Prctica N1: MITOSIS Y PREPARACION DE MEDIO CULTIVO PARA Drosophila melanogaster
I. OBJETIVOS
El alumno aprender las tcnicas necesarias para poder teir y observar las distintas fases del proceso mittico. Reconocer mediante vista microscpica las distintas etapas o fases de la mitosis en clulas vegetales. Conocer la elaboracin de un medio de cultivo y llevarla a cabo para que este en ptimas condiciones para su uso. Familiarizarse con los materiales que se utilizan para hacer un medio de cultivo Aplicar los conocimientos obtenidos en el manejo de medios de cultivo y el clculo de los materiales a utilizar dependiendo de cuanto medio se necesita.
II. INTRODUCCIN
La mitosis es un proceso por el cual el material gentico (ADN) se reparte equitativamente, previa duplicacin, entre las dos clulas hijas producto de la divisin celular, es caracterstico de las clulas eucarsticas. La duplicacin de material gentico y organeros citoplasmticos tiene varias fases y para su estudio se ha dividido en: profase, metafase, anafase, telofase y citocinesis, en esta prctica identificaremos estas fases con ayuda del microscopio y mtodos de tincin, y as aprenderemos que una mitosis completa produce clulas genticamente idnticas, lo cual es el fundamento del crecimiento y la reparacin tisular. Un medio de cultivo consiste en un gel o una solucin que cuenta con los nutrientes necesarios para permitir la viabilidad de organismo o microorganismos.
III. FUNDAMENTO TEORICO MITOSIS La mitosis es el tipo de divisin celular por el cual se conservan los orgnulos y la informacin gentica contenida en sus cromosomas, que pasa de esta manera a las clulas hijas resultantes de la mitosis. La mitosis es igualmente un verdadero proceso de multiplicacin celular que participa en el desarrollo, el crecimiento y la regeneracin del organismo. Este proceso tiene lugar por medio de una serie de operaciones sucesivas que se desarrollan de una manera continua, y que para facilitar su estudio han sido separadas en varias etapas.
El resultado esencial de la mitosis es la continuidad de la informacin hereditaria de la clula madre en cada una de las dos clulas hijas. El genoma se compone de una determinada cantidad de genes organizados en cromosomas, hebras de ADN muy enrolladas que contienen la informacin gentica vital para la clula y el organismo. Dado que cada clula debe contener completa la informacin gentica propia de su especie, la clula madre debe hacer una copia de cada cromosoma antes de la mitosis, de forma que las dos clulas hijas reciban completa la informacin. Esto ocurre durante la fase S de la interfase, el perodo que alterna con la mitosis en el ciclo celular y en el que la clula entre otras cosas se prepara para dividirse. Tras la duplicacin del ADN, cada cromosoma consistir en dos copias idnticas de la misma hebra de ADN, llamadas cromtidas hermanas, unidas entre s por una regin del cromosoma llamada centrmero. Cada cromtida hermana no se considera en esa situacin un cromosoma en s mismo, sino parte de un cromosoma que provisionalmente consta de dos cromtidas. En animales y plantas, pero no siempre en hongos o protistas, la envoltura nuclear que separa el ADN del citoplasma se desintegra, desapareciendo la frontera que separaba el contenido nuclear del citoplasma. Los cromosomas se ordenan en el plano ecuatorial de la clula, perpendicular a un eje definido por un huso acromtico. ste es una estructura citoesqueltica compleja, de forma ahusada, constituido por fibras que son filamentos de microtbulos. Las fibras del huso dirigen el reparto de las cromtidas hermanas, una vez producida su separacin, hacia los extremos del huso. Por convenio cientfico, a partir de este momento cada cromtida hermana s se considera un cromosoma completo, y empezamos a hablar de cromosomas hermanos para referirnos a las estructuras idnticas que hasta ese momento llambamos cromtidas. Como la clula se alarga, las fibras del huso tiran por el centrmero a los cromosomas hermanos dirigindolos cada uno a uno de los polos de la clula. En las mitosis ms comunes, llamadas abiertas, la envoltura nuclear se deshace al principio de la mitosis y se forman dos envolturas nuevas sobre los dos grupos cromosmicos al acabar. En las mitosis cerradas, que ocurren por ejemplo en levaduras, todo el reparto ocurre dentro del ncleo, que finalmente se estrangula para formar dos ncleos separados. Se llama cariocinesis a la formacin de los dos ncleos con que concluye habitualmente la mitosis. Es posible, y ocurre en ciertos casos, que el reparto mittico se produzca sin cariocinesis (endomitosis) dando lugar a un ncleo con el material hereditario duplicado (doble nmero de cromosomas). La mitosis se completa casi siempre con la llamada citocinesis o divisin del citoplasma. En las clulas animales la citocinesis se realiza por estrangulacin: la clula se va estrechando por el centro hasta que al final se separa en dos. En las clulas de las plantas se realiza por tabicacin, es decir, las clulas hijas construyen una nueva regin de pared celular que dividir la una de la otra dejando puentes de citoplasma (plasmodesmos). Al final, la clula madre se parte por la mitad, dando lugar a dos clulas hijas, cada una con una copia equivalente y completa del genoma original. Cabe sealar que las clulas procariotas experimentan un proceso similar a la mitosis llamado fisin binaria. No se puede considerar que las clulas procariotas experimenten mitosis, dado que carecen de ncleo y nicamente tienen un cromosoma sin centrmero. [5]
Fases del ciclo celular La divisin de las clulas eucariticas es parte de un ciclo vital continuo, el ciclo celular, en el que se distinguen dos perodos mayores, la interfase, durante la cual se produce la duplicacin del ADN, y la mitosis, durante la cual se produce el reparto idntico del material antes duplicado. La mitosis es una fase relativamente corta en comparacin con la duracin de la interfase. Interfase La clula est ocupada en la actividad metablica preparndose para la mitosis (las prximas cuatro fases que conducen e incluyen la divisin nuclear). Los cromosomas no se disciernen claramente en el ncleo, aunque una mancha oscura llamada nucleolo, puede ser visible. La clula puede contener un centrosoma con un par de centriolos (o centros de organizacin de microtbulos en los vegetales) los cuales son sitios de organizacin para los microtbulos. Profase
Los dos centros de origen de los microtbulos (en verde) son los centrosomas. La cromatina ha comenzado a condensarse y se observan las cromtidas (en azul). Las estructuras en color rojo son los cinetocoros. (Micrografa obtenida utilizando marcajes fluorescenteses). Es la fase ms larga de la mitosis. Se produce en ella la condensacin del material gentico (ADN, que en interfase existe en forma de cromatina), para formar unas estructuras altamente organizadas, los cromosomas. Como el material gentico se ha duplicado previamente durante la fase S, los cromosomas replicados estn formados por dos cromtidas, unidas a travs del centrmero por molculas de cohesinas.
Uno de los hechos ms tempranos de la profase en las clulas animales es duplicacin del centrosoma; los dos centrosomas hijos (cada uno con dos centriolos) migran entonces hacia extremos opuestos de la clula. Los centrosomas actan como centros organizadores de microtbulos, controlando la formacin de unas estructuras fibrosas, los microtbulos, mediante la polimerizacin de tubulina soluble. De esta forma, el huso de una clula mittica tiene dos polos que emanan microtbulos. En la profase tarda desaparece el nuclolo y se desorganiza la envoltura nuclear. Prometafase La membrana nuclear se desensambla y los microtbulos invaden el espacio nuclear. Esto se denomina mitosis abierta, y ocurre en una pequea parte de los organismos multicelulares. Los hongos y algunos protistas, como las algas o las tricomonas, realizan una variacin denominada mitosis cerrada, en la que el huso se forma dentro del ncleo o sus microtbulos pueden penetrar a travs de la membrana nuclear intacta. Cada cromosoma ensambla dos cinetocoros hermanos sobre el centrmero, uno en cada cromtida. Un cinetocoro es una estructura proteica compleja a la que se anclan los microtbulos. Aunque la estructura y la funcin del cinetocoro no se conoce completamente, contiene varios motores moleculares, entre otros componentes. Cuando un microtbulo se ancla a un cinetocoro, los motores se activan, utilizando energa de la hidrlisis del ATP para "ascender" por el microtbulo hacia el centrosoma de origen. Esta actividad motora, acoplada con la polimerizacin/despolimerizacin de los microtbulos, proporcionan la fuerza de empuje necesaria para separar ms adelante las dos cromtidas de los cromosomas. Cuando el huso crece hasta una longitud suficiente, los microtbulos asociados a cinetocoros empiezan a buscar cinetocoros a los que anclarse. Otros microtbulos no se asocian a cinetocoros, sino a otros microtbulos originados en el centrosoma opuesto para formar el huso mittico. La prometafase se considera a veces como parte de la profase. Metafase A medida que los microtbulos encuentran y se anclan a los cinetocoros durante la prometafase, los centrmeros de los cromosomas se congregan en la "placa metafsica" o "plano ecuatorial", una lnea imaginaria que es equidistante de los dos centrosomas que se encuentran en los dos polos del huso. Este alineamiento equilibrado en la lnea media del huso se debe a las fuerzas iguales y opuestas que se generan por los cinetocoros hermanos. El nombre "metafase" proviene del griego que significa "despus." Dado que una separacin cromosmica correcta requiere que cada cinetocoro est asociado a un conjunto de microtbulos (que forman las fibras cinetocricas), los cinetocoros que no estn anclados generan una seal para evitar la progresin prematura hacia anafase antes de que todos los cromosomas estn correctamente anclados y alineados en la placa metafsica. Esta seal activa el checkpoint de mitosis Anafase Cuando todos los cromosomas estn correctamente anclados a los microtbulos del huso y alineados en la placa metafsica, la clula procede a entrar en anafase (del griego que significa "arriba", "contra", "atrs" o "re-"). Entonces tienen lugar dos sucesos. Primero, las protenas que mantenan unidas ambas cromatidas hermanas (las cohesinas), son cortadas, lo que permite la separacin de las cromtidas. Estas cromtidas hermanas, que ahora son cromosomas hermanos diferentes, son separados por los microtbulos anclados a sus microtbulos al desensamblarse, dirigindose hacia los centrosomas respectivos. A continuacin, los microtbulos no asociados a cinetocoros se alargan, empujando a los centrosomas (y al conjunto de cromosomas que tienen asociados) hacia los extremos opuestos de la clula. Este movimento parece estar generado por el rpido ensamblaje de los microtbulos. Estos dos estadios se denominan a veces anafase temprana (A) y anafase tarda (B). La anafase temprana viene definida por la separacin de cromtidas hermanas, mientras que la tarda por la elongacin de los microtbulos que produce la separacin de los centrosomas. Al final de la anafase, la clula ha conseguido separar dos juegos idnticos de material gentico en dos grupos definidos, cada uno alrededor de un centrosoma. Telofase La telofase es la reversin de los procesos que tuvieron lugar durante profase y prometafase. Durante la telofase, los microtbulos no unidos a cinetocoros continan alargndose, estirando an ms la clula. Los cromosomas hermanos se encuentran cada uno asociado a uno de los polos. La membrana nuclear se reforma alrededor de ambos grupos cromosmicos, utilizando fragmentos de la membrana nuclear de la clula original. Ambos juegos de cromosomas, ahora formando dos nuevos ncleos, se descondensan de nuevo en cromatina. La cariocinesis ha terminado, pero la divisin celular an no est completa. Citocinesis La citocinesis es un proceso independiente, que se inicia simultneamente a la telofase. Tcnicamente no es parte de la mitosis, sino un proceso aparte, necesario para completar la divisin celular. En las clulas animales, se genera un surco de escisin (cleavage furrow) que contiene un anillo contrctil de actina en el lugar donde estuvo la placa metafsica, estrangulando el citoplasma y aislando as los dos nuevos ncleos en dos clulas hijas. Tanto en clulas animales como en plantas, la divisin celular est dirigida por vesculas derivadas del aparato de Golgi, que se mueven a lo largo de los microtbulos hasta la zona ecuatorial de la clula. En plantas esta estructura coalesce en una placa celular en el centro del fragmoplasto y se desarrolla generando una pared celular que separa los dos ncleos. El fragmoplasto es una estructura de microtbulos tpica de plantas superiores, mientras que algunas algas utilizan un vector de microtbulos denominado ficoplasto durante la citocinesis. Al final del proceso, cada clula hija tiene una copia completa del genoma de la clula original. El final de la citocinesis marca el final de la fase M. Consecuencias de la mitosis Mediante el proceso mittico, el material gentico se divide en dos ncleos idnticos, con lo que las dos clulas hijas que resultan si se produce la divisin del citoplasma (ver citocinesis) sern genticamente idnticas. Por tanto, la mitosis es un proceso de divisin conservativo, ya que el material gentico se mantiene de una generacin celular a la siguiente. La mayor parte de la expresin gnica se detiene durante la mitosis, pero mecanismos epigenticos funcionan durante esta fase, para "recordar" los genes que estaban activos en mitosis y transmitirlos a las clulas hijas.
MEDIO DE CULTIVO Un medio de cultivo consiste en un gel o una solucin que cuenta con los nutrientes necesarios para permitir (bajo condiciones favorables de pH y temperatura) el crecimiento de microorganismos, clulas o incluso pequeas plantas. Segn qu se quiera hacer crecer, el medio requerir unas u otras condiciones. Generalmente se presentan desecados en forma de polvo fino o granular antes de ser preparados, al prepararse podemos encontrarlos en estado slido, semislido y lquido. El objetivo ltimo del cultivo es variado: antibiograma, identificacin, multiplicacin... Segn sus cualidades fsicas distinguimos: Lquidos Semi-slidos Slidos Segn su formulacin: Qumicamente definidos: se conoce exactamente la cantidad de cada uno de los compuestos que hay en el medio. Complejos: se realizan a partir de extractos naturales (extracto de levadura, sangre,...). Por tanto, no se conoce exactamente cul es la composicin del medio. Sin embargo, presenta la ventaja de que ya estn presentes todos o casi todos los elementos que una clula puede requerir. Segn su uso: Selectivos: permiten seleccionar el crecimiento de una especie o grupo determinado (hongos, bacterias entricas, protozoos...). Diferenciales: permiten identificar una especie o grupo por su crecimiento diferencial en este medio. De enriquecimiento: son medios diseados para permitir el crecimiento del mximo nmero de especies posible. Pueden usarse, por ejemplo, para estudiar todos los microorganismos presentes en una muestra. Mnimo: contienen la mnima cantidad de nutrientes posible que permite el crecimiento de una especie. De transporte: est preparado para servir de almacenamiento temporal a especmenes transportados. manteniendo su viabilidad y su concentracin.
IV. MATERIALES Y REACTIVOS
Mitosis Cebolla con races Bistur Estilete Luna de reloj Mechero Pinzas de madera Vial Mascarillas Fijador carnoy Carmn actico Microscopio
Medio de Cultivo Cocina Olla Cuchara Frascos de vidrio Gasa Algodn Papel kraff Pabilo Tijera Estufa u autoclave Azcar blanca Levadura Agar Acido propinico V. PARTE EXPERIMENTAL
MITOSIS Previamente debemos tener nuestra cebolla con races de unos 2 a 3 centmetros, luego seleccionamos una de las races y con ayuda del bistur cortamos una de las puntas (2 mm), exactamente la zona meristemtica.
Luego con ayuda del estilete colocamos los fragmentos de la raz cortada en un vial conteniendo fijador Carnoy y por el tiempo de 30 minutos.
Pasados los 30 minutos sacamos las muestras de races y las colocamos en una luna de reloj que tenga unas gotas de carmn actico
y llevamos al calor del mechero hasta que entre en ebullicin por espacio de 15 segundos. Esperando siempre que salga vapor.
Retire el fragmento de raz con una pinza de punta fina y colquela sobre un porta objetos y agrguele una gota de carmn actico.
Tape la preparacin con una laminilla cubre objetos, y sobre esta ponga un papel absorbente. Presione el cubre objetos con la yema del dedo pulgar y luego con la extremidad plana de un lpiz y presionar un poco mas fuerte hasta convertir el material del porta objetos en una capa delgada (squash). al realizar esta operacin, tenga cuidado para no romper el cubre objetos.
Limpie el exceso de colorante del porta objetos con papel higinico y lleve el preparado al microscopio para su observacin a menor y mayor aumento. Identifique las diferentes fases de la divisin celular, analice, explique y esquematice.
MEDIO DE CULTIVO
Previamente nuestros frascos de vidrio deben estar my bien lavados con ayuda de una escobilla y detergente, se enjuagan con agua limpia y se dejan secar boca abajo.
A cada frasco le haremos un tampn a base de algodn y gasa
Colocamos los tampones y ponemos una cubierta de papel kraff, amarramos con pabilo y llevamos a esterilizar.
En tanto se esterilizan los frascos, vamos preparando el medio de cultivo. Y empezamos pesando los materiales que a vamos a utilizar para hacer 600 ml de medio. (12 gr de agar, 12 gr de levadura, 18gr de azcar blanca, 3ml de acido propionico)
12 gr de levadura 18 gr de azcar blanca
Procedemos a preparar el medio, en uan olla agregamos el agua y los materiales ya pesados y revolvemos hasta q se disuelva todo.
Por ltimo agregamos el acido propionico y llevamos a enfriar poniendo la olla en agua fra, vertemos nuestro medio de cultivo en los frascos de vidrio ya esterilizados.
III. RESULTADOS
MITOSIS Al llevar nuestros porta objetos con las muertas ya preparadas y observar al microscopio pudimos identificar las siguientes fases:
Profase Temprana Profase Tarda Metafase
Anafase Tardia Telofase Tardia Citocinesis
MEDIO DE CULTIVO
Concluida la prctica obtenemos nuestros medios de cultivo ya listos en los cuales vamos a mantener nuestras moscas Drosophilas.
IV. CONCLUSIONES
Las clulas meristemtica de las races se encuentran en contante divisin y multiplicacin lo que nos permite apreciar las diferentes etapas o fases de la mitosis. Para poder apreciar las fases de la mitosis es necesario teir las clula y llevarlas por un proceso que nos permita contrastar sus ncleos. La mitosis es un proceso complejo que consta de varias fases, pero para su estudio se ha dividido en nueve fases muy marcadas. Los medios de cultivo son esenciales para poder hacer viable le desarrollo de organismo y microorganismos. El medio de cultivo debe estar libre de contaminacin y poseer los nutrientes necesarios para la alimentacin de nuestro cultivo.
V. REFERENCIAS
De Robertis, Eduardo / Hib, Jose / Ponzio, Roberto BIOLOGA CELUALR Y MOLECULAR de De Robertis Duodcima edicin Editorial El Ateneo Argentina
Pierce, Benjamn GENETICA Un Enfoque Conceptual Segunda edicin Editorial Medica Panamericana 2006 Espaa.