Estudio del mecanismo molecular de

secrecin de protenas translocadoras

a t r avs del i ny ect i s oma de
Escherichia coli enteropatgena.
Alan Gerardo Hernndez Melgar

Laboratorio 325 Norte
Dra. Bertha Gonzlez Pedrajo

Claudia Torres Vargas
P. de M. en C.B.
Escherichia coli
enteropatgena (EPEC)
! Escherichia coli enteropatgena
(EPEC) es uno de los principales
agentes etiolgicos de diarrea
infantil en pases en vas de
desarrollo. (Chen y Frankel 2005).
Fisiopatologa
! L a i n f ec c i n por E P E C s e car act er i z a
histopatolgicamente por una alteracin que la
bacteria produce a nivel intestinal conocida como la
lesin A/E (adherencia y esfacelamiento)
Kaper et al., 2004; Nataro y Kaper, 1998;Knutton et al., 1995

! Para que se induzca la lesin (A/E) la bacteria
necesita adherirse al enterocito y translocar hacia
su interior protenas importantes en la virulencia
denominadas efectores.
! Para lograr esto utiliza el sistema de secrecin de
protenas tipo III (SST3).
Inyectisoma o sistema de secrecin tipo III de EPEC
! 1 . - s u s t r a t o s
t e m p r a n o s
(subunidades del eje y
la aguja)
! 2 . - s u s t r a t o s
i n t e r m e d i o s
(translocadores).
! 3.- sustratos tardos
(efectores).
! 2do interruptor (SepL-SepD) garantiza que los
sustratos tardos o efectores se transloquen
eficientemente al interior de la clula hospedera
en lugar de secretarse al medio extracelular.
SepL/SepD
SepD
SepL
Sustratos intermedios
(Translocadores)
(EspB/D)
Favorece
Sustratos tardos
(Efectores)
Bloquea
M. O. Gaytn Enrquez
Antecedentes
Fenotipo de secrecin de las mutantes sepD y sepL
Efectores
Translocadores
Antecedentes
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!-SepL
Control
SepL interacciona con His-EspB
Claudia E. Torres Vargas
Objetivo
SepD interacciona tambin con los
translocadores?

SepL en complejo con SepD interacciona
de igual manera?
Materiales y mtodos
! Plsmidos
! pMEespB que se expreso en Escherichia coli BDP
[BL21(DE3) pLysS] (Stratagene).
! Plsmido que contiene el gen espB en el vector
pET19b, fusiona una etiqueta de 10 histidinas en el
extremo amino terminal de la protena, es inducible
con IPTG).
! pATpD que se expreso en Salmonella SJW1368.
! Plsmido que contiene el gen sepD en el vector
pTrc99A, confiere resistencia a ampicilina, es inducible
con IPTG.
! pMTBipDpL que se expreso en Salmonella SJW1368
! Construccin bicistrnica que contiene los genes sepD
y sepL en el vector pTrc99A, confiere resistencia a
ampicilina y es inducible con IPTG.
Se prepararon clulas
quimiocompetentes con
CaCl
2

L o s p l s mi d o s s e
tr ansf or mar on en l a
c e p a h o s p e d e r a
adecuada.
Se indujo la produccin
de protenas
L a s c l u l a s s e
centrifugaron y se lisaron
por sonicacin
Se cent r i f ug par a
separar las fracciones
soluble e insolube
La fraccin soluble de la
protena recombinante
His-EspB se carg en una
col umna de r es i na
acoplada a nquel.
Se incub con un lisado
en el que se indujo la
segunda protena (SepD
SepL/D)
La resina se lav con
c o n c e n t r a c i o n e s
crecientes de imidazol
L a s p r o t e n a s s e
eluyeron con 500 mM
de imidazol
Metodologa
E l e c t r o f o r e s i s
desnaturalizante en
g e l e s d e
poliacrilamida (SDS-
PAGE).
I nmunodet ecci n
tipo Western Blot.
Resultados
Interaccin His-EspB/SepD
Lavados Eluciones
His-EspB
(35.7 KDa)
SepD
(17.52 KDa)
Control Negativo
SepD
(17.52 KDa)
Lavados Eluciones
Interaccin His-EspB-SepD/SepL
His-EspB
(35.7 KDa)
SepD
(17.52 KDa)
Lavados Eluciones
Control
Negativo
SepD
(17.52 KDa)
Lavados Eluciones
Conclusiones
! La interaccin SepL/His-EspB se anula
cuando SepL se encuentra en complejo con
SepD.
! SepD podra provocar un cambio en la
conformacin estructural de SepL que evita
su interaccin con EspB.
! Posi bl ement e l as i nt er acci ones son
mutuamente excluyentes.
Es necesario utilizar otras metodologas de
interaccin proteca para as confirmar los
resultados obtenidos en este trabajo. Por
ejemplo: Doble hbrido en levadura
Perspectivas
Referencias
! OConnell Colin, Creasey Elizabeth, et al. (2004). SepL, a protein
required for enteropathogenic Escherichia coli type III translocation,
interacts with secretion component SepD. Molecular Microbiology
! Deane, J. E., P. Abrusci, et al. (2010). "Timing is everything: the
regulation of type III secretion." Cell Mol Life Sci67(7): 1065-1
! Deng, W., Li Y., et al. (2004). Regulation of Type III Secretion Hierarchy
of Translocator and Effectors in Attaching and Effacing Bacterial
Pathogens. Infection and Immunity
! Kaper, J. B., Puente J.L., Nataro, et al. (2004). "Pathogenic Escherichia
coli." Nat Rev Microbiol2(2): 123-140.
! Rosenshine, I., S. Ruschkowski, and B.B. Finlay. (1996). Expression of
Attaching/Effacing Activity by Enteropathogenic Escherichia coli
Depends on Growth Phase, Temperature, and Protein Synthesis upon
Contact with Epithelial Cells. Infection and Immunity. 64:966-973.