Manual del estudiante

Kit para el analisis de ADN de Lambda precortada

Leccin 1 Introduccin al Anlisis de Restriccin
Leccin 2 Gel de agarosa La electroforesis y Visualizacin de fragmentos de ADN
Leccin 3 Anlisis de Resultados y secado geles de agarosa
Introduccion
Cmo los fragmentos de ADN pueden formar un rompecabezas?
Una de las herramientas bsicas de la biotecnologa moderna es el empalme de ADN: el corte del ADN y
su vinculacin con otras molculas de ADN. El concepto bsico detrs de un empalme de ADN consiste
en eliminar un fragmento de ADN funcional - digamos que un gen - a partir del cromosoma de un
organismo y combinarlo con el ADN de otro organismo con el fin de estudiar cmo funciona el gen. El
resultado deseado del empalme de genes es para el organismo receptor para llevar a cabo las
instrucciones genticas proporcionadas por su gen recin adquirido. Por ejemplo, ciertas plantas se
pueden dar los genes para la resistencia a las plagas o enfermedades, y en algunos casos hasta la fecha,
los genes funcionales se han dado a la gente con los genes no funcionales, tales como aquellos que
tienen una enfermedad gentica como la fibrosis qustica.
En esta actividad de laboratorio, el ADN con el que va a trabajar es el genoma de un virus que ya ha
sido cortado en pedazos con enzimas. Su tarea ser determinar el tamao de las piezas de ADN
utilizando un procedimiento conocido como electroforesis en gel. Esto implica la separacin de una
mezcla de los fragmentos de ADN de acuerdo con el tamao de las piezas. Una vez logrado esto, se
compararan sus piezas de ADN con fragmentos de ADN cuyo tamao ya se conoce.
De los fragmentos de ADN que se producen, imaginemos que una pieza en particular, representa un gen
especfico. Este gen puede codificar cualquier nmero de caracteres. Pero antes de que se puede dar a
un organismo receptor, primero debe identificar el gen mediante electroforesis en gel.
Sus tareas:
Para separar y clasificar un gran grupo de molculas de ADN segn su tamao.
Para determinar el tamao de cada molcula separados por electroforesis en gel.
Antes de empezar, podra ser til para revisar la estructura del ADN y aprender acerca de las enzimas de
restriccin.

Leccion 1. Introduccin al Anlisis de Restriccin
Consideracin 1. Cmo se fragmenta el ADN En Pedazos?
El ADN consiste en una serie de molculas de base nitrogenada se mantienen unidos por enlaces de
hidrgeno dbiles. Estos pares de bases estn a su vez unidas a un esqueleto de azcar-fosfato. Las
cuatro bases nitrogenadas son adenina, timina, guanina y citosina (A, T, G y C). Recuerda el
apareamiento de bases regla es A - T y G - C. Consulte la siguiente figura de una molcula de ADN.

En esta representacin de ADN, los smbolos son como sigue:
Backbone:
S = Cinco molculas de carbono formando el azcar llamada
desoxirribosa
P = grupo fosfato formado por un tomo de fsforo y oxgeno bases
nitrogenadas:
A = adenina C = citosina guanina G = T = timina




Si un segmento de ADN se esquematiza sin los azcares y fosfatos, una secuencia de pares de bases
puede aparecer como:
Leer hacia la derecha > A C T C C G T A GA A T T C >
<-T G A G G C A T C T T A A G < Leer hacia la izquierda
Mira la secuencia lineal de bases (A, T, etc) en cada una de las hebras.
Describa cualquier patrn que puede ver en la secuencia de bases superior.
Se observa una secuencia palindromica en la parte izquierda de la secuencia.
Comparando de las bases en la hebra de ADN superior a los de la parte inferior. Puedes descubrir
alguna relacin entre las hebras superior e inferior? Describirlo.
Son cadenas complementarias que presentan una secuencia palindromica en las seis primeras pares de
bases de la izquierda.
Presta atencin a la secuencia superior de bases y compararlo con el menor. Notas alguna
agrupacin de bases que cuando ley hacia la derecha en la cadena superior y leer hacia la izquierda en
la cadena inferior son exactamente lo mismo?
Si, se presenta una secuencia palindromica en las seis primeras pares de bases de la izquierda.
Es posible que haya descubierto que la secuencia de pares de bases es aparentemente al azar y que las
dos cadenas son complementarias entre s; Como se emparejan con T,A, etc Usted puede tambin
haber notado que una parte de la cadena superior, GAATTC (lea hacia la derecha), tiene una contraparte
en el ramal inferior, CTTAAG (leer hacia la izquierda). Secuencias similares son AAGCTT y TTCGAA, y
CTGCAG y GACGTC. Cuando tales secuencia se analizaron conjuntamente con su secuencia
complementaria, el grupo se lee igual en ambas direcciones. Estas secuencias, llamadas palndromos,
son bastante comunes a lo largo de la molcula de ADN.
Las enzimas de restriccin - tijeras moleculares
Los virus llamados bacterifagos son los principales enemigos de las bacterias. Estos virus infectan
bacterias mediante la inyeccin de su propio ADN para forzar a las bacterias a multiplicar su ADN. Las
bacterias han respondido, mediante la evolucin, creando una defensa natural, llamadas enzimas de
restriccin, para cortar y destruir el ADN invasor. Las bacterias impiden la digestin de su propio ADN
mediante la modificacin de ciertas bases de ADN dentro de la secuencia de reconocimiento de la
enzima especfica, que les permite proteger su propio ADN, mientras que cortan ADN extrao. Esto
podra ser considerado como un sistema inmunolgico muy primitivo. Las enzimas de restriccin buscan
el ADN viral para secuencias palindrmicas especficas de pares de bases, como GAATTC, y cortan el
ADN en estos sitios. La secuencia real de DNA se denomina sitio de restriccin. Algunas enzimas de
restriccin pueden dejar una longitud corta de bases de nucletidos no apareados, llamado un extremo
"pegajosa", en el sitio donde cortan ADN, mientras que otras enzimas de restriccin hacer un corte a
travs de ambas hebras de la creacin de fragmentos de ADN de doble cadena con extremos romos ".
Mira la secuencia de ADN de abajo.

La enzima de restriccin EcoRI corta entre G y A en la secuencia palindrmica GAATTC.
Restriction enzyme breaks the molecular
bonds along the line indicated
Cuntos pares de base estn ah a la izquierda del corte?
Tres pares de bases
Cuntos pares de base estn ah a la derecha del corte?
Nueve pres de bases
Contar el nmero de pares de bases, es el fragmento de la derecha del mismo tamao que el
fragmento de la izquierda?
No
Cmo podras describir el tamao de cada fragmento en trminos del nmero de pares de bases en el
fragmento?
El fragment de la derecho es seis fragmentos mas grande que el fragment de la izquierda
Una caracterstica importante de las enzimas de restriccin es que cada enzima slo reconoce un
palndromo especfico y corta el ADN slo en esa secuencia especfica de bases. Una secuencia
palindrmica se puede repetir un nmero de veces en una cadena de ADN, y la enzima de restriccin
especfica cortar todos los palndromos, no importa de qu especie del ADN viene.
Si el palndromo GAATTC se repite cuatro veces en la misma pieza de ADN lineal, y la enzima de
restriccin que reconoce la secuencia de bases est presente y digiere el ADN, qu nmero de
fragmentos de ADN sern producidos?
Se producirn cinco fragmentos de AND.
Si se repite el palndromo GAATTC se encuentran al azar a lo largo de la cadena de ADN, qu se
puede decir acerca de los tamaos de los fragmentos que se producirn cuando el ADN se digiere con
una enzima de restriccin que reconoce esa secuencia?
Podrn ser de distintos tamaos dependiendo a que numero de bases se encuentre el sitio de
reconocimiento de la enzima de restriccin.

La siguiente tabla muestra las secuencias palindrmicas que son reconocidos por las enzimas que se
utilizan para digerir el ADN se le analizando en esta actividad.

A continuacin se muestra el resumen de lo que hemos aprendido hasta ahora:
Una secuencia en una cadena de ADN y su secuencia complementaria en la otra hebra puede formar
un palndromo es decir, GAATTC
CTTAAG
Los palndromos puede ser detectado por enzimas de restriccin
Las enzimas de restriccin cortan los palndromos en los sitios de restriccin
Las enzimas de restriccin reconocen palndromos especficos
El corte de ADN en sitios de restriccin producir fragmentos de ADN
El tamao de fragmento puede ser descrita por el nmero de pares de bases contiene un fragmento
Aplicando lo aprendido
Una molcula de ADN lineal se representa a continuacin. El ADN est representado por una lnea,
aunque en realidad, el ADN tiene dos hebras.
Si la molcula de ADN tiene dos sitios de restriccin, A y B, para una enzima de restriccin especfica,
cuntos fragmentos se producira si el ADN es cortado por la enzima?

Nmero de fragmentos y de cada fragmento.
Se producen tres fragmentos, 1, 2, 3
Qu fragmento sera el ms grande?
El fragmento 3
Cul sera el fragmento ms pequeo?
El fragmento 2
Palindromic sequence
Name of restriction enzyme that recognizes
the palindrome
GAATTC
CTTAAG
EcoRI
AAGCTT
TTCGAA
HindIII
CTGCAG
GACGTC
PstI
1
2 3

Dibuja una molcula de ADN que tiene cinco sitios de restriccin al azar para un palndromo especfica.
Cuntos fragmentos se producira si cada sitio fue cortado por una enzima de restriccin?


Escriba en cada fragmento.
clasificarlos por orden de tamao de mayor a menor.
5, 6, 2, 1, 4 y 3
En este diagrama A y B son diferentes secuencias palndromas en una cadena de ADN. Slo la enzima
de restriccin que reconoce el sitio B est presente.

Explicar por qu se producen slo dos fragmentos.
Porque solo el palndromo B es reconocido por la enzima de restriccin y el palndromo A al no ser
reconocido no puede generar un fragmento.
Ejercicio de Laboratorio - Preparacin de muestras
Preparacin de la muestra
1. Rotule cuatro microtubos como L, P, E y H, y colocarlos en el soporte de espuma.
L = ADN lambda Uncut
P = restriccin PstI digestin de ADN lambda
Restriccin E = EcoRI digestin de ADN lambda
Restriccin H = digestin con HindIII de ADN lambda
Dado que los tamaos de los fragmentos son conocidos por la digestin HindIII lambda, funcionar como
un estndar de tamao de ADN.

L P E H
2. Establecer la micropipeta para 10l. Utilice una punta de pipeta limpia, y la transferencia de 10 l de
theuncut ADN lambda en el tubo L en su soporte de tubo de espuma. Como alternativa, el maestro
puede dar a cada equipo microtubos que ya contienen muestras de ADN.
3. Repita el paso 2 mediante la transferencia de los tubos de valores P, E y H en cada uno de sus tubos
de muestras debidamente etiquetados. Asegrese de utilizar 10 l cada vez y cambiar la punta de la
pipeta cada vez.
1
2 3 4 5 6

Es el ADN que ha aadido a estos tubos es visible?
ADN es incoloro as fragmentos de ADN en el gel no se pueden ver durante la electroforesis. Un
colorante azul de carga, compuesta de dos colorantes azules, se aade a la solucin de ADN. Los
colorantes de carga no se tien el ADN, pero que sea ms fcil para cargar sus muestras en los geles de
agarosa y monitorear el progreso de la electroforesis de ADN. Los frentes de colorantes migran hacia el
extremo positivo del gel, al igual que los fragmentos de ADN. Los comigrates ms rpidos de tinte con
fragmentos de ADN de aproximadamente 500 pb, mientras que los comigrates ms lentos de tinte
migran con fragmentos de ADN de aproximadamente 5 kb de tamao.
4. Ajustar la micropipeta hasta 2,0 l y traslade esta cantidad de colorante de carga toeach de los tubos
de la marca L, P, E y H en el soporte para microtubos. Utilizar una punta de pipeta para todos los tubos.
5. El tinte de ADN y la carga debe ser completamente mezclada en cada tubo antes de colocar las
muestras en los pocillos del gel para electroforesis. Esto se logra fcilmente mediante la celebracin de
la parte superior de un tubo de ensayo micro cerrado entre el dedo ndice y el pulgar de una mano y
agitando la parte inferior del tubo con el dedo ndice de la otra mano.
Si est utilizando una microcentrfuga, transfiera los cuatro tubos que contienen ADN digerido y tampn
de carga en la microcentrfuga. Asegrese de que los tubos estn en una disposicin equilibrada en el
rotor. Haga que su cheque maestro antes de girar los tubos. Centrifugar los tubos manteniendo pulsado
el botn durante unos segundos para recoger todo el lquido en la parte inferior de los tubos. Si usted no
tiene una centrfuga, recoger el lquido de la parte inferior de cada tubo golpeando suavemente que en
su mesa de laboratorio.

6. Si es posible, calentar las muestras a 65 C durante 5 minutos, luego se enfra en hielo-thisresults
produciendo una mejor separacin de las bandas de ADN.
7. Usted tiene dos opciones:
Opcin uno: Almacenar las muestras de ADN en el refrigerador y ejecutar el gel de agarosa durante la
prxima clase. Asegrese de pulso-girar los tubos en la centrfuga o golpear suavemente en el banco
para llevar todo el lquido de la parte inferior antes de cargar las muestras en el gel.
Opcin dos: Si hay tiempo suficiente, contine con la siguiente seccin.

Centrifuge Tap
Leccin 2. Electroforesis en gel de agarosa
Carga del Gel y configuracin de la Cmara de gel para electroforesis
1. Utilizando una punta de pipeta nueva para cada muestra, pipeta de 10 l a partir de los tubos
etiquetados L, P, E y H en los pocillos separados en el gel. Nota: Los pozos de muestra son a menudo
difciles de ver. La visualizacin de los pozos se puede mejorar mediante la colocacin de papel negro
debajo de la cmara. Cargar el gel en el siguiente orden:
1 L 2 P
3 E 4 H



2. Coloque la tapa de la cmara de electroforesis. No mueva la cmara de electroforesis. Conecte los
cables elctricos a la fuente de alimentacin, nodo al nodo (rojo con rojo) y el ctodo al ctodo (negro
con negro). Asegrese de que ambos conductores elctricos estn unidos en el mismo canal de la fuente
de alimentacin.

3. Correr la electroforesis a 100 V durante 30 minutos. Poco despus se aplica corriente, tinte theloading
se puede ver en movimiento a travs del gel hacia el lado positivo de la cmara de gel.
4. Cuando la electroforesis se haya completado, apague la fuente de alimentacin, desconecte theleads
de las entradas de alimentacin y retire la tapa de la cmara de electroforesis.
5. Retire la bandeja del gel de la cmara. El gel es muy resbaladizo. Mantenga el nivel de bandeja.
6. Vierta el exceso de tampn de nuevo en el envase original para su reutilizacin, si se desea.
7. Deslice el gel en la bandeja de tincin. Proceder directamente a los procedimientos de tincin de gel.
Su instructor determinar si se debe utilizar el protocolo de tincin rpida (si hay tiempo suficiente) o
protocolo de tincin durante la noche.
Consideracin 2 Cmo los fragmentos de ADN pueden separarse unos de otros?
La electroforesis en gel de agarosa es un procedimiento utilizado para separar fragmentos de ADN en
funcin de sus tamaos. El ADN es una molcula que contiene muchas cargas elctricas negativas. Los
cientficos han utilizado este hecho para disear un mtodo que se puede utilizar para separar
fragmentos de ADN. Una solucin que contiene una mezcla de fragmentos de ADN de tamao variable
se coloca en un pequeo pozo formado en un gel de agarosa que tiene una textura similar a la gelatina.
Una corriente elctrica hace que las molculas de ADN cargadas negativamente a moverse hacia el
electrodo positivo.
Imagine el gel como un colador con pequeos poros que permiten a las pequeas partculas que se
mueven a travs de l muy rpidamente. Cuanto mayor sea el tamao de las partculas, sin embargo,
ms lento se cuelan a travs del gel. Despus de un perodo de exposicin a la corriente elctrica, los
fragmentos de ADN sern claramente en s mismos por tamao. Los fragmentos que son del mismo
tamao tienden a moverse juntos a travs de las bandas de gel y forma.
Dado lo anterior, dibujar la forma en que los fragmentos podran ser separados. Rotula cada fragmento
con su letra correspondiente









Un trozo de ADN se corta en cuatro fragmentos como se muestra en el diagrama. Una solucin que
contiene los cuatro fragmentos se coloca en un pozo en un gel de agarosa. Usando la informacin:
Haga que su profesor revise su esquema antes de continuar.
Cuando los fragmentos ms grandes, aquellos con el mayor nmero de pares de bases, se
encontraran, hacia la parte superior del gel o la parte inferior? Por qu?
Se encontraran en la parte superior del gel gel debido a que poseen mayor peso y sern los que menos
se muevan por el gel
Supongamos que tenemos 500 piezas de cada uno de los cuatro fragmentos, Cul es el aspecto que
tendra el gel?
Las bandas del gel presentaran la misma intensidad
Si fuera posible pesar cada uno de los fragmentos, Cul sera el ms pesado? Por qu?
El fragmento D debido a a que posee un mayor nmero de pares de bases correspondiente a su longitud
Complete esta regla para el movimiento de los fragmentos de ADN a travs de un gel de agarosa.
Los fragmentos de ADN viajan a travs del gel de agarosa de acuerdo a su peso y carga, los fragmentos
ms ligeros viajaran ms hacia la parte inferior del gel, mientras que los fragmentos ms pesados
tendern a quedarse en la parte superior. En cuanto a la carga, los que posean una mayor cantidad de
grupos fosfato en su esqueleto se comportaran igual que los fragmentos ms ligeros del ADN.

D
A
C
B
Cuanto mayor sea el fragmento de ADN, la
Este diagrama representa el ADN genmico del bacterifago lambda, que muestra las ubicaciones de los
grupos de genes importantes (Ausubel et al. 1998). Las flechas marcan los sitios donde la enzima de
restriccin Hin III corta al ADN, y los nmeros indican el nmero de pares de bases en cada fragmento:

El bacterifago lambda se compone fundamentalmente de una cabeza, que contiene el ADN genmico, y
una cola que est implicado en la unin del fago a las clulas bacterianas.
Cuntos fragmentos fueron producidos por la enzima de restriccin HindIII?
Ocho fragmentos
En el diagrama de gel a la derecha, mostrar cmo cree que estos fragmentos se acomodaran durante la
electroforesis.
Escriba en cada fragmento con su nmero correcto de pares de bases










23,130
9,416
6557
4361
2322
2027
564
125




Visualizacin de fragmentos de ADN
Consideracin 3. Puede el ADN manifestarse?
De qu color era el ADN antes de agregar colorante de carga?
Hacer Fragmentos de ADN visibles
Dado que el ADN es, naturalmente, incoloro, no es inmediatamente visible en el gel. Examen visual sin
ayuda del gel despus de la electroforesis indica slo las posiciones de los tintes de carga y no las
posiciones de los fragmentos de ADN. Fragmentos de ADN se visualizaron por tincin del gel con un
tinte azul llamado Fast Blast DNA stain. Las molculas de colorante azul estn cargados positivamente y
tienen una alta afinidad por el ADN. Estas molculas de colorante azul se unen fuertemente a los
fragmentos de ADN y permiten que el ADN se vuelva visible. Estas bandas visibles de ADN pueden
entonces ser rastreados, fotografiados, esbozadas o retenidos como un gel seco de forma permanente
para el anlisis.
Ejercicio de laboratorio - La tincin con espiracin rpida de ADN
Hay dos protocolos para el uso de Fast Blast DNA stain en el aula. 1 Utilice la opcin para la tincin
rpida de geles para visualizar las bandas de ADN en 12-15 minutos, y la opcin 2 para la tincin
durante la noche. Dependiendo de la cantidad de tiempo disponible, el profesor decidir cul es el
protocolo a utilizar. Dos equipos de estudiantes manchan los geles por bandeja de tincin (es posible
que desee hacer muescas en las esquinas de gel para la identificacin). Bandejas de tincin Mark con
iniciales y perodo de clase antes de comenzar esta actividad.
ADVERTENCIA
Aunque Fast Blast DNA stain no es txico y no carcinognico, guantes de ltex o vinilo se deben usar
durante la manipulacin de la mancha o geles teidos para mantener las manos se vean manchados
azul. Las batas de laboratorio u otra ropa protectora deben ser utilizadas para evitar la ropa de tincin.
Opcin 1: La tincin rpida de geles de agarosa en 100x Fast Blast DNA stain
Este protocolo permite una rpida visualizacin de las bandas de ADN en geles de agarosa dentro
15 minutos. Para la tincin rpida, Fast Blast DNA stain Rpido (500x) debe ser diluido a una
Concentracin de 100x. Recomendamos el uso de 120 ml de 100x Fast Blast DNA stain dos 7 x 7 cm o 7
x 10 cm en geles de agarosa bandejas de tincin que se ofrecen en kits educativos de Bio-Rad. Si se
utilizan bandejas de tincin alternativos, aadir un volumen suficiente de solucin de tincin para
sumergir completamente los geles.
Despus de la electroforesis, los geles de agarosa se deben retirar de sus bandejas de gel antes de ser
colocado en la solucin de tincin. Esto se logra fcilmente mediante la celebracin de la base de la
bandeja de gel en una mano y empujando suavemente el gel con el pulgar de la otra mano. Debido a
que el gel es frgil, hay que prestar especial atencin en su manipulacin. Se recomienda
encarecidamente utilizar una esptula grande u otra superficie de apoyo para transferir el gel a partir de
un recipiente a otro. Destaining requiere el uso de al menos un recipiente de gran volumen, capaz de
contener al menos 500 ml, en cada estacin de trabajo del estudiante. Cada equipo de estudiantes
puede utilizar recipientes de aseo por separado para cada etapa de lavado, o simplemente utilizar un
solo contenedor que se vaca despus de cada lavado y rellenado para el siguiente lavado.
1. Marcar las bandejas de tincin con sus iniciales y perodo de clase. Va a manchar 2 geles por bandeja.
2. geles Stain
Retire cada gel de la bandeja de gel y cuidadosamente deslcelo en la bandeja de tincin. Vierta
aproximadamente 120 ml de tincin de 100x en la bandeja de tincin. Si es necesario, agregue ms
mancha 100x para sumergir completamente los geles. Teir los geles durante 2-3 minutos, pero no ms
de 3 minutos. Usando un embudo, vierta la mancha 100x en una botella de almacenamiento y guardarlo
para uso futuro. La mancha puede ser reutilizada al menos 7 veces.

3. geles Enjuague
La transferencia de los geles en un recipiente grande que contiene 500 a 700 ml de limpio, clido
(40-55 C) el agua del grifo. Agite suavemente el gel en el agua durante ~ 10 segundos para enjuagar.

10 segundos
4. geles Wash
Transferir el gel en un recipiente grande con 500-700 ml de agua limpia y tibia de la llave. El rock o agitar
el gel en una plataforma oscilante durante 5 minutos con cuidado. Si no est disponible plataforma
oscilante, mover los geles suavemente en el agua una vez cada minuto.

5 minutos
5. geles Wash
Realizar un segundo lavado como en el paso 4.

5 minutos
6. Registrar los resultados
Examine los geles teidos de bandas de ADN esperados. Las bandas pueden aparecer borrosa
inmediatamente despus del segundo lavado, pero comienzan a desarrollar en bandas ms ntidas
dentro de 5-15 minutos despus de la segunda de lavado. Esto se debe a las molculas de colorante
Fast Blast DNA stain que migran en el gel y de unin ms fuertemente a las molculas de ADN.
3 minutes 2
Para obtener el mximo contraste, lavados adicionales en agua tibia puede ser necesario. Destain al
nivel deseado, pero no se lava el gel en agua durante la noche. Si no puede completar la decoloracin
en el tiempo asignado, es posible transferir el gel a 1x Fast Blast DNA stain para la tincin durante la
noche. Vea la Opcin 2.
a. Coloca el gel sobre un fondo claro y registrar sus resultados al hacer un diagrama de la siguiente
manera. Colocar una hoja de lmina de plstico claro o acetato sobre el gel. Con un marcador
permanente, rastrear los pozos y patrones de bandas en la lmina de plstico para hacer una imagen
rplica de su gel. Retirar la lmina de plstico para su posterior anlisis. Alternativamente, los geles se
pueden fotocopiar en un pedazo amarillo de pelcula transparente para un contraste ptimo.
b. Secar el gel de agarosa como un registro permanente del experimento.
yo. Recorte cualquier carriles descargados con un cuchillo o navaja. Cortar el gel de arriba a abajo para
quitar los carriles que no ha cargado en muestras, dejando slo carriles 1-4.
ii. Colocar el gel directamente sobre el tamao hidrfilo de una pieza de supportfilm gel. (El agua formar
perlas en el lado hidrfobo de un trozo de pelcula de soporte de gel.) Centro de gel en la pelcula y
eliminar las burbujas que se pueden formar entre el gel y la pelcula. Coloque la pelcula en una toalla de
papel y dejar que el gel seco en un lugar bien ventilado, asegurndose de evitar la exposicin directa a la
luz. Como se seca el gel que se adhiere a la pelcula, pero no se encoger. Si se deja reposar sobre la
pelcula de soporte, el gel se seque por completo a temperatura ambiente despus de 2-3 das. El
resultado ser un disco plano, transparente y duradera para el experimento.

Opcin 2: tincin Noche de geles de agarosa en 1x explosiva Fast ADN de la mancha
Para la tincin durante la noche, Fast Blast DNA stain (500x) debe diluirse a una concentracin 1x.
Recomendamos el uso de 120 ml de 1x Fast Blast DNA stain dos 7 x 7 cm o 7 x 10 cm en geles de
agarosa bandejas de tincin que se ofrecen en kits educativos de Bio-Rad. Si se utilizan bandejas de
tincin alternativos, aadir un volumen suficiente de solucin de tincin para sumergir completamente los
geles.
Despus de la electroforesis de ADN, geles de agarosa se deben retirar de sus bandejas de gel antes de
ser colocado en la solucin de tincin. Esto se logra fcilmente mediante la celebracin de la base de la
bandeja de gel en una mano y empujando suavemente el gel con el pulgar de la otra mano. Debido a
que el gel es frgil, hay que prestar especial atencin en su manipulacin.
1. Marque la bandeja de tincin con sus iniciales y perodo de clase. Va a manchar 2 geles por bandeja.
2. geles Stain (durante la noche) *
Verter la mancha 1x en una bandeja de tincin de gel. Retire el gel de la bandeja de gel y
cuidadosamente deslcelo en la bandeja de tincin que contiene la mancha. Si es necesario, aadir
solucin de tincin ms 1x para sumergir completamente los geles. Coloque la bandeja de tincin en una
plataforma oscilante y agitar durante la noche. Si no hay ninguna plataforma oscilante est disponible,
agitar los geles con tincin bandeja de un par de veces durante el perodo de tincin. Usted debe
comenzar a ver bandas de ADN despus de 2 horas, pero por lo menos 8 horas de tincin se
recomienda para una visibilidad completa de las bandas teidas.
Gel Support Film
Tracing of electrophoresis gel
l fl h Gl
* Es muy importante que usted sacude geles con suavidad y de forma intermitente mientras se realiza la
tincin durante la noche en 1x Fast Blast DNA stain ya que los fragmentos ms pequeos tienden a
difundirse sin agitacin.

2. Registrar los resultados
No se requiere ninguna decoloracin despus de la tincin con 1x explosiva rpida. Los geles pueden
ser analizados inmediatamente despus de la tincin.
a. Coloca el gel sobre un fondo claro y registrar sus resultados al hacer un diagrama de la siguiente
manera. Colocar una hoja de lmina de plstico claro o acetato sobre el gel. Con un marcador
permanente, rastrear los pozos y patrones de bandas en la lmina de plstico para hacer una imagen
rplica de su gel. Retirar la lmina de plstico para su posterior anlisis. Alternativamente, los geles se
pueden fotocopiar en un pedazo amarillo de pelcula transparente para un contraste ptimo.
b. Secar el gel de agarosa como un registro permanente del experimento.
yo. Recorte cualquier carriles descargados con un cuchillo o navaja. Cortar el gel de arriba a abajo para
quitar los carriles que no ha cargado en muestras, dejando slo carriles 1-4.
ii. Colocar el gel directamente sobre el tamao hidrfilo de una pieza de supportfilm gel. (Agua formar
cuentas en el lado hidrofbico de un pedazo de pelcula de soporte de gel.) Centro del gel en la pelcula
sobre una toalla de papel y dejar que el gel seco en un lugar bien ventilado, asegurndose de evitar la
exposicin directa a la luz. Como se seca el gel que se adhiere a la pelcula, pero no se encoger. Si se
deja reposar sobre la pelcula de soporte, el gel se seque por completo a temperatura ambiente despus
de 2-3 das. El resultado ser un disco plano, transparente y duradero para el experimento.

Nota: Evite la exposicin prolongada de los geles secos a la luz para evitar la decoloracin banda dirigir.
Sin embargo, las bandas de ADN reaparecern si los geles secos se almacenan en la oscuridad durante
2-3 semanas despus de la decoloracin.
Leccin 3: Anlisis de los resultados
Si se utiliza el protocolo de tincin durante la noche para
geles de manchas, anota los resultados y geles secos como
se describe en los procedimientos de tincin de gel en la
Leccin 2.
Coloque la hoja de seguimiento de plstico de los patrones
de bandas a partir del ADN de electroforesis a continuacin.

Stain overnight
Gel Support Film












Relacione el gel seco que muestra los patrones de bandas a partir del ADN de electroforesis a
continuacin.

Gel de electroforesis se sec
Organizar los datos
Uno de los primeros pasos para analizar los datos es determinar los tamaos aproximados de cada uno
de los fragmentos de restriccin. Esto se puede hacer mediante la comparacin de los fragmentos de
restriccin de ADN con fragmentos de ADN de tamaos conocidos, o normas. Que va a utilizar dos
mtodos para estimar el tamao de los fragmentos en el ADN sin cortar lambda, el PstI lambda digerido,
y los carriles EcoRI lambda digerir. El primer mtodo se basa en la estimacin visual y es menos preciso
que el segundo mtodo, que implica la creacin de una curva estndar. Ambos mtodos se basan en el
uso de la lambda HindIII digerir como un estndar de ADN, o marcador.
l fl h Gl
1. Con una regla, mida la distancia (en mm) que cada una de sus bandas fragmentsor ADN viajaron
desde el pozo. Mida la distancia desde el fondo del pozo hasta la parte inferior de cada banda de ADN y
registrar sus nmeros en la tabla de la pgina siguiente.
2. Estimar los tamaos en pares de bases (pb), de cada uno de su fragments.Hint restriccin: Comparar
la distancia que las bandas desconocidas (ADN lambda, PstI digeridos, y digerido con EcoRI) viajaron
con las de las bandas HindIII. Escriba los tamaos estimados en la tabla de datos.
3. Una forma ms precisa de la estimacin de tamaos de las bandas de ADN desconocidas es a
primera curva estndar constructa en base a las mediciones obtenidas a partir de las bandas de ADN
HindIII conocidos. Ms adelante en el anlisis va a construir una curva estndar y determinar con mayor
precisin el tamao de cada una de las bandas de ADN.

Datos de electroforesis. Medir la distancia (en milmetros) que cada fragmento viaj desde el pozo, y
grabarlo en la tabla. Estime su tamao, en pares de bases, mediante la comparacin de su posicin a la
restriccin HindIII digest (estndar de ADN o marcador). Recuerde, algunos carriles tendrn menos de 6
fragmentos

Anlisis de Fragmentos de ADN
Los datos que ha introducido para la lambda HindIII digerido fueron las posiciones relativas de las
bandas de ADN de tamao conocido. Dado que el tamao exacto y la posicin de estos fragmentos son
conocidos, se pueden utilizar como puntos de referencia estndar para estimar el tamao de las bandas
de fragmentos desconocidos. Un conjunto de fragmentos de tamaos conocidos se llama una regla
molecular peso o normas o marcador (oa veces una escalera a causa de aparicin de las bandas).
Ahora mira el diagrama del gel de agarosa (abajo). Se muestra dos carriles. Un carril es la columna de
bandas por debajo de un pozo. El carril de la derecha contiene un patrn de bandas a partir de cuatro
fragmentos de longitud conocida (6000, 5000, 3000 y 1000 pb).












Qu carril contiene los estndares de peso molecular? Cmo lo sabes?


Well
Band
Agarose gel

Etiquetar cada banda en el carril derecho con

Comparar los dos carriles de bandas.

Estimar el tamao de los fragmentos en la Banda inferior, el carril de la izquierda y la banda superior
Cmo determinaron los tamaos de las dos bandas en el carril de la izquierda?

Examine el gel de la prctica anterior.
Medir la distancia en milmetros (mm) de que cada banda se movi.
Mida desde el borde inferior del pozo hasta el borde inferior de la banda.
Registrar los datos de la tabla a la derecha, incluyendo la unidad de medida, mm.
El nmero de pares de bases en cada uno de los fragmentos de ADN en el gel se puede determinar
usando otro mtodo que puede ser ms preciso. Esto implica graficar el tamao de los fragmentos
conocidos desde el marcador de ADN contra la distancia que cada banda de ADN se movi a travs del
gel, para generar una curva estndar. Esto es ms conveniente hacer en papel semilogartmico.
Mira los datos del gel de la prctica en la pgina 37 Los fragmentos de tamao conocido se trazan en
papel semilogartmico, produciendo la curva estndar por debajo










Left lane
1
2
1
2
3
4
Right lane

Las distancias migradas por dos fragmentos de longitud desconocida tambin fueron marcadas en la
curva estndar.
1. Para cada fragmento, se alinean verticalmente con una regla de la distancia recorrida a la posicin el
X eje horizontal a la lnea que has construido.
2. Desde el punto donde la regla cruza la lnea, colocar la nota horizontal gobernante donde se cruza con
el eje Y vertical para el tamao del fragmento. Esta ser su determinacin del tamao de ese fragmento.
Cuntos pares de base es el fragmento 2?
Qu tan exacta es esta estimacin del tamao?
Determinacin del tamao de los fragmentos de ADN mediante la creacin de una curva estndar
De los datos de laboratorio, que fueron capaces de estimar el tamao aproximado de cada uno de los
fragmentos de ADN que se separaron en el gel. Esto se hizo en trminos del nmero de pares de bases.
Explica cmo hiciste esta determinacin.
Se le ha dotado de tres ciclos, papel semilogartmico.
1. tamao del fragmento estar en ser en el eje vertical (Y).
2. El eje horizontal (X) es su escala para la distancia recorrida a travs del gel en milmetros.
3. Uso de los fragmentos de la lambda HindIII digerir, trazar la distancia recorrida en relacin con el
tamao del fragmento para cada fragmento. Conecte la mayor cantidad de puntos como puedas
dibujando una lnea recta a travs de ellos. Esto proporcionar una curva estndar con el que usted ser
capaz de determinar el tamao de los fragmentos desconocidos de las otras tres muestras.
4. determinar los tamaos de los fragmentos en su lambda sin cortar (L), PstI digestin (P), y digestin
con EcoRI (E), usando el mtodo descrito en la pgina anterior.