ESCUELA DE CIENCIAS DE LA SALUD

CARRERA DE TECNOLOGIA MEDICA

Dr. Jos Caamao L. Banco de Sangre I

Prueba de antiglobulina humana Directa (test de Coombs Directo)

El test de antiglobulina humana constituye el pilar fundamental de las determinaciones
inmunohematologicas. El test de antiglobulina humana Directo es empleado para demostrar
la cobertura in vivo de los glbulos rojos con globulinas, en particular IgG y C3dg.
La muestra de eleccin para el test de Coombs directo (TCD) es la sangre anticoagulada con
EDTA, ya que se previene la captacin in vitro de complemento por las clulas rojas. Los
eritrocitos lavados de pacientes o donantes son enfrentados inmediatamente con reactivos
antiglobulina humana.
Este test es til en la investigacin de anemias hemolticas autoinmunes, hemolisis inducida
por drogas, enfermedad hemoltica del recin nacido y reacciones aloinmunes de glbulos
rojos transfundidos recientemente.

Materiales: Tubos de Kahn
Micropipetas de 200 L
Pipetas plsticas
Reactivos: Suero fisiolgico
Antiglobulina humana poli-especfica

Procedimiento:
1.- Colocar 1 gota de una suspensin de glbulos rojos al 2-5% en cada tubo.
2.- Lavar los tubos tres o cuatro veces con solucin salina. Eliminar por completo el
sobrenandante final.
3.- Agregar 1 gota de suero antiglobulina humana.
4.- Centrifugar a 1.000 rpm por 1 minuto o bien 15 segundos en Low
5.- Examinar la presencia de aglutinacin. Graduar y registrar resultados

Interpretacin:

La prueba es positiva cuando se observa aglutinacin despus de la centrifugacin inmediata.








ESCUELA DE CIENCIAS DE LA SALUD
CARRERA DE TECNOLOGIA MEDICA


Dr. Jos Caamao L. Banco de Sangre I

Prueba de antiglobulina humana Indirecta (test de Coombs Indirecto, TCI)

En la prueba indirecta se incuba el suero o plasma con glbulos rojos que luego se lavan para
remover las globulinas libres. En este test usualmente se combina un antgeno o anticuerpo
conocido con plasma o clulas que tienen un componente desconocido. La aglutinacin que se
advierte cuando se aade antiglobulina humana refleja la reaccin entre los anticuerpos
sricos y los antgenos eritrocitarios. Este test se denomina indirecto ya que las clulas se unen
al anticuerpo in vitro. Las aplicaciones del TCI incluyen la deteccin e identificacin de
anticuerpos, la deteccin de antgenos y pruebas de compatibilidad.

Reactivos:
- Suero antiglobulina humana poliespecfico.
- Pool de glbulos rojos O D+, idealmente una mezcla de un R1/R1 y un R2/R2 GR I y II
comerciales para deteccin de anticuerpos irregulares
- LISS comercial o preparada en el laboratorio

Procedimiento:
1. Preparar una suspensin al 5% en solucin salina del pool de eritrocitos lavados
previamente
2. Depositar 2 gotas del suero en estudio en un tubo marcado
3. Agregar 1 gota de la suspensin del pool de eritrocitos
4. Mezclar bien e incubar durante 30 - 60 minutos a 37C
5. Mezclar y centrifugar para leer
6. Agitar suavemente y observar si existe aglutinacin. Si es dbil o negativa continuar
con el paso 7.
7. Lavar los eritrocitos 4 veces en solucin salina, despus de cada lavado eliminar tanta
solucin salina como sea posible
8. Agregar 1 gota de suero de Coombs
9. Mezclar bien y centrifugar a 1.000 rpm por 1 minuto o durante 15 seg en Low
10. Remover suavemente los eritrocitos sedimentados y observar sobre una fuente de luz
si existe aglutinacin.

NOTA: Si los eritrocitos estn suspendidos en solucin de baja fuerza inica (LISS), en lugar de
suero fisiolgico, el tiempo de incubacin se reduce a 10 - 15 minutos.

Interpretacin
Si existe aglutinacin en el paso 5 significa que en el suero en estudio existen
anticuerpos IgM. Si la aglutinacin se evidencia en el paso 10, entonces significa que el suero
estudiado presenta anticuerpos de la clase IgG que reaccionan con algn antgeno de los
eritrocitos usados






ESCUELA DE CIENCIAS DE LA SALUD
CARRERA DE TECNOLOGIA MEDICA


Dr. Jos Caamao L. Banco de Sangre I

CONTROLES
Control negativo:
A 1 gota de suspensin de eritrocitos O D+ agregar 1 gota de suero de Coombs, centrifugar y
leer

Control positivo:
A 1 gota de suspensin de eritrocitos O D+ agregar 2 gotas de suero anti-D IgG diluido si es
necesario para dar una aglutinacin de entre 1+ a 2+. Incubar durante 30 minutos a 37C, lavar
4 veces en solucin salina, agregar suero de Coombs y leer. La dilucin del suero anti-D debe
ajustarse de tal manera que no produzca aglutinacin antes de la fase antiglobulina

Uso de Clulas Control Coombs:
Es recomendable, que adems de los anteriores controles, a cada prueba que haya dado un
resultado negativo luego de agregar el suero de Coombs, se le aada 1 gota de glbulos rojos
sensibilizados con anticuerpos IgG para controlar la efectividad del lavado.

Preparacin de clulas control para el test de antiglobulina (clulas control Coombs):
Glbulos rojos O Rh D positivo se recubren con IgG anti-D de modo que den una reaccin de 2
a 3 cruces al ser agregados a la mezcla de suero antiglobulina humana (SAGH) y clulas de un
Test de coombs indirecto o directo negativo. Estos controles se agregan para demostrar que el
SAGH an est activo.

Materiales: GR O Rh (D) positivos
Anti-D (1 UI/ml) 1l anti-D= 5 UI


Mtodo:
1.- Lave los GR tres veces en salino
2.- Agregue un volumen igual de anti-D a los GR. Concentrados
3.- Incube a 37C por 30 minutos
4.- Lave los GR 4 veces. Suspenda en salino al 5%
5.- Tome un volumen de la suspensin al 5% agregue 2 volmenes de SAGH de amplio
espectro usado de rutina centrifugue y lea la aglutinacin en una fuente de luz, debera dar
una reaccin de 2 cruces (++).
6.- Estos glbulos sensibilizados pueden ser guardados a 4C por 48 horas.














ESCUELA DE CIENCIAS DE LA SALUD
CARRERA DE TECNOLOGIA MEDICA


Dr. Jos Caamao L. Banco de Sangre I

PREPARACIN DE LA SOLUCIN DE BAJA FUERZA INICA (LISS)


NaCl 1,75 g
Glicina 18 g
Agregar 20 ml de Buffer fosfato; que se prepara mezclando 11,3 ml de KH2PO4 0,15
M y 8,7 ml de Na2HPO4 0,15 M
Agregar 0,5 grs. de azida de sodio
Aforar con agua destilada a 1 lt.

El pH de esta solucin debe ajustarse a 6.7 con NaOH
































REFERENCIA
Manual Tcnico AABB, 13 Edicin, 2001.
Inmunohematology, Principles and Practice. Quinley E., 1998
Inmunohematology for Medical Laboratory Technicians. Whitlock, S., 2010.