Microbiologa de los alimentos.

MAESTRA EN CIENCIA Y
TECNOLOGA DE LOS ALIMENTOS.
1
Enfoques de la Microbiologa de alimentos:
- Buenas prcticas durante la manufactura.
- ETAS.
- Ensayos de laboratorio.
- Microorganismos utilizados en produccin.
2
3
Nutricin Microbiana

Composicin celular: Prcticamente la totalidad de la
masa celular esta formada por sustancias con 4 tipos de
tomos: C, N, O, e H.

Nutriente: Productos qumicos exteriores a partir de los
cuales se Construye una clula.

Clasificacin de los nutrientes
A) Macronutrientes: Requeridos en grandes cantidades.
B) Micronutrientes: Requeridos en pequeas cantidades.
5
Nutricin microbiana y nutrientes
Nutrientes son los elementos qumicos y/o molculas que necesitan las clulas
para llevar a cabo el metabolismo y todas sus funciones vitales.
Nutricin es el conjunto de procesos que le permiten a la clula incorporar nutrientes.
Vitamin
as
Cofactor

Sales
Hidratos de carbono
Protenas
Lpidos
cidos nucleicos


Agua
Requerimientos de nutrientes de las clulas
Macronutrientes: C, H, O, N, P, S
Micronutrientes: K
+
, Mg
++
, Fe
++
, Ca
++
Oligonutrientes: Co
++
, Mn
++
, Cu
++,
Zn
+

Facrtores de crecimiento (vitaminas, otros)
6
Crecimiento de poblaciones

Velocidad de crecimiento: Es el cambio en el nmero de
clulas o masa celular por unidad de tiempo.

Tiempo de generacin (g): Es el tiempo requerido para que
a partir de una clula se formen dos, o sea es el tiempo
requerido para que se duplique una poblacin (variable).

Frecuencia de duplicacin (k): Es la inversa de g (k= 1/g).

Nmero de generaciones (n): Es el nmero de veces que la
clula se ha multiplicado en un perodo de tiempo.
7
8
Crecimiento microbiano
Las bacterias se dividen por fisin binaria, y el
crecimiento de la poblacin es exponencial
Divisin por fisin binaria en
bacterias
9
10
11
12
13
14
CURVA DE CRECIMIENTO
Cada m.o tiene su propia dinmica de crecimiento
y su propio tiempo de duplicacin
El tiempo de duplicacin cambia si se modifica el
ambiente (se retrasa si las condiciones son adversas,
se acelera si son favorables)
El lmite est dado por su gentica
En la fase exponencial (a) se puede determinar el
tiempo en el cual la poblacin se duplica
a
Organismo
Temp.
(C)
Tiempo de
duplicacin (hs)
BACTERIAS
Escherichia coli 37 0,28
Bacillus subtilis 40 0,43
Pseudomonas putida 30 0,75
Mycobacterium tuberculosis 37 6
Treponema pallidum 37 34
LEVADURAS
Saccahromyces cerevisiae 25 2
E. coli a 37 C en condiciones ptimas
se duplica cada 20 min.
Al inicio -------------------- 10.000 clulas
A los 20 min. ------------- 20.000 clulas
A los 40 min. ------------ 40.000 clulas
A 18 hs. -------------------- ????
Requieren distintos tiempos
de incubacin en el laboratorio
15
Medicin del crecimiento

El crecimiento de una poblacin microbiana se mide siguiendo los cambios en el
nmero de clulas o el peso de la biomasa celular.


Mtodos a) Recuento total de clulas.
b) Recuento de clulas viables (Rto. en placa).
Recuento total de clulas

Es un mtodo rpido pero poco sensible

Limitaciones:

- Clulas muertas.
- Clulas pequeas.
- Habilidad del operador.
- Suspensiones celulares poco densas.


16
17
18

NUTRICIN BACTERIANA
19

Metabolismo Bacteriano
20
21
Metabolismo microbiano
Toda clula realiza a lo largo de la vida procesos metablicos
METABOLISMO
=
ANABOLISMO
+
CATABOLISMO
22
Reacciones de degradacin
(Catabolismo)
Comp. Orgnicos
(Fuentes de C y E)
Reacciones de sntesis
(Anabolismo)
E Q
Molculas
orgnicas
simples
Hidratos de carbono
Protenas
Lpidos
cidos nucleicos
Otras molculas
A
M
B
I
E
N
T
E
C
E
L
U
L
A
Deshechos
metablicos
E
(Calor)
Esquema simplificado de metabolismo (quimioheterotrofo)
23
Fuente de carbono
CO
2
Materia orgnica
Fuentes de energa
Lumnica
Materia orgnica o inorgnica
Organismos
Fototrofos
Quimiotrofos
Organismos
Autotrofos
Heterotrofos
Fuente de hidrgeno/e
-
Inorgnico
Orgnico
TI POS METABOLI COS EN LOS MI CROORGANI SMOS
Organismos
Litotrofos
Heterotrofos
Las posibles combinaciones son varias
Los compuestos orgnicos e inorgnicos usados son muchsimos
GRAN DIVERSIDAD METABOLICA EN EL MUNDO MICROBIANO
24
Todos
los organismos
Fototrofos
(energa de la luz)
Quimiotrofos
(energa de compuestos
qumicos)
Heterotrofos
(C de compuestos
orgnicos)
Autotrofos
(C del CO
2
)
Heterotrofos
(C de compuestos
orgnicos)
Litotrofos
(H/e de compuestos
inorgnicos)

Organotrofos
(H/e de compuestos
orgnicos)

Los protozoos, los hongos y muchas bacterias (incluidas la inmensa
mayora de las bacterias patgenas) son quimioheterotrofos.
25
Otras fermentaciones
lctica, actica, acetobutlica, etc.
RESPIRACION ANAEROBIA (Ej: reduccin de nitratos)
Glucosa Nitrato Nitrito Dixido de carbono Energa
C
6
H
12
O
6
+ NO
3
-
NO
2
-
+ 6 CO
2
+ Energa
Otros aceptores de H/e-
SO
4
2-
; CO
2
; Fe
2+
FERMENTACION Ej:fermentacin alcohlica
Glucosa Etanol Dixido de carbono
C
6
H
12
O
6
2 C
2
H
6
O + 2 CO
2
+ Energa
RESPIRACION AEROBIA
Glucosa Oxgeno Agua Dixido de carbono
C
6
H
12
O
6
+ 6 O
2
6 H
2
O + 6 CO
2
+ Energa
Principales vas metablicas generadoras de energa de los quimioheterotrofos
Todas las bacterias
Utilizan otros H de C adems de la glucosa (lactosa, sacarosa, maltosa, etc.)
Muchas bacterias
Tienen al menos 2 posibilidades (respiracin aerobia/fermentacin;
respiracin anaerobia/fermentacin; etc.
Tienen otras vas para generar energa a partir de protenas, lpidos
26

REGULACION DEL METABOLISMO
27
28
29
- Temperatura
- [H
+
]
- Actividad de agua (a
w
)
- Potencial de xido-reduccin
- Nutrientes
- Sustancias inhibidoras.
30
31
Temperatura (C)
Grupo
Termfilos
Mesfilos
Psicrfilos
Psicrtrofos
Mnima
40-45
5-15
(-5) 5
(-5) 5
ptima
55-75
30-45
12-15
25-30
Mxima
60-90
35-47
15-20
30-35
32
Efectos de las bajas temperaturas: Enfriamiento y refrigeracin.
Los efectos de la refrigeracin dependen de:
- La temperatura y tiempo de almacenamiento.
- Las caractersticas fisiolgicas de los microorganismos.
Mesfilo
Psicrfilo
33
-Las bajas temperaturas tienen efectos en las floras mixtas.
- Se deben evitar las fluctuaciones de temperatura en el almacenamiento.

Adaptacin fisiolgica a las bajas temperaturas:
- Modificaciones morfolgicas.
- Alteracin de actividades enzimticas.
- Alteracin de la composicin lipdica.

Efectos de las temperaturas bajas sobre patgenos e indicadores:
Salmonella spp: No crece a temp < 6 C.
Clostridium perfringens: Rango ptimo: 15-50 C. Clulas vegetativas sensibles
a las bajas temperaturas y pH.
Staphylococcus aureus: Soporta bajas temperaturas y crece hasta 7 C.
Produccin de toxinas a temperaturas mayores a 10 C
34
35
Efectos de la congelacin:
- Detiene el crecimiento de los microorganismos.
- Las respuestas de los microorganismos a la congelacin son variables.
- Los esporos son resistentes.
- Los organismos superiores son ms sensibles, por lo cual puede utilizarse la
congelacin para destruirlos.

Lesiones subletales: Los microorganismos lesionados pueden recuperarse
luego de la descongelacin.

Supervivencia de los microorganismos a la congelacin:
- Las bacterias Gram (+) (Bacillus spp, Clostridium spp, Lactobacillus spp,
Staphylococcus spp, Micrococcus spp y Streptococcus spp) son ms
resistentes que los microorganismos Gram (-).
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37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
Oxgeno
Organismo Relacin con el O
2
Patologa
Bacillus cereus Aerobio estricto Gastroenteritis
Salmonella spp. Anaerobio facultativo Gastroenteritis
Clostridium perfringens Anaerobio estricto Gangrena
Campylobacter jejuni Microaerfilo Diarrea
Jarra de anaerobiosis
51
52
+ 525: Agua embotellada
+ 625: Agua corriente
53
54
55
LOS MI CROORGANI SMOS Y
SU I MPORTANCI A COMO
AGENTES DE DETERI ORO DE
LOS ALI MENTOS.
56
57
Deterioro o alteracin: Comprende todo cambio que los convierte
a los alimentos en inadecuados para el consumo. (Lmite???).

Causas de alteracin:
1- Ataque de insectos.
2- Lesiones fsicas por golpes, presiones, congelacin, deshidratacin y
radiacin.
3- Actividad de enzimas tisulares autctonas de vegetales y animales.
4- Cambios qumicos no producidos por los microorganismos ni por las
enzimas autctonas, generalmente est involucrado el oxgeno (rancidez).
5- Microorganismos, sobre todo bacterias, levaduras y mohos.
58
Alimentos:

-No alterables (ej: harinas).
-Semialterables (ej: manzanas).
-Alterables (carnes).

Metabiosis: Sucesiones de poblaciones microbianas.

Alteracin: Se produce fundamentalmente por el predominio de una o
dos cepas, una porcin muy baja con respecto a la flora inicial.

Alteracin de origen microbiano (alimentos crudos): Se necesitan
por lo menos 10
8
bacterias/g de alimento.

Los alimentos procesados por calentamiento son deteriorados por
poblaciones con resistencia trmica.
59
Alteracin de carnes frescas:
-Contaminacin: Durante los procesos de muerte, evisceracin y despiece.
-La contaminacin inicial se produce en la superficie de corte (10
3
-10
5
ufc/cm
2
),
luego el aporte de la sangre de las vsceras contamina los tejidos profundos.

-Reservas de glucgeno: El estrs antes de la muerte (excitacin, fatiga,, hambre)
reduce los niveles de glucgeno ( cido lctico tras la muerte).

-Potencial redox (PR): O
2
> PR, generando un medio reductor que favorece
el crecimiento de los microorganismos anaerobios (Clostridium putrefasciens).
(> Enfriar la carne antes de la disminucin del PR).

-Velocidad de enfriamiento: El enfriamiento rpido previo al rigor mortis produce
el acortamiento por el fro (carne dura).
60
Efecto de la temperatura de almacenamiento:
61
Efecto de las temperaturas de almacenamiento:
-Alteracin a temperaturas tibias: a 20 C sufren putrefaccin. Si aumenta la
relacin rea/volumen, aumenta el PR, y desarrolla una flora miscelnea,
fundamentalmente por bacilos mesfilos, anaerobios facultativos, Gram (-).

-Alteracin en condiciones de fro: A < 20 C, se favorece la flora psicrtrofas,
y va siendo progresivamente dominadas por Pseudomonas (hasta > 95%).

- Alteracin en condiciones de refrigeracin: A < 5 C se observa una fase de
latencia. En los ltimos estadios, la flora alterativa est dominada por
Pseudomonas (aerobios, superficies), fundamentalmente de los tipos no
fluorescentes. No hay crecimiento de clostridios, y por lo tanto no tiene lugar la
putrefaccin. La desecacin de las superficies favorece el desarrollo fngico:

-Florecido o barbillas: Mucor, Rhizopus, micelos blanco-gris.
-Manchas negras: Producidas por el gnero Cladosporium.
-Penicillium y Cladosporium: producen manchas amarillas-verdes.
-Manchas blancas: Producidas por Sporotrichum carnis.
62
Prediccin de la vida til:
-Basndose en experiencias previas, predecir la posibilidad de
que el microorganismo especfico se encuentre en el alimento.

-Produccin a escala piloto, seguida de almacenamiento, anlisis
microbiolgico y de aceptacin organolptica (sabor y olor).

-Microbiologa predictiva: Aspecto todava en desarrollo.
63
Alteraciones de hortalizas y frutas:
Frutas: Se produce fundamentalmente por hongos (pH < 4,5).
Hortalizas (pH 5-7): Producida por hongos y bacterias (Erwinia y Pseudomonas).
64
65
Alteracin de carnes envasadas al vaco:
La permeabilidad de los materiales de envasado a los gases es muy variable,
afectando la vida til y las caractersticas alterativas de la carne envasada.
66
Carnes frescas: Pelculas permeables al oxgeno (mioglobina oxigenada).
Carnes curadas: Pelculas impermeables al oxgeno para impedir que
empalidezca el color a consecuencia de la oxidacin. Tambin para la
distribucin se usan impermeables al oxgeno.
- Los materiales de envasado son ms impermeables al oxgeno que al CO
2
.
- Las bacterias lcticas y las levaduras son mucho ms resistentes a los niveles
altos de CO
2
, por lo que es de esperar que aparezcan en la alteracin
caracterstica de las carnes envasadas.
67
Alteracin de las carnes de aves:
- Despus del enfriamiento preliminar los recuentos microbianos de la piel y de
la cavidad abdominal de las aves varan en el rango 5.10
3
-10
5
/cm
2
; y < 10
4
/cm
2
.

- Flora alterante (a 4 C): Pseudomonas, Acinetobacter y Alteromonas.
68
Alteracin de pescados y mariscos:
Recuentos: 10
3
-10
5
ufc/cm
2
(piel), 10
3
-10
4
/g (branquias o agallas),
10
2
-10
9
/mL de contenido entrico. ( contaminacin de las aguas, y
manipulacin).

Flora predominante: psicrtrofa (aguas fras) o mesfila (clidas).

Conservacin: Hielo generalmente contaminado (10
3
ufc/mL agua).

Alteracin: Fundamentalmente por enzimas de Pseudomonas, es
relativamente rpida, por la flora inicial, y por el pH elevado que
tienen muchas especies.

Manipulacin: (ej. Fileteado) incrementa la flora mesfila.
69
Alteracin de productos lcteos:
Leche cruda:
-Contaminacin inicial: 5.10
3
-5.10
4
ufc/mL.
-Flora inicial: Pseudomonas, Acinetobacter/Moraxella, Flavobacterium,
Micrococcus, Streptococcus, Corynebacterium, Lactobacillus y coliformes.
-Alteracin: Por psicrtrofos (Pseudomonas) productores de proteasas y lipasas,
termorresistentes.

Leche pasteurizada:
-Streptococcus termophilus y E. faecalis; Micrococcus spp,, Microbacterium
spp y Bacillus (esporas).

Crema y manteca:
-La alteracin (generalmente por pseudomonadaleses) es ms rpida a > a
w
.
(Iniciadores: Streptococcus lactis, S. cremoris).

Quesos:
- Alteracin: Penicillium, Candida, Pseudomonas, Enterobacter, Clostridium.
70
Alteracin de huevos y ovoproductos:
La conalbmina (ovotransferrina) es el antimicrobiano ms
importante de las claras, actuando sobre bacterias Gram (+) y (-).
71
72
Alteracin de productos derivados de cereales:
Entre los mohos, Penicillium, Aspergillus y Rhizopus.

Entre las bacterias, Bacillus es el grupo dominante.
73
74
MTODOS MS DI FUNDI DOS
PARA EL ANLI SI S
MI CROBI OLGI CO DE
ALI MENTOS.
75
Muestreo, transporte y
conservacin de muestras.
76
Planes de muestreo:
- Son diseos que indican el nmero de unidades a ser recolectadas de cada
lote, y el criterio a ser aplicado para aceptar o rechazar el lote.
- Un plan de muestreo simple es aquel en el que el lote es juzgado en
funcin de un conjunto de unidades de la muestra.
- Un plan de muestreo doble (mltiple) es una inspeccin de muestreo, en la
cual la inspeccin de la primera muestra permite tomar la decisin de
aceptar, rechazar, o tomar una segunda muestra. La inspeccin de esta
segunda muestra, cuando fuera requerida, permite tomar la decisin de
aceptar o rechazar el lote.
- Planes de muestreo secuencial, son aquellos en los que las unidades de
muestra son tomadas una por una (o en grupos), y la extraccin en una etapa
del proceso determina si el lote se debe acepar, rechazar, o se deben tomar
ms muestras.
77
Planes de muestreo
78
Programas de atributos de dos clases:
79
Programas de atributos de tres clases:
- Tienen dos lmites microbiolgicos que crean tres clases de productos.
- Son importantes para los casos en los que la eleccin del lmite es dificultosa.
80
81
Programas de atributos mltiples:
- El lote es aceptado o rechazado en funcin de decisiones secuenciales.
82
83
Recoleccin de las muestras:
- Para la recoleccin de muestras es necesario considerar el estado fsico del
producto, y la naturaleza de los microorganismos a analizar, de forma tal
que el nmero de unidades de la muestra sea representativo del lote.
84
- Material lquido a granel: Transferencia asptica de una muestra
representativa del lote a un recipiente estril. Homogeneizar el lote antes de
la toma de muestras (tomar varias muestras de distintas partes del lote). Los
recipientes contenedores deben ser llenados hasta 3/4 de su volumen total
(Se debera remitir un recipiente control). Registrar la temperatura a la que
se encuentra el lote. Refrigerar inmediatamente las muestras.

- Slidos o semislidos a granel: La toma de muestras debera hacerse con
dispositivos recolectores especiales, cucharas, esptulas.

- Productos congelados a granel: Las muestras se toman con instrumental
especial para perforar alimentos congelados. El material debe conservarse
congelado hasta la llegada al laboratorio. Evitar congelar-descongelar varias
veces.
85
86
87
88
89
- Productos elaborados: Las muestras deberan ser tomadas del
contenedor original, no abierto, del mismo lote de procesamiento.
Registrar informacin de procesamiento y cdigos de productos en
formularios.

- Alimentos slidos o lquidos en proceso de produccin: Posible
automatizacin de las tomas de muestras durante el pasaje del
alimento por cintas trasnportadoras o tneles.
90
Almacenamiento y transporte de las muestras:
- Cuando sea necesario almacenar las muestras antes de llevarlas al
laboratorio, se necesitarn reas de congelacin y de refrigeracin.
- Las muestras deben ser remitidas al laboratorio tan pronto como sea posible.
- Registrar las condiciones, hora y fecha de arribo de la muestra al laboratorio.
- El laboratorio debera tener notificacin previa del arribo de muestras
(nmero, tipo de alimento, microorganismos posibles, etc).
- Los alimentos en polvo o enlatados no necesitan refrigeracin durante el
transporte.
- Puede utilizarse hielo seco, evitando la congelacin de las muestras por
contacto.
91
92
Preparacin de homogenatos:
- Para muestras congeladas, se recomienda la descongelacin en baos trmicos.
- Es importante conocer la masa de alimento que homogeneizamos?
- En general, utilizamos una proporcin 1:10 (alimento:diluyente).


Equipamiento:

-Stomacher.
-Homogeneizacin manual.


Soluciones utilizadas:

-Agua peptonada 0,1 %
-Buffer fosfatos de Butterfield.
-NaCl 3%
93
94
Microorganismos con metabolismo daado:
-Cuando los microorganismos son sometidos a estrs ambiental, por
ejemplo al calor y a la congelacin subletales, algunas de las clulas
experimentan un dao en su metabolismo, dando como resultado su
incapacidad para formar colonias en medios selectivos.

-Si un cultivo ha experimentado dao metablico se puede determinar
sembrndolo en medios selectivo y no selectivo. Las colonias que se
forman en el medio no selectivo representan tanto a las clulas no daadas
como a las daadas, mientras que solamente las clulas no daadas se
desarrollan en el medio selectivo.

-En caso de sospechas de metabolismo daado, debemos incluir procesos
de recuperacin metablica antes del anlisis.
95
Mtodos de anlisis microbiolgico de alimentos:

Ninguno de los mtodos de uso corriente permite la determinacin del nmero exacto de
microorganismos presentes en un alimento.

-Recuento microscpico directo.
-Recuento en placas.
-Mtodo del Nmero ms probable (NMP).
-Filtracin y posterior siembra posterior en medios apropiados.
-Reduccin de colorantes.
-Examen microbiolgico de superficies:
-a) Mtodo de la torunda / torunda enjuagado.
-b) Placa de contacto.
-c) Jeringa de agar.
96
Recuento microscpico directo:
97
Recuento en placas:
98
99
100
101
Mtodo del Nmero
ms probable (NMP):
102
103
Filtracin y posterior siembra posterior en medios apropiados:
104
Reduccin de colorantes:
Reductasas: Tiempo de decoloracin de Azul de metileno.

- Son un ndice de contaminacin de la leche.
- Se encuentran aumentadas en leches sucias o mal
conservadas.
- 20 mL de leche + 5 gotas Azul de metileno 0,025 g %, 37 C.
Tiempo de decoloracin

Clasificacin

N prob. de bacterias/mL

Ms de 10 horas

Leches hervidas



Ms de 7 horas

Buena

< 10
5


Entre 2 y 7 horas

Regular

10
5
-3x10
6


Entre 15 min y 2 horas

Mala

3x10
6
-2x10
7


Menos de 15 min

Muy mala

> 2x10
7


105
Examen microbiolgico de superficies:
-a) Mtodo de la torunda / torunda enjuagado.
Torunda de alginato
de calcio
Disolucin del alginato
de calcio con
hexametafosfato sdico.
106
Examen microbiolgico de superficies:
-b) Placa de contacto.
107
Examen microbiolgico de superficies:
-c) Jeringa de agar.
- Tiene esencialmente el mismo fundamento que el mtodo de la placa de
agar.
- La superficie de agar contactada con la superficie a estudiar se extrae y
se incuba en una placa de Petri estril.
- Desventajas: Diseminacin de las colonias, y posibilidad de ser
utilizada en aquellos casos en los que el nmero de microorganismos
contaminantes de la superficie es escaso.
108
Mtodos fsicos, qumicos,
e inmunolgicos.
109
Mtodos fsicos:
Impedancia:

- Cuando los microorganismos crecen en medios de cultivo, metabolizan
sustratos de baja conductividad en productos de mayor conductividad y de este
modo reducen la impedancia (resistencia al paso de corriente elctrica) de los
medios.

Microcalorimetra:

- Es el estudio de los cambios de calor insignificantes. La produccin de calor
que se determina est relacionada ntimamente con las actividades catablicas
de las clulas.

Citometra de flujo:
- Determina los componentes (clulas) y las caractersticas de cada una de las
clulas en suspensin lquida. Las clulas suspendidas una por una son llevadas
a un detector por medio de un conducto de flujo, determinando las trayectorias
y las velocidades con las que las clulas atraviesan el detector.
110
Mtodos qumicos:
Nucleasa termoestable:
- Existe una estrecha correlacin entre la produccin de coagulasa y de
nucleasa termoestable (DNAsa) por las cepas de Staphylococcus aureus, en
especial por las cepas productoras de enterotoxina. LOD de nucleasas: 10
5

10
6
clulas. LOD de enterotoxina: > 10
6
clulas bacterianas.

Lisado de Limulus para la investigacin de endotoxinas:
- El LPS, formado por endotoxinas, es pirgeno y responsable de algunos de los
sntomas que acompaan a las infecciones producidas por bacterias Gram (-).
- Esta prueba emplea una protena lisada obtenida de las clulas de la hemolinfa
del cangrejo de herradura (Limulus poliphemous). La presencia de
endotoxinas en el homogenato del alimento origina la produccin de un gel
del material del lisado incubados durante una hora a 37 C.
111
Determinacin del ATP:

- El ATP es la principal fuente de energa de las clulas vivas. Desaparece en un
tiempo de 2 horas despus de la muerte celular, y la cantidad por clula
generalmente es constante.
- En presencia de ATP, el sistema luciferina-luciferasa de la lucirnaga emite
luz, que puede ser medida con un luminmetro.
- Desventaja: Se debe eliminar el ATP de origen no microbiano (centrifugacin
de homogenatos, pasaje por resinas de intercambio catinico, recoleccin de
bacterias en filtros de poros de 0,22 m).

Radiometra:

- Se cuantifican los niveles de
14
CO
2
sintetizados por los microorganismos
(aerobios o anaerobios), el cual fue producido por el metabolismos de
nutrientes marcados con
14
C.
112
113
Sustratos fluorognicos y cromognicos:
114
Inmunoglobulinas: IgG
F
ab
F
ab
F
c
115
Variabilidad en la secuencia de la inmunoglobulina:
V

a

r

i

a

b

i

l

i

d

a

d

Residuo
El dominio amino terminal de cada una de las cadenas livianas y pesadas es
ms variable e incluye, en cada una de las cadenas, tres segmentos de entre 7 y
12 aminocidos que son hipervariables.
116
Inmunofluorescencia:
Mtodos inmunolgicos:
117
ELISA:
118
RIA:
119
Inmunodifusin radial doble:

Inmunodifusin radial simple:
120
Columnas de inmunoafinidad.
121
Separacin inmunomagntica:
122
123
Mtodos moleculares
124
125
- Estn basados en la discriminacin de organismos especficos de agentes
cercanamente relacionados, en funcin de las secuencias de ADR o ARN
caractersticas de cada uno.
- Todos los mtodos genticos utilizados para la deteccin de patgenos
estn basados en la hibridizacin de cidos nucleicos (ADN o ARN) del
microorganismo en estudio, con un ADN diagnstico o probe.
- La diferencia entre los distintos mtodos, radica en las estrategias para
detectar los hbridos de cidos nucleicos formados.
- Los pasos iniciales, comunes para todos los mtodos, son la lisis celular y
la purificacin de los cidos nucleicos, para que puedan participar de la
hibridacin.
Caractersticas comunes de los distintos mtodos:
126
Hibridizacin estndar de probes:
- En la forma ms simple, se utiliza un ADN probe marcado, el cual hibridiza con un
cido nucleico en a muestra.
- Las diferencias principales entre los distintos mtodos consisten en si el ADN probe
y el cido nucleico target estn, uno o ambos, e solucin; y en el mecanismo de
deteccin del ADN probe hibridizado.
127
ADN probes:
- Pueden contener cientos de nucletidos, aunque los ms frecuentes
contienen 15-30 nucletidos (probes oligonucetidos).
- La especificidad del ensayo de hibridizacin depende fundamentalmente
de la secuencia de nucletidos del ADN probe, pero tambin es afectada
por otras condiciones de reaccin (temperatura de hibridizacin, fuerza
inica, etc.).
- En trminos generales, para ADN probes ms largos, se reduce la
temperatura de hibridacin y/o se aumenta la concentracin salina.
- En general, la sensibilidad de esta metodologa est alrededor de 10
5
10
7
clulas, por lo que se requiere un enriquecimiento selectivo previo.
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Hibridacin eficiente:
129
Hibridacin poco eficiente:
130
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Mtodos de deteccin de los hbridos:
-Son similares a las estrategias usadas en los ensayos inmunolgicos.
-Protocolos:
A- Directos
B- Indirectos: La flexibilidad, seguridad, simplicidad de conservacin
de los mtodos indirectos los han convertido
en los ms popularmente usados.
-Estrategias:
A- Interaccin biotina-avidina*
B- Interaccin digoxigenina-antidigoxigenina*
C- Interaccin fluorescena-antifluorescena*

* FAL
* POD
Sustratos: Cromognicos, quimioluminicentes.
132
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Hibridizacin:
- Las diferencias entre las formas de hibridizacin estn dadas por la cintica de
formacin del hbrido probe-target, y por el mecanismo utilizado para separar el
ADN probe no unido, de los hbridos.
- La inmobilizacin del probe o del cido nucleico target, antes de la
hibridizacin, permite la remocin de manera simple del ADN probe no unido.
- Los soportes slidos utilizados comunmente para inmobilizar cidos nucleicos
son las membranas (nylon, nitrocelulosa, partculas de polmeros).
- Histricamente, los formatos de fase slida ms utilizados han sido el Southern
blot, y dot blot, en los cuales el cido nucleico target son inmobilizados en las
membranas luego de una separacin mediante electroforesis (Southern blot); o
a partir de una solucin (dot blot, slot blot).
- Las hibridizaciones sandwich presentan mayor sensibilidad que las
hibridizaciones simples.
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Hibridacin en soportes: Dot-blot y Slot-blot
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Hibridacin colony-blot:
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- Las hibridizaciones en solucin, en las que el ADN probe y el cido
nucleico target estn libres en solucin, ofrecen mejores cinticas de
reaccin, debido a que ambas molculas pueden difundir libremente.
- Las hibridizaciones ocurren en tiempos menores.
- Desventajas: Dificultad para separar los hbridos.
- Solucin: Incorporacin de nucleasas de cadena simple. (Destruccin
del ADN probe no unido).
- La captura de los hbridos se produce por una modificacin de la
hibridizacin sandwich.
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Hibridacin en medios lquidos:
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Mtodos basados en amplificacin de cidos nucleicos:
- Presentan mayor sensibilidad que los mtodos mencionados
anteriormente.
- No se requiere pre-enriquecimiento de las muestras.
- Hasta la actualidad, para la deteccin de patgenos transmitidos por
alimentos, slo se han utilizado mtodos que involucran la
amplificacin de cidos nucleicos mediante la Reaccin en Cadena de
la Polimerasa (PCR).
- Estos mtodos se realizan fundamentalmente en laboratorios de
investigacin.
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Thermus aquaticus, denominada tambin Thermophilus aquaticus, es una
bacteria termfila que vive en la proximidad de las fuentes de agua caliente. La
Thermus aquaticus fue descrita por Thomas Brock en 1969. Es una bacteria
gram-negativa, aerobia y hetertrofa.
Esta bacteria vive a temperaturas comprendidas entre 50 y 80 C, debido a que
su cctel enzimtico resiste tales condiciones.
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Deteccin de los productos de la amplificacin:
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