El isoproterenol induce el estrs oxidativo vascular y la disfuncin

endotelial a travs de la va de sealizacin Gi 2-adrenrgicos

Autores: Ana P. Davel, Patricia C. Brum, Luciana V. Rossoni
Ao de publicacin: 2012
Revista indexada: PLOS ONE
Farmaco estudiado: Isoproterenol

Resumen
Objetivo: Estimulacin -adrenrgica sostenido es un sello distintivo de la hiperactividad
simptica en las enfermedades cardiovasculares. Se asocia con el estrs oxidativo y el
tono vasoconstrictor alterado. Este estudio investig el subtipo -adrenrgicos y las vas
de sealizacin implicadas en los efectos vasculares de la sobreactivacin de receptores
-adrenrgicos.
Mtodos y Resultados: Los ratones que carecen del subtipo 1 - 2 -adrenrgicos o
(1KO, 2KO) y de tipo salvaje (WT) fueron tratados con isoproterenol. Isoproterenol
aument significativamente la respuesta vasoconstrictor de la aorta a la fenilefrina en el
tipo salvaje (34 %) y los ratones 1KO (35%) pero no en ratones 2KO. La superxido
dismutasa (SOD), toxina pertussis (PTx) o PD 98059 (p-ERK media inhibidor) en
incubacin revirti la hipercontractilidad de anillos de aorta de ratones de tipo salvaje
tratados con la norma Isoproterenol ; la contraccin de la aorta de los ratones tratados
2KO - Isoproterenol no se alter. La inmunotransferencia revel aumento de la
expresin de la aorta de Gi - 3 protenas (50 %) y fosforilados ERK1 / 2 (90%).
Conclusiones: La va de sealizacin 2-adrenoceptor/Gi est implicado en la mayor
respuesta vasoconstrictora y al estrs oxidativo debido al tratamiento con Isoproterenol.
Por lo tanto la activacin de 2 -AR a largo plazo podra causar la disfuncin endotelial.

Introduccin
La activacin del sistema simptico es una caracterstica comn en las enfermedades
cardiovasculares. La activacin del receptor - adrenrgico ejerce control fisiolgico esencial
de los sistemas cardiovasculares, aumentando el gasto cardaco y la induccin de
vasodilatacin. Sin embargo, la sobreactivacin de recpetores - adrenenoceptor ( -AR )
induce una miocardiopata, en consecuencia , el bloqueo -AR mejora la funcin ventricular
izquierda y la supervivencia en pacientes con insuficiencia cardaca.
Animales tratados con los mecanismos de sealizacin asociados con la sobreactivacin del -
AR se han estudiado en el uso de isoproterenol. Se demostr que el tratamiento con
Isoproterenol induce estrs oxidativo del miocardio y la sntesis de citoquinas
proinflamatorias; estos mecanismos tambin participaron en el dao cardiaco inducido por la
estimulacin a largo plazo, tales como la hipertrofia cardiaca, necrosis y fibrosis. A pesar de la
creciente evidencia que demuestra los efectos del tratamiento del Isoproterenol sobre el
corazn, se sabe poco acerca de sus efectos sobre la vasculatura.
La hipertrofia cardiaca ha demostrado ser inducida por Isoproterenol a travs de 1 -AR. En
consecuencia, se demostr que el Isoproterenol inducido por el estrs oxidativo a travs de 1
- AR mediante la reduccin de la expresin de CuZn - SOD en miocardio de rata. Sin embargo,
el papel de 2 - AR en la patofisiologa de este modelo sigue siendo poco clara. Infusin de
Isoproterenol en ratones mejora la tasa de mortalidad y la apoptosis inducida ms en el
corazn, lo que sugiere un papel protector de 2 - AR. En contraste, el uso prolongado de los
agonistas 2 -AR fue perjudicial en los animales y los seres humanos. De acuerdo, los ratones
que sobreexpresan 2 -AR mostraron inflamacin cardaca y la insuficiencia, asociados con el
estrs oxidativo inducido NADPH oxidasa. En los vasos sanguneos, la estimulacin temprana
de 1, 2 y 3 -AR, en extensin menor o mayor, puede inducir la vasodilatacin. Aunque,
inducida por la sobreactivacin -AR conduce a estrs oxidativo y alta contractilidad vascular.
Se demostr que la 2 - AR podra indicar por la protena - subunidad tanto Gs y Gi estimular
diferentes vas de sealizacin celulares. Sin embargo, el papel individual de los subtipos de -
AR subyacentes a los efectos vasculares de la sobreactivacin - AR no se ha investigado. Por
lo tanto, el objetivo de este estudio fue investigar el subtipo de - AR implicado en los efectos
vasculares inducidos por el tratamiento de Isoproterenol, as como los mecanismos que
subyacen a estas alteraciones.
Materiales y Mtodos
Esta investigacin fue aprobado por el Comit tico de Investigacin Animal del Instituto de
Ciencias Biomdicas de la Universidad de Sao Paulo y se ajusta a las directrices para la
conducta tica en el cuidado y uso de animales establecida por la Sociedad Brasilea de
Ciencias de Laboratorio Animal.
Ratones
Ratones machos (4 meses de edad ) que carecen de 1 - 2 -DA o funcionales. Los animales se
mantuvieron en luz y oscuridad en un ciclo en un ambiente de temperatura controlada (23
C), con libre acceso a la dieta estndar de laboratorio y agua del grifo. Los ratones de tipo
salvaje fueron tratados aleatoriamente a diario con Isoproterenol ( 15 g.g - 1.da). Al final del
tratamiento, los animales se sacrificaron por decapitacin y el corazn y la aorta se retiraron y
se procesan cuidadosamente de acuerdo con los experimentos deseados. La relacin del peso
del ventrculo izquierdo a la longitud de la tibia se utiliz como un ndice de la hipertrofia
ventricular y confirm la eficacia del tratamiento del Isoproterenol en ratones.
Estudio de la reactividad vascular
Segmentos cilndricos (anillos) de la aorta torcica ( 2 mm de longitud) , libre de tejido
conectivo, se montaron en una cmara de tejido aislado. Anillos se mantuvieron a una tensin
de reposo de 0,5 g a 37 C a pH 7,4. La tensin isomtrica se registr usando un transductor
de fuerza isomtrica conectado a un sistema de adquisicin.

Despus de un periodo de equilibracin de 60 min, los anillos articos fueron para evaluar la
tensin mxima. Integridad endotelial fue probado por la relajacin inducida por acetilcolina
en anillos de aorta que se contrajeron con fenilefrina. Una respuesta de relajacin a la
acetilcolina mayor que 50 % se consider para demostrar la integridad funcional del endotelio.
Despus de un perodo de lavado, se obtuvieron curvas de concentracin-respuesta a la
fenilefrina agonista 1 - adrenrgico.
Para evaluar el papel del xido nitrico y el anin superxido en la respuesta vasoconstrictora a
la fenilefrina , algunos anillos de aorta se pre-incubaron durante 30 minutos con la xido
ntrico sintasa no selectivo ( NOS) inhibidor de ster metlico de N-nitro-L- o con la superxido
dismutasa. El control de tiempo se llevaron a cabo para cada frmaco.
Nuestros resultados demostraron que los cambios inducidos por el tratamiento del
Isoproterenol sobre la morfometra ventricular y la funcin vascular no diferan entre las cepas
C57BL/6J y FVB / N (datos no mostrados). As, en el presente estudio se utiliz la cepa
endogmica FVB / N como los ratones de tipo salvaje.
Anlisis de transferencia Western
Extracto total y protena microsomal fueron separados por electroforesis en un 10 %. Se
Analiza la dimerizacin, muestras no cocidos 40 microgramos) se resolvieron en un 6% SDS -
PAGE a 4 C. Entonces, las protenas se transfirieron a membranas de difluoruro de
polivinilideno durante la noche a 4 C. La transferencia utiliza un sistema de celda Mini Trans-
Blot que contiene 25 mmol / l de Tris, 190 mmoles / L de glicina, 20 % metanol, y 0,05 % de
SDS como se ha descrito anteriormente [ 21 ] . Despus de bloqueo de los sitios no especficos
con leche en polvo desnatada al 5% , las membranas que contienen el extracto de protena
total se incubaron durante la noche a 4 C con los siguientes anticuerpos primarios : anti- Gi -
1 , 2 de protenas , anti- Gi - 3 protenas, anti -ERK 1/2, anti-fosfato ( Thr202/Tyr204 ) - ERK1 /
2 (Sealizacin Celular ; 1 [relacin ] 1000 ) , anti- p38 MAPK ( 1 [relacin ] 1000 , Sealizacin
Celular ) , MAPK anti-fosfato ( Thr180/Tyr182 ) - p38 (Sealizacin Celular ; 1 [relacin ] 1000 ) ,
el anticuerpo anti- -actina ( 1 [ relacin ] 3000 , Sigma - Aldrich ) . Las membranas que
contienen muestras no cocidos se incubaron con anti - eNOS. Se utiliz el contenido de
protena de - actina como control interno. Las membranas que contienen protenas de la
fraccin microsomal se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios contra 1 - 2,
3 -y adrenrgicos.
Despus de lavar, las membranas se incubaron durante 2 horas con un anticuerpo IgG
conjugado con peroxidasa de acuerdo con cada anticuerpo primario utilizado. Los
inmunocomplejos se detectaron usando un sistema mejorado peroxidasa de rbano picante -
luminol quimioluminiscencia y se sometieron a autorradiografa . Seales en el inmunoblot se
cuantific con el software ImageJ.
Especies reactivas del oxgeno (ROS ) generacin
El oxidativo hidroetidina colorante fluorescente se utiliz para evaluar la produccin in situ de
especies reactivas de oxgeno. Brevemente, las secciones transversales de la aorta ( 10 micras )
obtenidos en un criostato se incubaron a 37 C durante 10 minutos con tampn de fosfato .
Tampn que contiene hidroetidina ( 5 M) se aplic tpicamente a cada seccin de tejido y los
portaobjetos se incubaron en una, cmara humidificada - protegida luz a 37 C durante 30 min
. Algunas rebanadas de aorta se incubaron con tampn que contiene fosfato de apocinina ( 30
M , 30 min ) , PEG - SOD ( 150 U / ml , 30 min ) , L-NAME ( 100 M , 30 min ) , PTx ( 0,5 mg / ml ,
1 horas ) o vehculo (agua desionizada ; controles de tiempo ) . Secciones de control negativo
recibieron el mismo volumen de tampn de fosfato sin hidroetidina . Las imgenes se
obtuvieron con un microscopio ptico equipado con un filtro de rodamina y la cmara usando
un objetivo de 20 .
El anlisis estadstico
Los resultados se expresaron como la media SEM, y N representan el nmero de ratones
utilizados en cada grupo de experimentos. Las diferencias en el rea bajo la curva de
concentracin-respuesta (AUC) en ausencia (control) y en presencia de PTx o PD 98059 se
calcularon usando el programa GraphPad Prism . Las diferencias se expresaron como un
porcentaje de la AUC del tratamiento de control correspondiente.
Los datos se analizaron mediante un ANOVA de 2 vas seguido de la correccin de Bonferroni
post- hoc o la prueba t de Student utilizando el GraphPad Prism . Las diferencias entre grupos
se consideraron significativas a P < 0,05 .
Resultados
Tratamiento de Isoproterenol para 7 das indujo un aumento significativo en el peso del
ventrculo izquierdo de los ratones de tipo salvaje (24 %) y ratones knockout 2 - AR (28 %). No
se observ aumento en los ratones knockout 1-AR. Este resultado estuvo en lnea con
estudios anteriores y confirma la capacidad de Isoproterenol para inducir hipertrofia cardiaca a
travs de la activacin de 1 -AR.

2 - AR media en el aumento de la reactividad vascular a la fenilefrina inducida por el
tratamiento de Isoproterenol.

La respuesta contrctil inducida por KCl ( 125 mM) no se modific por el tratamiento
Isoproterenol en ratas salvajes, ratones knockout 1 -AR o ratones knockout 2 -AR.
Tratamiento de Isoproterenol para 7 das mejor la respuesta vasoconstrictora inducida por
fenilefrina en las aortas de los ratones WT ( Figura 1A ) ; el efecto contrctil mxima ( Emax ) se
increment en un 33 % sin cambios significativos en la potencia . Se observaron resultados
similares en las aortas de ratones 1KO (Figura 1B ) ; ISO aumenta la Emax en un 36 %. Sin
embargo , la falta de 2 -DA funcionales impidi a los cambios causados por el Isoproterenol
en la contraccin inducida por fenilefrina , y no se observaron diferencias en la Emax entre los
grupos tratados y tratados con Isoproterenol (Figura 1C ) .


La falta de funcionalidad de 2 - AR impide el deterioro y alta produccin de anin
superxido en la aorta
La incubacin con L-NAME potenci la contraccin inducida por fenilefrina en aortas de todos
los grupos evaluados (Figura 2). En las aortas de ratones WT y 1KO, L-NAME aument la Emax
a la fenilefrina por 56 y 63 % , respectivamente ( Figura 2A y 2B ) , y en las aortas de ratones
WT y 1KO tratados con isoproterenol , L-NAME aument esta respuesta contrctil por slo el
24 y 20 %, respectivamente (figuras 2D y 2E). Hubo una reduccin en la magnitud del efecto de
L-NAME en ratones WT y 1KO tratados con isoproperenol ( L-NAME vs basal : p < 0,05 ,
ANOVA de 2 vas ; Figuras 2D y 2E ) en comparacin con el WT no tratado y grupos 1KO ( L-
NAME vs basal : p < 0,001, ANOVA de 2 vas ; Figuras 2A y 2B ) . Por lo tanto, los efectos del
isoproretrenol sobre la reactividad vascular a la fenilefrina fueron muy similares entre WT y
1KO aortas, as como los efectos de la L - NAME y la incubacin de SOD .

Anteriores datos de nuestro grupo demostraron que knockout de 2 -AR afecta la respuesta
fenilefrina en anillos de aorta. En lnea con esto, se observ que el aumento de la respuesta
fenilefrina inducida por L - NAME en aortas de no tratada fue, pero en menor magnitud a
continuacin (Figura 2A y 2C) ; y SOD redujo la respuesta contrctil a la fenilefrina en este
recipiente sin cambios en los Emax ( Figura 2C ) . El tratamiento de los ratones con 2KO ISO
no cambi la magnitud de los efectos de la L- NAME o SOD en comparacin con los no
tratados, los ratones 2KO (Figuras 2C y 2F).
Juntos, estos resultados refuerzan nuestros estudios anteriores, lo que sugiere que el
tratamiento con isoproterenol induce cambios en la reactividad vascular a la fenilefrina que
estn asociadas con el estrs oxidativo.



Expresin de los subtipos de - AR no se ve afectada por el tratamiento de isoproterenol

La fraccin de membrana de las aortas de los animales WT expresa tanto 1 - y 2 -DA,
mientras que el subtipo 3 - AR no se detect. Como era de esperar, no se observ tincin
significativa para el subtipo 2 - AR en las aortas de ratones 2KO, y 1 - AR no se detect en
las aortas de ratones 1KO (Figura 3A, 3B y 3C). ISO tratamiento no modific la expresin de la
1 - 2 - AR o en cualquier grupo, y la expresin de la protena 3 - AR no se detect (Figura
3A, 3B y 3C).

Tratamiento con isoproterenol aument significativamente la expresin de Gi - 3 protena en
las aortas de ratones WT 2K (Figura 4B) . No se encontraron cambios en Gi - 1 o -2 niveles de
protena entre los grupos (Figura 4A) . La expresin de protena total de ERK 1/2 y p38 MAPK
no fue modificada por la falta de 2 - AR o por tratamiento de isoproterenol. Sin embargo
aument la fosforilacin de ERK 1/2 en los residuos Thr202/Tyr204 ( Figura 4C ) , pero no
alter la fosforilacin de p38 MAPK ( Figura 4D ).

Implicacin de 2-AR/Gi sealizacin sobre el estrs oxidativo vascular y el aumento de la
respuesta a la fenilefrina despus del tratamiento con isoproterenol

La inhibicin de la actividad de la protena Gi con la toxina de pertussis o ERK1 / 2
fosforilacin con PD 98059 aboli el aumento de la contraccin a la fenilefrina en ratones WT
tratados con isoproterenol. A pesar de estos efectos en aortas de ratones salvajes tratados con
isoproterenol, la toxina pertussis o PD 98059 no cambi la contraccin fenilefrina en no
tratados WT (Figura 5A y 5D) o en ratones 2KO independientemente del tratamiento ISO
(Figura 5B y 5E). La diferencia en el AUC de las curvas de concentracin-respuesta a la
fenilefrina evaluados en presencia y ausencia de la toxina pertussis (Figura 5C) y PD 98059
(Figura 5F) revel la participacin significativa de protena Gi y p-ERK1 / 2 va en la respuesta
de la fenilefrina la aorta de los ratones WT tratados con la norma ISO, pero no en 2KO.

Discusin
Activacin simptica sostenida conduce a la hipertrofia miocrdica, que se considera una
caracterstica de la sobre estimulacin - AR. Esto precede a la insuficiencia cardaca,
destacando la relevancia clnica del sistema simptico. Adems, la activacin simptica
sostenida en la enfermedad cardiovascular se caracteriza por el tono vascular basal elevada y
alteracin de la biodisponibilidad del xido ntrico. Sin embargo, el mecanismo que conduce a
estas alteraciones en la vasculatura sigue siendo poco clara. En el presente estudio, mostramos
que el subtipo 2 -AR media los cambios inducidos por el isoproterenol en el tono vascular a
travs de la va Gi acoplada. Este efecto se asoci con la activacin sostenida de
desacoplamiento 2 - AR que mejora la generacin de anin superxido y por lo tanto
disminuye la biodisponibilidad de oxido nitrico.

Se sabe que la activacin aguda de -DA puede inducir vasodilatacin directamente en las
clulas del msculo liso a travs de una protena Gs / ciclasa va ciclasa / AMPc. Sin embargo
se sabe poco sobre los mecanismos asociados a los efectos de la activacin de -AR a largo
plazo en las clulas vasculares.
Produccin mejorada de anin superxido est involucrada en la patognesis y la complicacin
de muchas enfermedades cardiovasculares mediante la reduccin de la biodisponibilidad de
xido ntrico. Adems, se producen radicales peroxinitrito e hidroxilo; estos mecanismos
inducen la disfuncin endotelial. La liberacin basal de xido ntrico implicado en el control del
tono vascular se puede estimar mediante la cuantificacin del aumento en el tono vascular por
inhibidores de la NOS como L-NAME . Por lo tanto, se evalu el efecto de la incubacin con L-
NAME en la respuesta vasoconstrictora a la fenilefrina en aortas de WT, 1KO y ratones 2KO
tratados o no tratados con isoproterenol. Hemos observado que la incubacin con L-NAME
mostr efecto contrctil de menor importancia en las aortas de ratones WT y 1KO tratados
con isoproterenol en comparacin con sus respectivos grupos de control no tratados. Estos
resultados sugieren que el control del tono vascular se vio afectada por una prdida de la aorta
biodisponibilidad de xido ntrico. Sin embargo, este efecto de la L-NAME no se observ en los
ratones tratados con 2KO ISO en comparacin con los ratones no tratados. Adems, despus
de la incubacin con L-NAME, no hubo diferencias significativas en la contraccin inducida por
fenilefrina entre las aortas de todos los grupos evaluados. Juntos, estos datos sugieren que el
subtipo 2 - AR mediado el deterioro de la liberacin de NO y el tono vascular alterado que
fueron inducidos por el tratamiento de isoproterenolcrnica; mientras que el subtipo 1 -AR
no estaba involucrado.
Las parejas 2 -AR a tanto Gs y Gi protena -subunidades , estimulando distintas vas de
sealizacin. Activacin aguda de 2 -AR en las clulas endoteliales pulmonares de ratones
induce eNOS - deriva la produccin de NO a travs de la quinasa dependiente de va Gi -Scr. Sin
embargo , no se sabe si la va 2-AR/Gi est implicado en los efectos vasculares de la activacin
de - AR sostenida . Tres protenas distintas , Gi - 1 , -2 y -3 , se han clonado, y las tres
isoformas han sido implicados en la inhibicin de la adenilato ciclasa. Se observ por primera
vez que el tratamiento ISO elevado significativamente la expresin de Gi - 3 en la vasculatura
de ratones WT en una forma dependiente de la presencia de funcional vascular 2 - AR.
Se sabe que la estimulacin crnica de - AR recluta las protenas -arrestins , que juntos T
quinasas de receptores acoplados a la protena ( GRKs ) conducen a la desensibilizacin de -
adrenrgicos , facilitar la internalizacin del receptor y puede dar lugar a su degradacin o
reciclaje. Adems, -arrestins y GRKs pueden jugar un papel como molculas de sealizacin
funcin que no sea el proceso de desensibilizacin mediadoras, no podemos excluir la
hiptesis de que - arrestin est involucrado en el isoproterenol inducida por p - ERK 1/2 en el
tejido vascular, adems de la ruta de la protena Gi . Por otra parte , las alteraciones
hemodinmicas parece ser que no participan en el efecto vascular de administracin ISO
crnica, como el informe anterior han demostrado la frecuencia cardaca y la presin arterial
en WT y 2KO tratada durante varios das con ISO similares al grupo PESO tratados con
solucin salina. Es de destacar que la frecuencia cardaca basal y la presin arterial en 2KO sin
ISO no son diferentes de las de control de peso.
Hay evidencia de los beneficios clnicos potenciales de la inhibicin de sealizacin 2 -AR en
las enfermedades cardiovasculares. Importancia de esta sealizacin relacionada con este
efecto beneficioso no estaba claro porque no hay herramienta farmacolgica especfica a
disposicin de bloqueo acoplado a Gi va de sealizacin 2 - A. Entonces, los modelos
animales genticos son herramientas muy tiles para revelar la importancia funcional de esta
sealizacin.
Conclusin:
Se propone un papel central de la va 2-AR/Gi en la mediacin de los efectos adversos de la
inducida por el isoproterenol -estimulacin -AR. Mejora de p - ERK 1/2 y la eNOS plomo
desacoplamiento a la produccin de alta anin superxido y la reduccin de la
biodisponibilidad de xido nitrico, el aumento de la respuesta contrctil a la fenilefrina en la
aorta de ratn. Enfermedades prevalentes como la insuficiencia cardaca y la hipertensi son
particularmente propensos a las lesiones vasculares debido al estrs oxidativo. En vista de la
importancia central de la hiperactividad simptica en estas enfermedades cardiovasculares, la
implicacin de la va de sealizacin 2-AR/Gi efectos vasculares adversos ofrece una nueva
visin de enfoque teraputico para la mejora de la disfuncin endotelial y la biodisponibilidad
del xido ntrico.
Referencias:
Isoproterenol Induces Vascular Oxidative Stress and Endothelial Dysfunction via a Gia-
Coupled b2 -Adrenoceptor Signaling Pathway, Ana P. Davel, Patricia C. Brum, Luciana
V. Rossoni, Department of Structural and Functional Biology, Institute of Biology, State
University of Campinas-UNICAMP, Campinas, SP, Brazil. PLOS ONE March 2014,
Volume 9.








Anexo: Isoproterenol
Mecanismo de accin
Potente agonista de los receptores 1 y 2 adrenrgicos, con efectos alfa-agonista
mnimos a dosis teraputicas. Ejerce sobre el miocardio efecto inotrpico y
cronotrpico positivos. Aumenta el flujo coronario. Aumenta el gasto cardaco y el
retorno venoso. Disminuye las resistencias vasculares perifricas por relajacin de
la musculatura lisa arterial. Eleva la presin arterial sistlica por efecto inotrpico,
relaja la musculatura lisa bronquial.

Dosificacin
Asma bronquial: adultos, 10mg a 40mg/da.
Shock: 2mg se diluyen en 500ml de solucin de dextrosa a 5% y se infunden a un
ritmo de 0,5mg a 5mg/min.
Reacciones adversas
Palpitaciones, taquicardia, cefalea, rubor, dolor anginoso, nuseas, temblor,
mareos, debilidad muscular.
Tambin pueden ocurrir con frecuencia arritmias cardacas, aunque nunca han
sido graves.
Precio
Referencias
Isoproterenol, PR Vademcum.13 Edicin. E.C.S.A. Argentina. 2006.

Isoproterenol Induces Vascular Oxidative Stress and Endothelial Dysfunction via
a Gia-Coupled b2 -Adrenoceptor Signaling Pathway, Ana P. Davel, Patricia C.
Brum, Luciana V. Rossoni, Department of Structural and Functional Biology,
Institute of Biology, State University of Campinas-UNICAMP, Campinas, SP,
Brazil. PLOS ONE March 2014, Volume 9.