente de rayos X,
Analizador de energa del electrn
Monocromador
Sistema de datos.

La fuente de rayos X ms utilizados en los instrumentos XPS son las que


emplean nodos. Cul de stos nodos NO se emplean en dichos
instrumentos?
a.
b.
c.
d.
e.

Al
Mg
Ag
Na
Zr