MICROBIOLOGIA

Estudio de microorganismos

Donde pueden son utilizados los microorganismos?

Investigacin

Biotecnologa.

Sanitario

Medicina, farmacia, veterinaria.

Medio ambiente

Control de plagas, depuracin,

eliminacin de contaminantes.

Industria

Alimentaria, qumica.

Energtico

Fabricacin de combustibles,
biopilas.

Microorganismos con utilidad sanitaria:

Medicina, farmacia, veterinaria.
Produccin de ANTIBIOTICOS: sustancias qumicas fabricadas
por microorganismos que inhiben el crecimiento o matan a otros
microorganismos.

Produccin de ESTEROIDES: molculas fabricadas

mediante

bioconversin que forman parte de medicamentos.

Produccin de VACUNAS: producidas a partir de bacterias o

virus, atenuadas, inactivas o avirulentas.

Microorganismos con utilidad industrial:

Alimentaria, qumica.
Microorganismos con
utilidad en el medio
ambiente:
Biocontrol, depuracin.

Microorganismos con
utilidad energtica:
Biocombustibles, biopilas.

BIOTECNOLOGIA

Qu es la Biotecnologa?
La biotecnologa es una rama de la tecnologa
que

se

basa

en

la

aplicacin

prctica

de

microorganismos vivos, o de compuestos obtenidos

de organismos vivos para obtener productos

orientados a las necesidades humanas.

Uso prctico de los sistemas biolgicos para

producir bienes y servicios

Biotecnologa tradicional

PROCESOS?

MICROORGANISMOS?

Busca la manera de mejorar el rendimiento a partir de la seleccin de

organismos y de los medios de produccin. Histricamente, biotecnologa
implicaba el uso de organismos para realizar una tarea o funcin til para el

hombre.
Cruzamiento selectivo

Biotecnologa actual

PROCESOS!!!

MICROORGANISMOS!!!

Busca la manera de mejorar el rendimiento a partir de

tcnicas de ingeniera gentica.

Biotecnologa tradicional Biotecnologa moderna

Organismos genticamente modificados

Es aquella planta, animal, hongo o bacteria a la que se le ha agregado por
ingeniera gentica uno o unos pocos genes con el fin de producir
protenas de inters industrial o bien mejorar ciertos rasgos, como la
resistencia a plagas, la calidad nutricional, la tolerancia a heladas, entre
otras caractersticas.

Ingeniera gentica o transgnesis

Conjunto de tcnicas que permiten aislar genes y transferirlos de

un organismo a otro (metodologa del ADN recombinante).

CLONADO
- Conocer su secuencia
- Producir una protena recombinante
- Producir plsmidos recombinantes

EXPRESIN DE PROTENAS
-Incorporar el gen de inters en el vector.
- Introduccin del vector dentro del sistema de
expresin.
- Examinar o evaluar la presencia de cepas
recombinantes.

Construccin del vector:

Promotor

Marcador de
seleccin

Sitio de
mltiple
clonado

Terminador

Origen de
replicacin

Protenas recombinantes (PR):

Es el producto generado a partir del diseo de un
vector que posee el gen de inters. Este producto
puede ser expresado en un sistema distinto o no al
de origen del gen.
Aplicacin

Condiciona todas las decisiones futuras

Estudios de estructura y funcin

Ensayos de actividad in vitro
Ags para generacin de Acs. Terapia gnica
Estudios in vivo

Expresin de Protenas recombinantes:

Sistemas de expresin
Su eleccin depender de las caractersticas de la PR:

Utilidad: investigacin, diagnstico, farmacutico, terapia.

Rendimiento
Pureza, estabilidad
Complejidad de la molcula: conformacin, masa, puentes
S-S, modificaciones post-traduccionales
Destino de la protena expresada
Purificacin

Expresin de Protenas recombinantes:

Sistemas de expresin

Sistemas de cultivo:
BATCH
BATCH ALIMENTADO

CULTIVO CONTINUO

A gran escala

Sistemas de expresin:
Bacterias (Escherichia coli)
Levaduras (Saccharomices cerevisiae, Pichia
pastoris)
Baculovirus/clulas de insectos
Clulas de plantas
Clulas de mamferos

Sistema de Expresin: Bacterias

Flagelo
Membrana
celular

Espacio
periplsmico
Ribosoma

ADN

VECTOR

Pasemos a un concreto ejemplo de aplicacin

biotecnolgica

1- Endo--glucanasas (EGs)

2- Celobiohidrolasas (CBHs)

3- glucosidasas (BGLs)

Entoncesque debo hacer ahora??

Seleccionar los microorganismos de inters
Seleccionar que enzimas me interesara evaluar su secrecin
Seleccionar mtodo de deteccin enzimtica

Czapeck modificado
Cepas elegidas al azar

pH 3,5

pH 4,5

pH 5,5
Tiempo de
Incubacin

Temperatura
de Incubacin
pH 3,5
PDA 3,95% (p/v)

pH 4,5

pH 5,5

28 1C con
luz continua

Mandels modificado I

Rojo Congo
0,1% 15

5 das
7 das

- Evaluacin cualitativa de la capacidad de producir y secretar

celulasas en cepas de Trichoderma, nativas de Misiones.

Actividad enzimtica celuloltica de 28 cepas de Trichoderma en medio slido reveladas con rojo Congo al 0,1%,
durante 15 minutos.

- Evaluacin cuantitativa de la capacidad de producir y secretar

celulasas en cepas de Trichoderma nativas de Misiones.
Cepas seleccionadas del
screening cualitativo
Suspensin de esporas
(107 esporas/mL )

Temperatura de
incubacin:
28 1C con
luz continua

Mandels modificado II
PDA 3,95% (p/v)

Tiempo de
Incubacin

Da 1 Da 2 Da 3 Da 4 Da 5

Determinacin enzimtica

- Evaluacin cuantitativa de la capacidad de producir y secretar

celulasas en cepas de Trichoderma nativas de Misiones.

41,6 5,2 U/L

42,7 1,1 U/L

42,5 2,8 U/L

35,9 2,3 U/L

Otros ejemplos de enzimas:

Hongos pluriceculares
Peniophora Ganoderma Pycnophorus Trichoderma Trametes
Produccin de: celulasas, ligninasas, xilanasas.

Hongos pluriceculares
Beauveria, Metarhizium, Paecilomyces, Penicillium
Produccin de: enzimas quitinasas y proteasas,
glucosa oxidasa

Hongos pluriceculares
Aspergillus
Produccin de: pectinasas, proteasas, celulasas, lipasas

Hongos pluriceculares
Mucor
Produccin de: reninas.

Hongos unicelulares

Sacharomyces
Produccin de: glicosidasas (amilasas y maltasas), invertasa.

Bacterias
Kluyveromyces
Produccin de: lactasa.

Bacterias
Bacillus
Produccin de: proteasas.

Bacterias
Thermus
Produccin de: taq polimerasa (PCR)

BIOINFORMTICA:
Es un campo que se ocupa de los problemas biolgicos, utilizando como

medio tcnicas computacionales.

Analiza principalmente reas como la genmica funcional, genmica
estructural y la protemica (propio de las protenas).

Cmo obtengo una secuencia?

Micelio en medio
lquido YES

LAVADOS
Tris/HCL +
EDTA

1ro-. Extraccin de ADN genmico

SN EXTRACCIN

BAO SECO

1ra PURIFICACIN

Tris-HCL, NaCl,
EDTA,Proteinasa K,
mercaptoetanol, SDS.

+ VORTEX

Cloroformo + alcohol isoamlico

SECADO A T
AMBIENTE

RESUSPENDER EN AGUA DEST.

ALMACENAR A -20C

PRECIPITACIN ADN
Isopropanol

2da PURIFICACIN
Acetato de potasio

2do-. Corroborar en gel de agarosa al 1%

Cmo obtengo una secuencia?

3ro-. Amplificacin por PCR

4to-. Corroborar en gel de agarosa al 2%

Cmo obtengo una secuencia?

5to-. Enviar a secuenciar.

Producto de PCR

6to-. Obtencin de la secuencia.

Anlisis de la secuencia
1ro-. Transformo mi secuencia a Formato FASTA
>S1.4 ITS1
GAACGTTACCNAACTGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGNNNNNNNN
NCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACCAAAACTCTTATTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTTATAATCTGAGC
CTTCTCGGCGCCTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAA
GAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCG
CCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCG
GCCCTGCCTTGGCGGTGGCCGTCTCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCANCCTCTCCTGCGCAGTANTTTGCACACT
CGCATCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCANGTAGGAATACC
CGCTGAACTTAAGCATATCA

>
2do-. Analizo mi secuencia con las bases de datos existentes
NCBI: National Center for Biotechnology Information
TrichOKEY: Especifico para gnero Trichoderma o Hypocrea

Formato FASTA

Contrastacin con las secuencias disponibles en la base de datos

Formato FASTA

Ejercicio:
He aislado un Hongo X nativo de la provincia de Misiones que posee una
produccin promisoria de la enzima y, pero es una cepa de crecimiento

muy lento y por lo tanto no la puedo emplear en mi proceso de

produccin enzimtica. Pero s poseo otra cepa fngica que es de
crecimiento rpido, pero su produccin enzimtica es regular.

Qu estrategias utilizaras para aumentar la produccin enzimtica de

dicho hongo por mtodos de biotecnologa tradicional y moderna?
Graficar ambos mtodos. Comentar la metodologa necesaria para cada

mtodo.

Ejercicio:
Ordenar la secuencia de hechos que se emplean en ingeniera
gentica
-Transferencia del vector con el ADN de inters (vector
recombinante) a una clula en donde se replique, proceso
llamado transformacin de la clula husped.
-Generacin de un fragmento o fragmentos de ADN que han de
utilizarse o manipularse.
-Seleccin de aquellas clulas que llevan las molculas de ADN
recombinante deseado, y su replicacin como clones.

- Empalme de los fragmentos de ADN formando una molcula

compuesta, ADN recombinante, que puede actuar como vector, o
ser incorporado en un vector para su posterior transmisin.

Referencias:
-Transferencia del vector
a una clula husped
- Seleccin de las clulas
con ADN recombinante
- Clonacin
- Cortes con enzimas de
restriccin
- Apareamiento y unin
(ligasa)
- Cromosoma husped
- Vector plasmidico

-Lugares de
reconocimiento por la
enzima

Ejercicio:

Juego de roles

1.- Seguidores de Monsanto

2.- Productores
3.- Ecologistas
4.- Sociedad en general

5.- Seguidores de Lab. San Pablo

6.- Polticos (cargos polticos)
7.- Seguidores de Brometan
8.- Profesionales