Sinergia Fago-antibitico: un posible enfoque para combatir la

Pseudomona aeruginosa
Petar Knezevic, Sanja Curcin, Verica Aleksic, Milivoje Petrusic, Ljiljana Vlaski.

Departamento de Biologa y Ecologa, Facultad de Ciencias, Universidad de
Novi Sad, Trg Dositeja Obradovica 2, Novi Sad, Vojvodina, Serbia.
Planta de Psicologa Molecular, Centro de Estudios de Organismos (COS)
Heidelberg, INF 360 D-69120 Heidelberg, Germany
Universidad Clnica ENT, Centro Clnico de Vojvodina, Facultad de Medicina,
Universidad de Novi Sad, Hajduk Veljkova 3, Novi Sad, Vojvodina, Serbia.

Recibido de 19 marzo de 2012; aceptado 24 de agosto de 2012
Publicado el 7 de septiembre de 2012
Objetivo
Examinar la eficiencia antimicrobianas de la combinacin de concentraciones
subinhibitorias de agentes anti-pseudomona convencionales en combinacin P.
aeruginosas - fagos especficos de las familia Siphoviridae y Podoviridae y dilucidar las
principales razones de la aparicin de sinergismo entre ellas.
Planteo de la problemtica y antecedentes
Pseudomona aeruginosa (bacteria Gram-negativa) es un patgeno oportunista,
causante de varios tipos de infecciones y uno de los principales patgenos
hospitalarios, resistente a la mayora de los antimicrobianos por su mecanismos
intrnseco y adquirido.
Si bien, ciertos antibiticos pueden ser aplicados con xito a las infecciones causadas
por esta bacteria, la mayora de los agentes anti-Pseudomona son txicos,
teratognicos o causan reacciones de hipersensibilidad. Una solucin podra ser la
combinacin de agentes antimicrobianos convencionales, los cuales prolongan la
aparicin de cepas resistentes a los antibiticos. Por otro lado, los bacterifagos
tambin son considerados agentes antimicrobianos.
Durante la ltima dcada, los bacterifagos han sido ampliamente examinados como
potenciales agentes antimicrobianos para la terapia, incluyendo varios fagos P.
aeruginosa - especficos (Heo et al 2009; McVay et al., 2007: 20, Wang et al., 2006;
Watanabe et al., 2007).
Sin embargo, pocos estudios se han ocupado de la combinacin de fagos y
antibiticos convencionales. Hagens et al. (2006) observ que los fagos filamentosos
podran aumentar la sensibilidad de P. aeruginosa a varios antibiticos (gentamicina,
tetraciclina, cloranfenicol y carbenicilina), mientras Comeau et al. (2007) reportaron
que entre tetraciclinas, gentamicina, quinolonas y b-lactmicos (aztreonam y varias
cefalosporinas), slo los dos ltimos grupos dieron sinergia fago-antibitico frente a
Escherichia coli.

Materiales y mtodos:
Cepas de P.aeruginosa empleadas:
Cepa de referencia ATCC 9027 (infeccin del odo externo).
PA-4U aislada del medio ambiente.
PA-M2 de agua de ro.
Se inocularon en caldo LB (Luriae Bertani) e incubaron durante la noche a 37C.
Determinacin MIC: Se emplearon ceftriaxona, gentamicina, ciprofloxacina y
polimixina-B, como agentes antimicrobianos. Usando un mtodo de micro titulacin a
540 nm, en cada pocillo se aadieron 100 l de una suspensin bacteriana y el mismo
volumen de diluciones al doble de antibiticos. La concentracin ms baja de
antibitico que inhibe el crecimiento bacteriano (por la ausencia de color rojo
formazano) fue considerado como el MIC.
Bacterifagos: Se emplearon 3 fagos: (familia Podoviridae), -1 y 001A (familia
Siphoviridae), para cepas PA-4U, ATCC 9027 Y PA-M2, respectivamente. Los fago y
001A fueron capaces de infectar hasta el 72.7% y el 75.8% de las cepas examinadas
respectivamente, mientras que -1, exhibi un espectro ltico moderado. Sus periodos
de latencia fueron 60 minutos (fago ), 75 minutos (fago -1) y 90 minutos (fago
001A).
Curva de tiempo muerto: Se emplearon distintos tubos conteniendo: solo bacterias;
bacterias y antibiticos; bacterias y bacterifagos; bacterias, antibiticos y
bacterifagos. Luego de la incubacin de los tubos, se realiz el recuento bacteriano a
distintos tiempos, mediante difusin de los tubos sobre agar Muller-Hinton.
Morfologa celular: Se analiz la morfologa celular de cepas ATCC 9027 Y PA-M2 con
concentraciones subinhibitorias de antibitico, en paralelo, por microscopa (tincin
con azul de metileno). La longitud celular se midi utilizando un software, y se calcul
la diferencia estadstica por medio de ANOVA y la prueba post-hoc Holm. Cuando las
dimensiones eran menores a 5 m, se consider que haba filamentacin, mientras
que cambios morfolgicos menores a 5 m, pero ms largo que regular, se denotan
como alargamiento.
Resultados principales
Sinergismo fago-antibitico: De acuerdo a las curvas de Tiempo vs Muerte, cuando
concentraciones sub-inhibidoras de gentamicina, ciprofloxacina y polimixina B fueron
usadas, junto a fagos, contra las cepas correspondientes de P. aeuroginosa, no se
observ una reduccin en el conteo bacteriano. En contraste, fue mayor respecto al
conteo inicial, indicando ausencia de actividad antimicrobiana. Sin embargo
nicamente la combinacin de ciprofloxacina y el fago -1 redujo el conteo inicial de la
cepa ATCC 9027. La combinacin de fagos y concentraciones sub-inhibidoras de
ceftriaxona tambin redujo el conteo bacteriano de las tres cepas en comparacin con
el agente individual ms activo.
Tamao celular: El tamao promedio de las clulas de P. aeuroginosa cultivadas en
caldo LB no fue diferente estadsticamente de aquellas cultivadas en presencia de
de MIC de gentamicina y polimixina B. En presencia de concentraciones sub-
inhibidoras de ciprofloxacina y ceftriaxona, el tamao bacteriano se redujo sin marcar
una diferencia estadsticamente significativa y ni la presencia ni ausencia del fago en
el medio tuvo un efecto sobre la filamentacin bacteriana.
Conclusin
En resumen, entre los agentes antimicrobianos analizados, slo ceftriaxona provoca
cambios morflogicos celulares. Sinergismo Fago-antibiotico ofrece una posible
oportunidad para el desarrollo de estrategias de tratamiento para las infecciones
causadas por P. aeruginosa en el futuro, el uso de antibiticos correspondientes y
fagos que cumplan los requisitos previos para la aplicacin teraputica. Este enfoque
ofrece ventajas adicionales, incluyendo el rpido inicio del sinergismo que
posiblemente contribuye a una reduccin en nmero bacteriano in vivo a niveles que el
sistema inmune puede hacer frente con xito. Adems, evitar efectos secundarios que
ocurren despus de la administracin de dosis altas de antibiticos.