PROYECTO DE TESIS

PALABRAS CLAVES: Levadura productora de etanol, fenotipo killer, neutro

y sensible.
I.

GENERALIDADES
1. TTULO
Fenotipo killer en levaduras productoras de etanol aisladas de chicha de
jora del distrito de Moche, regin La Libertad, Per.
2. PERSONAL INVESTIGADOR
2.1. Autor

: Br. Cristian Enrrique Polo Zavala.

Escuela

Acadmico

Profesional

de

Microbiologa

Parasitologa.
Facultad de Ciencias Biolgicas.
Universidad Nacional de Trujillo.

2.2. Asesora

: Dra. Eva Elizabeth Villanueva Tarazona.

Profesora Principal D.E.
Dpto. Acadmico de Microbiologa y Parasitologa.
Facultad de Ciencias Biolgicas.
Universidad Nacional de Trujillo.

3. TIPO DE INVESTIGACIN
3.1. De acuerdo a la orientacin: Bsica.
3.2. De acuerdo a la tcnica de contrastacin: Descriptiva.
4. RGIMEN DE INVESTIGACIN: Orientada.

5. INSTITUCIN A LA QUE PERTENECE EL PROYECTO

Universidad Nacional de Trujillo, Facultad de Ciencias Biolgicas, Departamento
Acadmico de Microbiologa y Parasitologa, Laboratorio de Microbiologa
Industrial.
6. LOCALIDAD E INSTITUCIN DONDE SE EJECUTAR EL PROYECTO
6.1. Localidad: Trujillo.
6.2. Institucin: Universidad Nacional de Trujillo, Facultad de Ciencias Biolgicas,
Departamento de Microbiologa y Parasitologa, Laboratorio de Microbiologa
Industrial.
7. TAREAS DEL EQUIPO DE INVESTIGACIN
-

Autor: Se encargar de la planificacin, implementacin y ejecucin del

proyecto. Realizar el anlisis de los datos correspondientes, as como la

bsqueda de informacin para redactar el informe final.

Asesora: Coordinar con el autor las acciones necesarias para llevar a cabo la
presente investigacin. Brindar las recomendaciones y directrices pertinentes
para la marcha adecuada del proyecto.

8. CRONOGRAMA

ETAPAS

TIEMPO (MESES)

a. Recoleccin de Datos

12

b. Anlisis de Resultados

c. Redaccin del Informe

TOTAL

18

9. FECHA DE INICIO Y TRMINO

9.1. Fecha de Inicio

: 27 de Febrero de 2009.

9.2. Fecha de Trmino : 6 de Agosto de 2010.

10. HORAS SEMANALES DEDICADAS AL PROYECTO
10.1.

Autor

: 15 horas.

10.2.

Asesora

: 2 horas.

11. RECURSOS DISPONIBLES

11.1.

Personal
-

Autor
Asesora
Tcnico de laboratorio
Personal de servicio

1
1
1
1

11.2. Equipos e instrumentos

11.2.1.

Equipos
-

11.2.2.

Autoclave Vertical
Balanza analtica AND
Cmara de Neubauer Ehartnack
Centrfuga Safeguard Centrifuge
Estufa Precisin Scientific C.O.
Horno Memmert
Microscopio binocular Micros Austria
Refrigeradora Electrolux

1 unidad
1 unidad
1 unidad
1 unidad
1 unidad
1 unidad
1 unidad
1 unidad

Instrumento
-

Micropipeta regulable de 1 - 100 L Brand

11.3. Materiales y reactivos

11.3.1. Material biolgico

1 unidad

Levaduras productoras de etanol

60 cultivos

11.3.2. Material de vidrio

-

Bagueta s/m
Baln de 1000 mL Duran
Beacker de 1000 mL Kimax
Lmina porta objeto Marienfeld
Laminilla cubre objeto Marienfeld
Matraz de 500 mL Boeco
Mechero s/m
Pipeta de 5 mL Marienfeld
Pipeta de 10 mL Marienfeld
Placa de Petri Pyrex
Set de coloracin Gram
Termmetro de -10 C a 110 C Boeco
Tubo de ensayo de 13 100 mm Pyrex
Vial s/m

1 unidad
1 unidad
1 unidad
30 unidades
30 unidades
2 unidades
2 unidades
1 unidad
2 unidades
30 unidades
1 unidad
1 unidad
50 unidades
200 unidades

11.4. Locales
-

Laboratorio de Microbiologa Industrial. Facultad de Ciencias Biolgicas.

Universidad Nacional de Trujillo.

12. RECURSOS NO DISPONIBLES Y PRESUPUESTO

CDIGO
5.3.11.20

5.3.11.22

NATURALEZA DEL GASTO

COSTO S/.

Viticos y asignaciones

240.00

Movilidad local

240.00

Vestuario

115.00

Guantes de ltex Top Glove 3 cajas

45.00

5.3.11.30

Mandil 2 unidades

50.00

Mascarillas Hecos 2 cajas

20.00

Material de consumo

2145.00

Material biolgico

1436.40

S. cerevisiae killer CECT 1 cultivo

718.20

S. cerevisiae sensible CECT 1 cultivo

718.20

Componentes de medios de cultivo y reactivos

451.50

Agar Sabouraud Merck 500 g.

220.00

Agua destilada 10 L.

10.00

Alcohol yodado Aky 3 L.

16.50

Azul de metileno Merck 25 g.

190.00

Etanol de 96 Aky 3 L.

15.00

Material de Escritorio

23.00

Cinta adhesiva Masking Tape 2 unidades

4.00

Papel bond A4 75g. Report 500 unidades

13.00

Plumn tinta indeleble Faber Castell 2

6.00

unidades

Material de limpieza

59.60

Bolsas desechables 50 unidades

25.00

Detergente Opal de 360 g. 3 unidades

6.60

Escobilla para lavar tubos 3 unidades

6.00

Franela 1 metro

5.00

Hipoclorito de sodio Clorox 2 L.

10.00

Jabn carblico Ronalds 2 unidades

7.00

Otros

174.50

Algodn hidroflico Coppon 1Lb.

13.00

Cinta de pH universal Albet 2 cajas

90.00

Encendedor 2 unidades

2.00

Mango y asa bacteriolgica 2 unidades

14.00

Pabilo 1 cono

6.00

Puntas para micropipetas Citoglas 500

45.00

unidades
Ron de quemar 3 L.

5.3.11.39

4.50

Otros servicios de terceros: Personas naturales

Anillado 4 ejemplares

5.3.11.51

173.00
8.00

Encuadernacin 7 ejemplares

105.00

Fotocopiado 300 pginas

30.00

Tipeo e impresin en computadora 600 pginas

30.00

Equipamiento y material duradero

20.00

Cocina elctrica s/m

20.00

RESUMEN DEL PRESUPUESTO:

CDIGO

NATURALEZA DEL GASTO

COSTO S/.

5.3.11.20

Viticos y asignaciones

240.00

5.3.11.22

Vestuario

115.00

5.3.11.30

Material de consumo

2145.00

5.3.11.39

Otros servicios de terceros: Personas naturales

173.00

5.3.11.51

Equipamiento y material duradero

20.00

TOTAL

2693.00

13. FINANCIACIN
13.1.

Recursos disponibles: Laboratorio de Microbiologa Industrial.

13.2.

Recursos no disponibles: Autofinanciado.

II.

PLAN DE INVESTIGACIN
1. REALIDAD PROBLEMTICA
Las levaduras se hallan ampliamente distribuidas en el medio ambiente, en el
suelo de los viedos, sobre la piel de algunas frutas, en la superficie de los vegetales,
en el aparato digestivo de los animales, etc (Lee, 2000). La microflora natural de los
frutos ricos en azcares fermentables est compuesta fundamentalmente por mohos
y en menor nmero bacterias y levaduras, y vara con el clima y tipo de suelo; hay
una gran variabilidad de los tipos microbianos encontrados en la flora natural de los
frutos procedente de una regin a otra (Bourgeois y Larpent, 1995).
Las levaduras son microorganismos fascinantes, porque sus actividades
dinmicas y diversas afectan a muchas reas de la ciencia y la tecnologa. Algunas
especies juegan un rol benfico en la produccin de alimentos, bebidas y frmacos,
no obstante, otras son nocivas y pueden ocasionar importantes prdidas econmicas
en la industria o ser causantes de enfermedades en el hombre (Buscott et al., 1996;
Deak y Beuchat, 1996; Kurtzman y Mannarelli, 1998; Loureiro y Querol, 1999;
Loureiro y Malfeito Ferreira, 2003).
La chicha de jora, es un producto oriundo del Per, que se elabora
artesanalmente y se consume adems en otros pases de Amrica del Sur,
constituyendo un producto potencialmente industrializable. Se denomina chicha de
8

jora, a la bebida alcohlica obtenida por fermentacin de la materia azucarada

contenida en el mosto de malta de maz (Velsquez, 1979).
La transformacin del mosto es consecuencia de un complejo conjunto de
reacciones bioqumicas, producidas por distintas especies de levaduras y bacterias
lcticas. Las levaduras son responsables de la biotransformacin de los azcares,
principalmente glucosa y fructosa, en alcohol y CO 2 (Pretorius, 2000). Desde
Pasteur hasta la fecha se han realizado muchos estudios sobre fermentacin
alcohlica; sin embargo, debido a su complejidad es un proceso an no entendido
completamente (Ribreau-Gayon et al., 1975; Lafon-Lafourcade, 1983).

Sobre el origen de las levaduras existen dos teoras. La primera sostiene que
los frutos daados sirven de "depsito" para microorganismos, entre los que se
incluye Saccharomyces cerevisiae, y que por tanto, desarrollan en las
fermentaciones espontneas (Mortimer y Polsinelli, 1999). La segunda teora afirma
que proceden de las bombas, tuberas, depsitos de fermentacin etc. de la bodega;
aunque no se descarta una presencia minoritaria de S. cerevisiae en los frutos
(Martini, 1993; Fleet y Heard, 1993; Vaughan-Martini y Martini, 1995).
Las fermentaciones espontneas son aqullas que se producen de forma
natural, es decir, las realizan las levaduras provenientes de los frutos y del material
de bodega, sin inoculacin externa. Esto hace que las fermentaciones espontneas
no sean producto de la accin de una nica especie o cepa de levadura, sino una
sucesin de especies y cepas de levaduras diferentes a lo largo del proceso (Kunkee
y Amerine, 1970; Ribreau-Gayon et al., 1975; Lafon-Lafourcade, 1983;
Zambonelli, 1988).
As, en los primeros das de fermentacin, los gneros mayoritarios son
Hanseniaspora/Kloeckera, Candida y en menor medida Hansenula, Pichia,
Rhodotorula y Metschnikowia (Querol et al., 1990; Longo et al., 1991; Fleet y
Heard, 1993; Schtz y Gafner, 1994). Despus de los 2 3 primeros das, estos
gneros reducen su nmero, dando paso al crecimiento de otras especies ms
tolerantes al etanol como Saccharomyces; controlando finalmente la fermentacin
9

S. cerevisiae; como resultado de una seleccin natural (Frezier y Dubourdieu, 1992;

Vezinhet et al., 1992; Fleet y Heard, 1993; Versavaud et al., 1993).
Durante la seleccin natural en una fermentacin espontnea, se generan
interacciones levadura-levadura de tipo antagnico; esa interaccin denominada
fenmeno killer fue descubierto en 1963 por Bevan y Makower (Radler, 1980;
Shimizu, 1993; Nguyen y Panon, 1998). Implica la secrecin por parte de ciertas
levaduras de una protena txica de bajo peso molecular denominada toxina killer
(Wickner, 1996; Woods y Bevan, 1968). Este fenmeno ha sido observado en
Saccharomyces, Debaryomyces, Pichia, Zygosaccharomyces, Hanseniaspora,
Candida y Cryptococcus (Fleet, 1997). La distribucin del fenotipo killer vara en
funcin de la zona y su frecuencia de aislamiento es relativamente baja (Angulo et
al., 1993; Hidalgo y Flores, 1994).
Las levaduras que producen la toxina killer son inmunes a dicha toxina,
pero tienen la capacidad de ser letales para las clulas denominadas sensibles, las
cuales pueden ser del mismo o de diferente gnero; existen adems cepas neutras
que no producen dicha toxina ni son sensibles a ella (Woods y Bevan, 1968;
Wickner, 1996; Epifanio, 2005). Existen por lo tanto, tres fenotipos killer: killer
(K+R+), sensible (K-R-) y neutro (K-R+) (Epifanio, 2005).
La capacidad de producir la toxina killer por especies del gnero
Saccharomyces como de resistir a su accin, est asociada a la presencia de
partculas vricas citoplasmticas virus like particle (VLP) y algunos genes
nucleares (Tipper y Bostian, 1984; Reyes et al., 1999). Estas VLP estn formadas
por dos cadenas de ARN de doble hlice, L y M, siendo esta ltima la que
codifica la toxina y el factor inmune de autoresistencia a la misma (Pretorius y Van
der Westhuizen, 1991; Barre, 1992). La naturaleza de esta toxina permite distinguir
cinco tipos de actividad killer entre las cepas de esta especie: K1, K2, K3, KT28 y
K3 (Shimizu, 1993).
As tambin se han encontrado al menos tres grupos de actividad (K1, K2 y
K3) y cinco de resistencia (Young, 1987). Sin embargo, los grupos ms estudiados
son el K1 y K2. El pH ptimo para la produccin de la toxina K1 se encuentra entre
4,6 y 4,8 (Woods y Bevan, 1968). Por el contrario, el rango de pH para el grupo de
10

actividad K2 se encuentra entre 2,9 y 4,9 (Shimizu et al., 1985). En chicha de jora
los valores de pH encontrados fluctan entre 3,5 y 5,4 , siendo en su mayora
inferiores a 3,9 (Manrique, 1978).
En Saccharomyces cerevisiae las VLP se transmiten a las clulas hijas
mediante mecanismos distintos de los descritos por la gentica clsica
(heredabilidad citoplasmtica). La persistencia de estas partculas vricas en las
clulas es asintomtica, en contraste con algunos virus fngicos que se asocian con
efectos adversos en su portador. Estos tipos de partculas vricas son consideradas no
infectivas, ya que no se ha identificado, hasta el momento, ningn tipo de va de
transmisin extracelular (Schmitt y Breinig, 2002).

Existen otras especies portadoras del carcter killer en los cuales los
determinantes genticos para la toxina difieren del descrito para S. cerevisiae. En el
caso de Kluyveromyces lactis son plsmidos constituidos por DNA, mientras que en
Hanseniaspora uvarum, la protena txica est codificada a nivel cromosomal
(Wickner, 1996).
En Latinoamrica, se han hecho revelamientos de flora killer en bodegas
de Brasil, Uruguay y Argentina. En este ltimo pas, tras el anlisis de las levaduras
aisladas de mostos en distintos estados de fermentacin procedentes de bodegas de
las provincias de Salta, La Rioja, San Juan y Mendoza, el fenmeno killer mostr
una distribucin heterognea. Desde su total ausencia en la provincia de Salta hasta
un 33.34% de cepas killer aisladas en bodegas de la provincia de San Juan, a
partir de mostos que no haban sido sembrados con levaduras seleccionadas
(Vazquez y Toro, 1994).
Desde el punto de vista industrial, si una cepa killer posee buenas
caractersticas de fermentacin, esta propiedad en s es favorable. Por el contrario, si
una cepa killer posee propiedades no deseables puede originar dificultades en el
proceso de fermentacin, aun si ste ha sido sembrado con cepas seleccionadas
(Castellanos et al., 2008).

11

Independientemente del gnero al cual pertenezcan, las cepas salvajes de

levadura killer pueden interferir en la fermentacin y subsecuentemente en la
calidad del producto. Su multiplicacin y actividad pueden potencialmente retardar
el inicio de una fermentacin o dar un producto con niveles altos de acetaldehdo,
cido lctico, cido actico u otras caractersticas sensoriales no deseadas (Bisson,
1999).
A partir del descubrimiento de cepas killer de S. cerevisiae en bodegas y
viedos europeos, se estimul el inters en develar el significado y alcances de esta
propiedad en la industria vitivincola. As, las levaduras killer con buenas
caractersticas de fermentacin han sido seleccionadas para la fermentacin de la
cerveza, vino o sake, y por lo tanto, pueden usarse como cultivos iniciadores en la
industria del vino y prevenir el desarrollo de levaduras salvajes sensibles (Hara et
al., 1980 y 1981; Seki et al., 1985; Longo et al., 1990; Van Vuuren y Jacobs, 1992).
Una cepa killer correctamente seleccionada ofrece las ventajas adicionales,
en comparacin con las cepas convencionales, de matar determinado tipo de cepas
nativas que producen efectos negativos en el proceso fermentativo; y de resultar
inmune a las toxinas killer producidas por cepas nativas, garantizando su
dominancia en la fermentacin y protegiendo al producto de contaminantes
(Sangorrn et al., 2002), eliminando de este modo las cepas sensibles en el
transcurso de la fermentacin (Coratza et al., 1992; Perez et al., 1995).
Estas ventajas han permitido que, en los programas de seleccin de
levaduras, el fenotipo killer se considere un criterio imprescindible para asegurar
el xito de la inoculacin (Van Vuuren y Jacobs; 1992), principalmente en aquellas
regiones donde este fenotipo se encuentra extendido entre las levaduras autctonas
(Hidalgo y Flores, 1994; Perez et al., 1995).
Debido a que en el Per no existen estudios publicados sobre la distribucin
del fenotipo killer en levaduras aisladas de chicha de jora,

la presente

investigacin se enfoca en solucionar esta falta de conocimiento hallando el

porcentaje del fenotipo killer en levaduras productoras de etanol aisladas de
chicha de jora del distrito de Moche, regin La Libertad, Per. Esto permitir
valorar la importancia del fenotipo killer como una caracterstica adicional para
12

los programas de seleccin de levaduras productoras de etanol como es el caso de

Saccharomyces cerevisiae.

2. PROBLEMA
Cul es el porcentaje del fenotipo killer en 60 cultivos de levaduras productoras
de etanol aisladas de chicha de jora del distrito de Moche, regin La Libertad, Per
durante al ao 2009 - 2010?
3. HIPTESIS
Implcita.
4. OBJETIVO
-

El objetivo de la presente investigacin es conocer el porcentaje del

fenotipo killer en 60 cultivos de levaduras productoras de etanol aisladas de
chicha de jora del distrito de Moche, regin La Libertad, Per.

5. DISEO DE EXPERIENCIAS
5.1. Universo muestral
Cultivos de levaduras productoras de etanol aisladas de chicha de jora del
distrito de Moche, regin La Libertad, Per durante el ao 2009 - 2010.
13

5.2. Muestra poblacional

Cultivos de levaduras productoras de etanol aisladas de chicha de jora del
distrito de Moche, regin La Libertad, Per y proporcionados por el Laboratorio
de Microbiologa Industrial de la Facultad de Ciencias Biolgicas de la
Universidad Nacional de Trujillo.
5.3. Muestra
60 cultivos de levaduras productoras de etanol aisladas de chicha de jora del
distrito de Moche, regin La Libertad, Per y proporcionados por el Laboratorio
de Microbiologa Industrial de la Facultad de Ciencias Biolgicas de la
Universidad Nacional de Trujillo.

5.4. Unidad de muestra

Una asada de cada uno de los 60 cultivos de levaduras productoras de etanol
aisladas de chicha de jora del distrito de Moche, regin La Libertad, Per y
proporcionados por el Laboratorio de Microbiologa Industrial de la Facultad de
Ciencias Biolgicas de la Universidad Nacional de Trujillo.
5.5. Diseo de contrastacin
5.5.1. Material biolgico
Se emplearn 60 cultivos de levaduras productoras de etanol aisladas de
chicha de jora del distrito de Moche, regin La Libertad, Per y
proporcionados por el Laboratorio de Microbiologa Industrial de la
Facultad de Ciencias Biolgicas de la Universidad Nacional de Trujillo.
5.5.2.

Medios de cultivo empleados en la reactivacin, evaluacin de

la pureza y el desarrollo de las levaduras (Anexo 1)

-

Agar Extracto de Malta (AEM).

Agar Sabouraud (AS).

14

Caldo Yeast Peptone Dextrose (YPD).

Agar YPD-MB tamponado a pH 4,2 con buffer citrato-fosfato.

5.5.3.

Reactivacin y evaluacin de la pureza de los cultivos de

levadura
A partir de los cultivos de levadura conservados en AS, se sembrarn en
tubos conteniendo AEM; luego sern incubados entre 20 C a 22 C por
24 a 48 horas, cumplido el tiempo de incubacin, se harn coloraciones
Gram para determinar su pureza. Los cultivos puros sern conservados en
refrigeracin y los que estuviesen contaminados sern sometidos a
purificacin mediante diluciones en agua destilada y siembra en AS.

5.5.4.

Deteccin de actividad killer, neutra sensible

Para evaluar el fenotipo killer de las levaduras productoras de etanol,

estas sern sembradas por estra en placas conteniendo agar YPD-MB,
tamponado con buffer citrato-fosfato a pH 4,2 y se incubarn por 10 das
a 22 C. Luego se sembrar junto a las estras anteriores el cultivo
Saccharomyces cerevisiae CECT 1443 con fenotipo sensible y se
incubar por 48 horas a 22 C. Las levaduras que inhiban el crecimiento
del cultivo CECT 1443 sern consideradas con fenotipo killer.
Para evaluar el fenotipo neutro sensible se sembrar por estra el
cultivo Saccharomyces cerevisiae CECT 1387 con fenotipo killer en
placas conteniendo agar YPD-MB, tamponado con buffer citrato- fosfato
a pH 4,2 y se incubarn por 10 das a 22 C. Luego se sembrarn junto a
dichas estras las levaduras productoras de etanol que no inhibieron el
crecimiento del cultivo CECT 1443 en la evaluacin del fenotipo killer
y se incubar por 48 horas a 22 C. Las levaduras que desarrollen sern

15

consideradas con fenotipo neutro y las que no desarrollen sern

consideradas con fenotipo sensible.
5.5.5.

Anlisis de resultados

El anlisis estadstico de los distintos fenotipos respecto al carcter

killer en los 60 cultivos de levaduras productoras de etanol evaluadas,
se realizar mediante la prueba Ji-Cuadrado usando el programa
estadstico SPSS versin 15.0 para Windows.

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21

ANEXOS

Anexo 1. Medios de cultivo empleados en la reactivacin, evaluacin de la pureza y

el desarrollo de las levaduras.
Agar Extracto de Malta (AEM).

Componentes

Cantidad

Extracto de malta

35 g.

Agar

20 g.

Agua destilada

1000 mL.

pH final 5.6 0.2

22

Autoclavar durante 15 min a 121 C y 15 lb/in2 de presin.

Agar Sabouraud (AS).

Componentes

Cantidad

Glucosa

40 g.

Mezcla de peptonas

10 g.

Agar

15 g.

Agua destilada

1000 mL.

pH final 5.6 0.2

Autoclavar durante 15 min a 121 C y 15 lb/in2 de presin.

Componentes

Cantidad

Extracto de levadura

10 g.

Peptona

20 g.

Dextrosa

20 g.

Agua destilada

pH final 4.2 0.2

1000 mL.

23

Autoclavar durante 15 min a 121 C y 15 lb/in2 de presin.

Caldo
Peptone
Dextrose
(YPD).

Yeast

Agar YPD-MB.

Componentes

Cantidad

Extracto de levadura

10 g.

Peptona

20 g.

Glucosa

20 g.

Agar

20 g.

Azul de metileno

0.03 g.

Agua destilada

1000 mL.

pH final 4.2 0.2

Autoclavar durante 15 min a 121 C y 15 lb/in2 de presin.
Solucin tampn.

Componentes

Cantidad

cido ctrico

21 g.

K2PO4

28 g.

Agua destilada

100 mL.

24

pH final 4.5 0.2

Ajustar el pH con cido fosfrico.

25