ELECTROFORESIS

Isoelectroenfoque
(Tambin se llama enfoque isoelctrico o IEF, de isoelectrofocusing). Se trata de una variante de
electroforesis en la que el gel (poliacrilamida) posee un gradiente de pH fijado en su estructura. Esto se
consigue incluyendo en su preparacin molculas ionizables con valores de pK diferentes. Como
consecuencia, al avanzar los componentes de la muestra a lo largo del gel se encuentran en entornos de pH
diferente, y eventualmente alcanzan una regin en la cual el pH es igual al punto isoelctrico de la molcula
muestra y, en consecuencia, sta detiene su avance. Se alcanza, pues, un equilibrio y se consigue la
separacin de los componentes de la muestra de acuerdo con su punto isoelctrico, que adems se puede
medir, pues se conoce el gradiente de pH del gel.


Electroforesis bidimensional
Tras realizar una primera separacin su resultado se somete a otra de diferente mecanismo en direccin
perpendicular. Generalmente la primera es un isoelectroenfoque en un gel cilndrico estrecho que luego se
coloca como muestra para una SDS-PAGE. Se obtienen as mapas complejos de bandas, muy caractersticos
de cada muestra, cuya utilidad principal es la comparacin con el obtenido de otra muestra similar pero
conocida.

Low pH: exceso de H+
High pH: exceso de OH-


Determinacin de la masa molecular
Como se ha indicado, se puede obtener una estimacin de la masa molecular (en kDa) de protenas
empleando SDS-PAGE, y de fragmentos de DNA (en pb) empleando electroforesis en agarosa. En ambos
casos, en uno de los pocillos del gel se carga una mezcla de molculas patrn de tamao conocido, con el fin
de poder trazar la curva de calibrado. Para las protenas, la validez del dato obtenido depende de que la
desnaturalizacin con SDS haya sido completa y de que se hayan separado las subunidades gracias a la
reduccin con mercaptoetanol; adems, la presencia de oligosacridos en las glicoprotenas altera la
movilidad, que ya no proporciona valores de masa molecular fiables.
Se aplica en uno de los pocillos del gel una mezcla de fragmentos de DNA de tamao conocido,
denominados patrones, marcadores de masa molecular o escalera de DNA (DNA ladder). Tras su
separacin en la electroforesis, se revelan y se representa para todas las bandas la movilidad (distancia
avanzada o, mejor, cociente entre sta y el avance del frente de electroforesis) frente al logaritmo del
tamao (longitud en pb). Sobre la recta ajustada se interpolan las distancias de avance de las muestras
problema, calculando as su tamao en pb.

En este ejemplo, los patrones empleados son fragmentos bien conocidos, aquellos obtenidos a partir
del DNA del virus por la accin de las endonucleasas de restriccin EcoRI e HindIII.