Streptomyces Clavuligerus

1
E ES ST TU UD DI IO O D DE E L LA A F FE ER RM ME EN NT TA AC CI I N N D DE E
S ST TR RE EP PT TO OM MY YC CE ES S C CL LA AV VU UL LI IG GE ER RU US S: : P PR RO OD DU UC CC CI I N N
E EN N C CO ON NT TI IN NU UO O D DE E C CI ID DO O C CL LA AV V L LA AN NI IC CO O E EN N U UN N
R RE EA AC CT TO OR R A AG GI IT TA AD DO O

I In ng g. . Q Qu u m mi ic ca a. . N Na at th ha al li ia a A An nd dr re ea a G G m me ez z G Gr ri im ma al ld do os s

C Co or rp po or ra ac ci i n n A Ac ca ad d m mi ic ca a y y A Am mb bi ie en nt ta al l
G Gr ru up po o d de e B Bi io op pr ro oc ce es so os s

U Un ni iv ve er rs si id da ad d d de e A An nt ti io oq qu ui ia a
M Me ed de el ll l n n
2 20 01 13 3
2

E ES ST TU UD DI IO O D DE E L LA A F FE ER RM ME EN NT TA AC CI I N N D DE E
S ST TR RE EP PT TO OM MY YC CE ES S C CL LA AV VU UL LI IG GE ER RU US S: : P PR RO OD DU UC CC CI I N N
E EN N C CO ON NT TI IN NU UO O D DE E C CI ID DO O C CL LA AV V L LA AN NI IC CO O E EN N U UN N
R RE EA AC CT TO OR R A AG GI IT TA AD DO O

I In ng g. . Q Qu u m mi ic ca a. . N Na at th ha al li ia a A An nd dr re ea a G G m me ez z G Gr ri im ma al ld do os s

T Tr ra ab ba aj jo o d de e i in nv ve es st ti ig ga ac ci i n n p pa ar ra a o op pt ta ar r e el l t t t tu ul lo o d de e
M Ma ag g s st te er r e en n B Bi io ot te ec cn no ol lo og g a a

A As se es so or r
I In ng g. . Q Qc co o. . J Ju ua an n C Ca ar rl lo os s Q Qu ui in nt te er ro o D D a az z. . P Ph hD D, , M M. .S Sc c. .
C Co o- -a as se es so or ra a
I In ng g. . Q Qc ca a. . C Cl la au ud di ia a P Pa at tr ri ic ci ia a S S n nc ch he ez z H He en na ao o. . M M. .S Sc c

C Co or rp po or ra ac ci i n n A Ac ca ad d m mi ic ca a y y A Am mb bi ie en nt ta al l
G Gr ru up po o d de e B Bi io op pr ro oc ce es so os s

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M Me ed de el ll l n n
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6

CONTENIDO
Pgina
NOMENCLATURA .......................................................................................................... 13
CONSTANTES y VARIABLES ....................................................................................... 14
RESUMEN ......................................................................................................................... 17
ABSTRACT ....................................................................................................................... 19
1. INTRODUCCIN ......................................................................................................... 20
2. MARCO TERICO ...................................................................................................... 24
2.1 Salud pblica y enfermedades infecciosas ................................................................. 24
2.2 Resistencia microbiana ............................................................................................... 25
2.3 Antibiticos .................................................................................................................. 27
2.4 Produccin de cido clavulnico ................................................................................ 29
2.4.1 Fermentacin en lote .............................................................................................. 31
2.4.2 Fermentacin en continuo ...................................................................................... 33
2.5 Modelacin cintica y simulacin de la produccin de AC ..................................... 34
3. OBJETIVOS .................................................................................................................. 41
3.1. Objetivo General ...................................................................................................... 41
3.2. Objetivos Especficos .............................................................................................. 41
4. METODOLOGA .......................................................................................................... 42
4.1 Microorganismo ........................................................................................................... 43
4.2 Medio de cultivo .......................................................................................................... 43
4.2.1 Control de contaminacin ...................................................................................... 43
4.2.2 Medio de cultivo para mantenimiento y activacin de cepas ................................ 43
4.2.3 Medios de cultivo para produccin de AC ............................................................ 43
4.3 Fermentacin ............................................................................................................... 44
4.3.1 Cultivo en lote ........................................................................................................ 45
4.3.1.1 Determinacin de coeficientes de transferencia de oxgeno ........................... 45
4.3.1.2 Obtencin de rendimientos tericos ................................................................ 48
4.3.2 Cultivo en continuo ............................................................................................... 49
4.4 Mtodos Analticos ..................................................................................................... 51
4.4.1 Anlisis de determinacin de biomasa ................................................................... 51
4.4.2 Viabilidad del microorganismo y control de contaminacin ................................. 53
4.4.3 Determinacin de glicerol ...................................................................................... 54
4.4.4 Determinacin de fosfato ....................................................................................... 55
4.4.5 Determinacin de nitrgeno ................................................................................... 56
4.4.6 Determinacin de cido clavulnico ...................................................................... 58
4.4.7 Reproducibilidad y replicacin de los experimentos ............................................. 59
4.5 Determinacin de la cintica de fermentacin .......................................................... 59
4.6 Modelado ...................................................................................................................... 59
4.7.1 Modelado de la cintica en una fermentacin en lote ............................................ 67
4.7.2 Estimacin de parmetros ...................................................................................... 70
4.7.3 Anlisis estadstico ................................................................................................ 73
4.7.4 Simulacin de la cintica en una fermentacin en continuo .................................. 74
4.7.5 Anlisis de sensibilidad de los parmetros ............................................................ 77
5. RESULTADOS Y DISCUSIN .................................................................................. 80
7

5.1 Cultivo en lote ........................................................................................................... 80
5.1.1 Cultivo en matraz ................................................................................................... 80
5.1.2 Cultivo en biorreactor ............................................................................................ 83
5.1.2.1 Determinacin de K
L
a y Q
O2
........................................................................... 83
5.1.2.1 Cinticas obtenidas en el biorreactor .............................................................. 87
5.1.2.1 Obtencin de rendimientos tericos ................................................................ 92
5.3 Cultivo en continuo ................................................................................................... 93
5.4 Modelado y simulacin ............................................................................................. 95
5.4.1 Modelado de la cintica de fermentacin en lote .................................................. 95
5.5.2 Simulacin de la cintica de fermentacin en continuo. ..................................... 113
5.5.3 Anlisis de sensibilidad de los parmetros estimados ......................................... 115
5.5.4 Utilidad del Ajuste y del modelo en un proceso por lote ..................................... 122
5.5.5 Utilidad del Ajuste y del modelo en un proceso en continuo .............................. 122
6. CONCLUSIONES ....................................................................................................... 124
7. IMPACTOS .................................................................................................................. 126
8. RECOMENDACIONES ............................................................................................. 128
9. BIBLIOGRAFIA ......................................................................................................... 129

8

LISTA DE FIGURAS
Pgina
Figura 1. Estructura qumica de los antibiticos -lactmicos. Surez y Gudiol (2009) ... 29

Figura 2. Comparacin entre datos simulados y experimentales en: a) medio peptona
y b) medio Samprosoy. Baptista y colaboradores (2000). ................................................... 35

Figura 3.Comparacin entre datos experimentales obtenidos desde un cultivo
continuo y los valores simulados de un modelo cintico propuesto por Baptista y
colaboradores (2005) ........................................................................................................... 37

Figura 4. Ilustracin del montaje del biorreactor en quimiostato en operacin. ................ 50

Figura 5. Curva de calibracin para la determinacin de biomasa en medio TSB. ........ 52

Figura 6. Curva de calibracin para la determinacin de DNA en medio complejo.......... 53

Figura 7. Imagen de la bacteria Sc en microscopio (x 40); ................................................ 53

Figura 8. Curva de calibracin para determinacin de glicerol por espectrofotometra. ... 54

Figura 9. Curva de calibracin para determinacin de la fuente de fosfato por
espectrofotometra ............................................................................................................... 55

Figura 10. Curva de calibracin para determinacin de la fuente de amonio por
espectrofotometra. .......................................................................................................... 56

Figura 11. Curva de calibracin para determinacin de asparagina por HPLC ................. 57

Figura 12. Curva de calibracin para determinacin de cido clavulnico por HPLC ...... 58

Figura 13. Diagrama de flujo de la secuencia del proceso de Modelamiento
matemtico, anlisis de regresin y validacin del modelo planteado. ............................... 60

Figura 14. Diagrama de bloques del sistema. ..................................................................... 61

Figura 15. Diagrama del sistema en vista transversal. ....................................................... 61

Figura 16. Diagrama de flujo de informacin. ................................................................... 62

Figura 17. Cultivo en matraz con el Medio Gly-NH
4
, cintica en lote de Streptomyces
clavuligerus. 80

Figura 18. Cultivo en matraz con el Medio Gly-Asn, cintica en lote de Streptomyces
clavuligerus. ........................................................................................................................ 81
9

Figura 19. Cultivo en matraz con el Medio Gly-HS, cintica en lote de Streptomyces
clavuligerus. ........................................................................................................................ 81

Figura 20. Clculo de tiempo de respuesta del electrodo de oxgeno. ............................... 84

Figura21.Clculo de Q
O2
por la tcnica dinmica, datos de la etapa de desgasificacin. .. 85

Figura 22. Clculo del a K
L
por la tcnica dinmica empleando los datos de la etapa
de gasificacin. .................................................................................................................... 86

Figura 23. Cintica en biorreactor operando en lote con medio Gly-Asn. X: Biomasa;
Gly: Glicerol; AC: cido clavulnico; FP: Fuente de fsforo; Asn: Fuente de
nitrgeno y OD: oxgeno disuelto. ...................................................................................... 87

Figura 24. Validacin de la cintica en biorreactor operando en lote con medio Gly-
Asn. X: Biomasa; Gly: Glicerol; AC: cido clavulnico; FP: Fuente de fsforo; L-
Asn: Fuente de nitrgeno y OD: oxgeno disuelto. ............................................................. 90

Figura 25. Modelo tipo Monod de la cintica de consumo de sustrato, formacin de
biomasa y produccin de cido clavulnico en matraz, medio Gly-NH
4
. ........................... 97

Figura 26. Relacin identidad de los datos de cido clavulnico experimentales en
matraz vs. los datos de cido clavulnico simulados, medio Gly-NH
4,
modelo tipo
Monod. ................................................................................................................................. 97

biomasa y produccin de cido clavulnico en matraz, medio Gly-Asn. ........................... 98

matraz vs. los datos de cido clavulnico simulados, medio de produccin Gly-Asn,
modelo tipo Monod. ............................................................................................................ 99

biomasa y produccin de cido clavulnico en matraz, medio Gly-HS . .......................... 100

matraz vs. los datos de cido clavulnico simulados, medio de produccin Gly-HS,
modelo tipo Monod. .......................................................................................................... 100

Figura 31. Modelo tipo Contois de la cintica de consumo de sustrato, formacin de
biomasa y produccin de cido clavulnico en matraz, medio Gly-NH
4
. ......................... 102

matraz vs. los datos de cido clavulnico simulados, medio Gly-NH
4
............................. 103
10

biomasa y produccin de cido clavulnico en matraz, medio Gly-Asn. ......................... 104

matraz vs. los datos de cido clavulnico simulados, medio de produccin Gly-Asn. ..... 104

biomasa y produccin de cido clavulnico en matraz, medio Gly-HS. ........................... 105

matraz vs. los datos de cido clavulnico simulados, medio Gly-HS. .............................. 106

Figura 37. Validacin del modelo tipo Monod de la cintica de consumo de sustrato,
formacin de biomasa y produccin de cido clavulnico en biorreactor, medio Gly-
Asn. .................................................................................................................................... 109

biorreactor vs. los datos de cido clavulnico simulados, medio de produccin Gly-
Asn, modelo tipo Monod .................................................................................................. 110

Figura 39. Simulacin de la cintica en la fermentacin de Streptomyces clavuligerus
en biorreactor operando en continuo en rgimen estacionario. .......................................... 115

Figura 40. Anlisis de sensibilidad del parmetro
max
medio Gly-Asn en lote. .............. 116

s
K
medio Gly-Asn en lote. ................ 117

s x
Y
medio Gly-Asn en lote. ................. 117

p x
Y
medio Gly-Asn en lote. ................ 117

Figura 44. Anlisis de sensibilidad del parmetro medio Gly-Asn en lote. .................. 118

d
k
medio Gly-Asn en lote. .................. 118

Figura 46. Anlisis de sensibilidad, medio Gly-Asn en continuo.
max
como
parmetro perturbado. ......................................................................................................... 120

s
K como parmetro
perturbado. .......................................................................................................................... 120

11

s x
Y
como parmetro
perturbado. .......................................................................................................................... 121

p x
Y
como parmetro
perturbado. .......................................................................................................................... 121

Figura 50. Anlisis de sensibilidad, medio Gly-Asn en continuo. como parmetro
perturbado. .......................................................................................................................... 121

Figura 51. El modelo en lote donde se maximiza la concentracin final de cido
clavulnico. ......................................................................................................................... 122

Figura 52. Prueba del modelo en continuo con una concentracin inicial de sustrato. ..... 123

12

LISTA DE TABLAS
Pagina
Tabla 1. Valores de los parmetros estimados, con un 95% de nivel de confianza,
utilizado para la simulacin de un proceso de produccin de cido clavulnico en
medio con peptona y Samprosoy 90N .

35
Tabla 2. Valores de los parmetros del modelo cintico obtenido utilizando los
datos experimentales de un cultivo continuo ...

36
Tabla 3. Valores de parmetros experimentales del cultivo de Streptomyces
clavuligerus en matraz con los tres medios utilizados .

81
Tabla 4. Valores de parmetros experimentales del cultivo en lote con el medio
Gly-Asn en biorreactor .

87
Tabla 5. Valores de algunos parmetros de la fermentacin en lote en biorreactor

90
Tabla 6. Valores de variables del cultivo en continuo en el biorreactor .

92
Tabla 7. Valores de las velocidad de formacin, consumo y produccin obtenidos
en el cultivo en continuo en el biorreactor ..

93
Tabla 8. Caractersticas del proceso de estimacin de parmetros en cinticas en
lote

95
Tabla 9. Parmetros cinticos estimados del cultivo en matraz, con el modelo tipo
Monod empleando un mtodo de regresin mltiple no lineal

100
Tabla 10. Parmetros cinticos estimados del cultivo en matraz, con el modelo tipo
Contois, empleando un mtodo de regresin no lineal

105
Tabla 11. Parmetros cinticos del cultivo fermentacin en biorreactor operando en
lote, con modelo tipo Monod ...

109
Tabla 12. Valores de sensibilidad promedio de las variables en el modelo en lote

114
Tabla 13. Parmetros ms relevantes del anlisis de sensibilidad

115
Tabla 14. Parmetros ms importantes del anlisis de sensibilidad al proceso
simulado en continuo ...

118

13

NOMENCLATURA

AC: cido clavulnico
AMM: Asociacin Mdica Mundial
ATCC: Coleccin americana de cultivos tipo (American Type Culture Collection)
AFM: Anlisis de flujo metablico
CBM: Concentracin bactericida mnima para eliminar el 99.9% de los microorganismos
viables.
CECT: Coleccin espaola de cultivos tipo
CMI: Concentracin mnima del antimicrobiano que inhibe el crecimiento celular.
CSTR: Reactor de tanque agitado en continuo
DDASSL: Rutina para resolver sistema de ecuaciones diferenciales y algebraicas, con un
modelo de regresin aplicable a problemas de altos grado de complejidad y con
pocos datos disponibles, fue creado por L. R. Petzold, para Laboratorios SANDIA
NATIONAL en 1982, por sus siglas en ingles (Drug Design And Semi-Supervised
Learning).
DNA o ADN: cido desoxirribonucleico
EDA: Enfermedades diarreicas agudas
HPLC: Cromatografa lquida de alta eficiencia
IRA: Infecciones respiratorias agudas
Lys: Lisina
Medio Gly-Asn: Medio de produccin glicerol y L-Asparagina
Medio Gly-HS: Medio de produccin glicerol y harina de soya
Medio Gly-NH
4
: Medio de produccin glicerol y cloruro de amonio
NRRL: Coleccin de cultivos ARS (Agricultural Research Service)
OD
600
: Densidad ptica leda a una longitud de onda de 600 nm
OMS: Organizacin mundial de la salud
OTR: Velocidad de transferencia de oxgeno
OUR: Velocidad de consumo de oxgeno
PBP: Protenas fijadas o fijadoras de las penicilinas, su sigla es en ingles as Penicillin
Binding Proteins, son receptores enzimticos, implicados en la fase final de la
formacin de la pared celular y reorganizar la pared celular durante el crecimiento
y la divisin celular.
Sc: Streptomyces clavuligerus
TSB: Caldo de Triptona-Soya, es un caldo de cultivo especfico para Sc (Iniciales en
ingls)
vvm: Unidad utilizada para referenciar el flujo de aire suministrado a un biorreactor,
volumen de aire/volumen de medio/minuto con unidades (L/L/m)

14

CONSTANTES y VARIABLES

S: Concentracin del sustrato (g de S/L)
X: Concentracin de la biomasa (g de X/L)
P: Concentracin del producto (mg de P/L)
(t): Funcin de paso que tiene valor de 0 o 1.
:
i
N Velocidad de agitacin (rpm)
: OD Oxgeno disuelto (%)
tip
v : Velocidad de la punta del impeler (m/s)
dt
dM
: Cambio en el contenido de masa en el sistema con respecto al tiempo (g/L.h)
dt
dX
: Cambio de la concentracin de la X con respecto al tiempo (g de X/L.h)
dt
dS
: Cambio de la concentracin de la S con respecto al tiempo (g de S/L.h)
dt
dP
: Cambio de la concentracin de la P con respecto al tiempo (mg de P/L.h)
dt
dY
: Vector de las derivadas parciales de Y
b

: Vector de las derivadas parciales de los cuadrados residuales con respecto a los
parmetros
y : Funcin que se deriva matemticamente para encontrar la tendencia de los resultados
g : Vector de funciones derivables
x : Variable independiente
b : Vector de parmetros en las ecuaciones a derivar y que se estiman por medio de
regresin de mnimos cuadrados
: Suma de los cuadrados de los residuales en el mtodo de regresin
b : Vector corregido o estimado de b por medio de un mtodo de regresin
i
M
: Caudal msico que entra al reactor (g/L)

f
M
: Caudal msico que sale del reactor (g/L)

G
R : Velocidad msica de generacin de materia por reaccin.
C
R : Velocidad msica de consumo de materia por reaccin.
x
r : Velocidad volumtrica de crecimiento (g X/L.h)
d
r : Velocidad volumtrica de muerte celular (g X/L.h)
s
r : Velocidad volumtrica de consumo o utilizacin del sustrato (g S/L.h)
p
r : Velocidad volumtrica de formacin de metabolito secundario (mg P/L.h)
s x
Y : Rendimiento de biomasa a partir de sustrato (g de X/g de S)
15

p x
Y : Rendimiento de biomasa a producto (g de X/mg de P).
s p
Y : Rendimiento de formacin de producto a partir del consumo de sustrato (mg de P/g de
S)
: Velocidad especfica de crecimiento del microorganismo (h
-1
)
max
: Velocidad mxima especfica de crecimiento del microorganismo (h
-1
)
1 max
: Velocidad mxima especfica de crecimiento del microorganismo en el medio con

glicerol y Samprosoy en el modelo tipo Contois de Baptista y colaboradores (2005) (h
-
1
)
2 max
: Velocidad mxima especfica de crecimiento del microorganismo en el medio con

glicerol y peptona en el modelo tipo Contois de Baptista y colaboradores (2005) (h
-1
)
d
k : Constante de muerte del microorganismo (h
-1
)
dp
k
: Constante de degradacin del producto en el modelo de Baptista y colaboradores
(2005) (h
-1
)
1 S
C
: Valor de la concentracin inicial de la fuente de nitrgeno en el modelo de Baptista y
colaboradores (2000) (g/L)
2 S
C
: Valor de la concentracin inicial de la fuente de carbono en el modelo de Baptista y
colaboradores (2000) (g/L)
0 X
C
: Valor de la concentracin inicial del inoculo Funcin de paso en el modelo de Baptista
y colaboradores (2000) que hace que la solucin numrica de la ecuacin cintica del
consumo de sustrato sea cero entre las 18-36 horas.
: Productividad de cido clavulnico respecto a la biomasa (mg/g.h)
F : Flujo de la corriente de entrada o salida de materia hacia o desde el reactor (L/h)
s
K : Constante de Monod o constante de saturacin para el sustrato limitante (g S/L)
1 X
K
: Constante de Contois o constante de saturacin de glicerol y peptona (g S/g X)
2 X
K
: Constante de Contois o constante de saturacin de glicerol y Samprosoy (g S/g X)
1
: Relacin entre la velocidad de crecimiento celular y la velocidad de consumo de
glicerol en el modelo de Baptista y colaboradores (2005) (g S/g X)
2
: Relacin entre la velocidad de crecimiento celular y la velocidad de consumo de la
fuente de nitrgeno en el modelo de Baptista y colaboradores (2005) (g N/g X)
m: Coeficiente de mantenimiento por el glicerol en el modelo de Baptista y colaboradores
(2005) (g S/g X.h)
. Ec : Ecuacin
D: Velocidad de dilucin, la cual es igual al flujo de alimentacin o de salida sobre el
volumen de trabajo en el biorreactor (h
-1
).
a K
L
: Coeficiente de transferencia de oxgeno de la fase lquida por el rea interfacial
lquido-gas (h
-1
)
:
* *
2
O
C C = Solubilidad del oxgeno o la concentracin de oxgeno en el medio de cultivo en
equilibrio con la fase gas a condiciones de laboratorio (mg O
2
/L)
16

OD L
C C
O
=
2
: Concentracin de oxgeno disuelto en el medio de cultivo (mg O
2
/L)
2
O
Q : Velocidad especfica de consumo de oxgeno (mg O
2
/g X.h)
( ) T t E
'
: Valor de lectura de electrodo de oxgeno sin retraso por el tiempo de respuesta
( ) t E : Valor de lectura de electrodo de oxgeno con retraso por el tiempo de respuesta
T : Tiempo muerto del electrodo (s)
e
k : Constante inversa al tiempo de respuesta del electrodo de oxgeno disuelto (s
-1
)
F : Caudal msico de entrada y/o salida del biorreactor (g/L.h)
: Tiempo medio de residencia del medio de cultivo en el biorreactor (h)
r
: Tiempo de respuesta del electrodo de oxgeno disuelto (h)
d
t : Tiempo de duplicacin del microorganismo (h)
f
t : Tiempo de fermentacin (h)
V : Volumen de trabajo en el biorreactor (L)
p : Nmero de puntos experimentales o magnitudes de la variable independiente en la cual
hay valores experimentales de X, S y P.
s : Varianza
ij
y : Variables dependientes
J : Matriz Jacobiana de las derivadas parciales de Y
' J : Transpuesta de la matriz Jacobiana de las derivadas parciales de Y
i
n : Nmero de experimentos repetidos para cada punto de la variable independiente
y : Valor de la media de cada grupo de valores de las variables dependientes
experimentales
i
y : Valores calculados o estimados para cada una de las variables dependientes
*
ij
y : Valores experimentales de cada una de las variables dependientes
k : Nmero de parmetros estimados o por estimar
gl
: Grados de libertad totales
I : Matriz identidad diagonal
: Factor de escala que da un tamao de paso en las iteraciones del mtodo de regresin

R
2
: Coeficiente de correlacin de un ajuste a datos experimentales, acotado entre 0 y 1,
donde un valor de 1 significa ajuste perfecto.

3

4

D De ed di ic ca at to or ri ia as s

E Es st te e t tr ra ab ba aj jo o d de e i in nv ve es st ti ig ga ac ci i n n e es st t d de ed di ic ca ad do o c co on n
t to od do o m mi i c ca ar ri i o o y y a am mo or r a a m mi i e es sp po os so o e e h hi ij ja a, , p po or r s su u
a ap po oy yo o, , a ay yu ud da a y y p po or r e es st ta ar r s si ie em mp pr re e a a m mi i l la ad do o. .

A A m mi is s h he er rm ma an no os s, , d de e q qu ui ie en n s si ie em mp pr re e r re ec ci ib b a ap po oy yo o
y y m mu uc ch ha a a ad dm mi ir ra ac ci i n n d de e s su u p pa ar rt te e, , l le es s d de ed di ic co o l la a
m me et ta a a al lc ca an nz za ad da a, , c co om mo o u un n t tr ri iu un nf fo o m m s s l lo og gr ra ad do o
e en n n nu ue es st tr ra as s v vi id da as s. .

A Ag gr ra ad de ec ci im mi ie en nt to os s

D Du ur ra an nt te e l la a e ej je ec cu uc ci i n n d de e e es st te e t tr ra ab ba aj jo o, , r re ec ci ib b a ap po oy yo o e ec co on n m mi ic co o d de el l g gr ru up po o d de e
i in nv ve es st ti ig ga ac ci i n n d de e B Bi io op pr ro oc ce es so os s, , a ad ds sc cr ri it to o a a l la a F Fa ac cu ul lt ta ad d d de e I In ng ge en ni ie er r a a d de e l la a
U Un ni iv ve er rs si id da ad d d de e A An nt ti io oq qu ui ia a, , e en n e el l D De ep pa ar rt ta am me en nt to o d de e I In ng ge en ni ie er r a a Q Qu u m mi ic ca a. . E Es st te e
t tr ra ab ba aj jo o d de e i in nv ve es st ti ig ga ac ci i n n p po on ne e f fi in n a a u un na a e et ta ap pa a i im mp po or rt ta an nt te e p pa ar ra a m mi i f fo or rm ma ac ci i n n
c ci ie en nt t f fi ic ca a, , p pe er rs so on na al l y y a ac ca ad d m mi ic ca a. . P Po or r e el ll lo o s so on n m mu uc ch ha as s l la as s p pe er rs so on na as s a a l la as s q qu ue e
d de eb bo o u un n p pr ro of fu un nd do o a ag gr ra ad de ec ci im mi ie en nt to o, , p po or r s su u c co on nt tr ri ib bu uc ci i n n a al l d de es sa ar rr ro ol ll lo o d de e e es st te e
t tr ra ab ba aj jo o y y p po or r s su u a am mi is st ta ad d. . D De e m mo od do o g ge en ne er ra al l, , q qu ui ie er ro o a ag gr ra ad de ec ce er r l la a a ay yu ud da a r re ec ci ib bi id da a, ,
a a t to od do os s l lo os s c co om mp pa a e er ro os s d de el l l la ab bo or ra at to or ri io o d de e B Bi io op pr ro oc ce es so os s d de e l la a U Un ni iv ve er rs si id da ad d d de e
A An nt ti io oq qu ui ia a. .
Y Y a a l la as s p pe er rs so on na as s q qu ue e h ha an n t te en ni id do o u un n a ap po or rt te e e es sp pe ec ci ia al l e en n e es st te e t tr ra ab ba aj jo o. . A Ag gr ra ad de ez zc co o
5

a al l D Dr r. . J Ju ua an n C Ca ar rl lo os s Q Qu ui in nt te er ro o D D a az z y y a a l la a M Mg g. . C Cl la au ud di ia a P Pa at tr ri ic ci ia a S S n nc ch he ez z H He en na ao o, ,
p po or r e el l a ap po oy yo o a ac ca ad d m mi ic co o, , e em mo oc ci io on na al l y y p pe er rs so on na al l, , r re ec ci ib bi id do o p pa ar ra a r re ea al li iz za ar r e es st te e
t tr ra ab ba aj jo o e en n e el l l la ab bo or ra at to or ri io o, , p po or r s su u d di ir re ec cc ci i n n c ci ie en nt t f fi ic ca a, , p po or r o of fr re ec ce er rm me e
g ge en ne er ro os sa am me en nt te e s su us s c co on no oc ci im mi ie en nt to os s y y s su u t ti ie em mp po o, , p po or r s su us s c ca al li id da ad de es s h hu um ma an na as s y y
p po or r l la as s d di is sc cu us si io on ne es s s so ob br re e l lo os s r re es su ul lt ta ad do os s a aq qu u p pr re es se en nt ta ad do os s. .

M Mi is s i in ni ic ci io os s e en n l la a b bi io ot te ec cn no ol lo og g a a, , l la a b bi io oq qu u m mi ic ca a y y l lo os s b bi io op pr ro oc ce es so os s f fu ue er ro on n
i in nm me ej jo or ra ab bl le em me en nt te e a as se es so or ra ad do os s p po or r l la a M Mg g. . C Cl la au ud di ia a P Pa at tr ri ic ci ia a S S n nc ch he ez z H He en na ao o, ,
c co oa as se es so or ra a y y a am mi ig ga a a a q qu ui ie en n d de eb bo o l lo os s c ci im mi ie en nt to os s d de e m mi i f fo or rm ma ac ci i n n c co om mo o
i in nv ve es st ti ig ga ad do or ra a. .

A A l la as s c co om mp pa a e er ra as s d de el l l la ab bo or ra at to or ri io o J Ju ul li ia an na a O Os so or ri io o, , C Ca ar ro ol li in na a M Mo on nt to oy ya a y y M Ma ar ri ia an na a
C Ca ar rd do on na a, , c co on n l la as s q qu ue e c co om mp pa ar rt t t tr ra ab ba aj jo o, , e ex xp pe er ri ie en nc ci ia as s, , a am mi is st ta ad d y y e en ns se e a an nz za as s. .

Y Y a a t to od da as s a aq qu ue el ll la as s p pe er rs so on na as s q qu ue e d de e f fo or rm ma a d di ir re ec ct ta a o o i in nd di ir re ec ct ta a h ha an n c co on nt tr ri ib bu ui id do o a a
l la a r re ea al li iz za ac ci i n n d de e e es st te e t tr ra ab ba aj jo o. .

S So ol lo o e es sp pe er ro o h ha ab be er r a ap pr re en nd di id do o d de e l lo os s e er rr ro or re es s c co om me et ti id do os s, , q qu ue e e es s e el l a ap pr re en nd di iz za aj je e
m m s s g ge en nu ui in no o q qu ue e e ex xi is st te e! !
17

RESUMEN
El cido clavulnico (AC) es un potente inhibidor de las enzimas -lactamasas, se produce
a bajas concentraciones por fermentacin de la bacteria Streptomyces clavuligerus, lo que
hace que sea un producto costoso, se emplea junto con otros antibiticos -lactmicos con
el fin de contrarrestar la resistencia microbiana generada por algunas bacterias patgenas.
Los microorganismos patgenos producen las enzimas -lactamasas, que hidrolizan los
antibiticos -lactmicos, haciendo ms complejo el tratamiento de enfermedades
infecciosas y propagando un problema de salud pblica. Muchos estudios como el tipo y
calidad de los nutrientes en el medio de cultivo, modificaciones genticas y condiciones
operacionales se han realizado para mejorar la produccin de AC, pero existe poca
informacin sobre el modelado del proceso. El modelo matemtico es una herramienta til,
que permite predecir el comportamiento de las variables dependientes del tiempo, evaluar
el rendimiento del proceso y planificar estrategias de produccin. Es por esto que este
trabajo est orientado a encontrar los parmetros cinticos de la produccin de AC en un
proceso en lote y en continuo que permiten predecir su comportamiento bajo algunas
modificaciones en las condiciones operacionales tales como la concentracin de los
nutrientes, la tasa de dilucin y la concentracin de oxgeno disuelto.
Las fases de este estudio consistieron en la fermentacin en lote y en continuo, planteando
un modelo cintico semifsico de base fenomenolgica para cada caso. A partir de los datos
experimentales obtenidos en lote, se ajustaron los parmetros del modelo matemtico
propuesto, los cuales se estimaron por medio de la regresin mltiple no lineal de
Levenger-Marquartd. Los resultados del modelado cintico en lote muestran las tendencias
experimentales, con un 4% de error del modelo, valor que permite concluir que el modelo
describe la velocidad mxima especfica de crecimiento del microorganismo, la constante
de saturacin, el rendimiento de formacin de biomasa con respecto al sustrato, el
rendimiento especfico del producto y la constante de muerte del microorganismo;
generando los parmetros de entrada al modelo cintico en continuo, lo que permiti
evaluar el comportamiento dinmico del sistema en un reactor agitado.
18

Palabras claves: Modelado, Streptomyces clavuligerus, cido clavulnico, parmetros
cinticos, proceso en lote y proceso en continuo
19

ABSTRACT

Clavulanic acid (AC) is a potent inhibitor of the -lactamases enzymes, which is produced
by mean of Streptomyces clavuligerus fermentation at low concentrations, which makes it
expensive, is used in conjunction with -lactam antibiotics to counteract by microbial
generated resistance. Some pathogenic bacteria that produce the -lactamase enzymes that
hydrolyze -lactam antibiotics, complicating the treatment of infectious diseases and spread
an public health problem. Many studies have been made towards improving the production
of AC, of type genetic, operational conditions, but there is little information on process
modeling. The mathematical model is a useful tool that predicts the behavior of time-
dependent variables, evaluate the performance of the process and plan production
strategies. That is why this work is aimed at finding the kinetic parameters of the
production of AC in batch process and continuous to predict its behavior under certain
changes in operating conditions such as the maximum specific growth rate of the
microorganism, constant saturation, the rate of dilution and concentration of dissolved
oxygen.
The phases of this study were to fermentation in batch and continuous proposed a
structured kinetic model for each case. From the experimental data obtained in batch the
kinetic parameters were adjusted the proposed mathematical model, which are estimated by
non-linear multiple regression of Levenger-Marquartd. Modeling results show batch kinetic
experimental trends. From this model it was possible describe with an 4% model error,
value that allows us to conclude that the model describes of the maximum specific growth
rate of the microorganism, the saturation constant of the substrate, forming the biomass
yield with respect to the substrate, the specific yield of product and the microorganism
death constant . This generated the input parameters in continuous kinetic model, allowing
evaluates the dynamic behavior of the system in a stirred reactor.

Keywords: Modeling, Streptomyces clavuligerus, fermentation, Clavulanic acid, continuous
process, batch process.

20

1. INTRODUCCIN

En el mundo mueren muchas personas por enfermedades infecciosas respiratorias (IRA) e
intestinales agudas (EDA), alergias infecciosas como la meningitis, entre otras, que
actualmente son una de las mayores causas de mortalidad y morbilidad en la poblacin
infantil y adulta (Alvis G y De la Hoz Restrepo, 2004). En Colombia las muertes de origen
infecciosa se calculan a finales de 2007, en 1.478, lo que representa el 10% del total de
mortalidad en nios menores de cinco aos (Quiroga, 2012). Ms de 11 millones de
personas mueren por causa de afecciones prevenibles o curables, debido a que la resistencia
a los antimicrobianos est aumentando (Brundtland, 2005). Una de las principales razones
son la pobreza y la carencia de acceso a los medicamentos esenciales, debido al alto costo
de los mismos, as como al criterio de escogencia de los medicamentos de uso general, en
los planes de salud oficiales y el mal uso de los antibiticos por parte de la poblacin
(lvarez, 2012). La resistencia a los antimicrobianos es un fenmeno biolgico natural,
pero se convierte en un problema significativo para la salud pblica, cuando se multiplica
por causa de la utilizacin incorrecta y el descuido humano. Hay informes que describen la
amenaza creciente de la resistencia a los antimicrobianos (Labarca y Araos, 2009). Las
cepas bacterianas o agentes infecciosos causantes de estas enfermedades, se vuelven
resistentes a los efectos de los antibiticos (Als, 1994), debido a la capacidad que tienen
los microorganismos de segregar enzimas que degradan este tipo de frmacos (Sussmann y
colaboradores, 2003), siendo este uno de los principales mecanismos; por tanto es necesario
buscar sustancias que tengan la capacidad de inhibir estas enzimas inactivadoras (Saudagar
y colaboradores, 2008). Un importante nmero de enfermedades infecciosas son tratadas
principalmente con antibiticos -lactmicos, que son la ms grande y ms importante clase
de antibiticos clnicos (Vzquez y colaboradores, 2012). Sus ventas se estiman en US$15
mil millones, lo que representa el 65% del mercado mundial de los antibiticos (Carvalho
Santos y colaboradores, 2009).
Los antibiticos -lactmicos, actan inhibiendo la sntesis de la barrera de peptidoglicanos
de la pared celular bacteriana, la cual es muy importante para integridad del
microorganismo, especialmente en las especies Gram-positivas (Barredo, 2005). La
principal causa de la resistencia de algunos microorganismos a los antibiticos -
21

lactmicos, como las penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas o carbapenems, es su
capacidad de producir la enzima -lactamasa, que degrada e inactiva la molcula del
antibitico. Por lo cual se requiere una continua investigacin, no solo para el desarrollo de
nuevos antibiticos, sino para mejorar los existentes y sus procesos de produccin (Labarca
y Araos, 2009). Una de las estrategias para evitar este problema, es el uso de inhibidores de
la enzima -lactamasa, que son estructuralmente similares a los antibiticos -lactmicos,
como el cido clavulnico (Cordis Jackson y colaboradores, 1998).
El cido clavulnico (AC) es un metabolito encontrado en cultivos de la bacteria
Streptomyces clavuligerus (Sc) y fue aislado durante la dcada de 1970 (Reading y Cole,
1977), presenta una accin combinada, acta como agente antibacterial y es un potente
inhibidor de la enzima -lactamasa, de una variedad de bacterias gram-positivas y gram-
negativas (Livermore, 1995).
Se han realizado diversos estudios para determinar la eficacia clnica del AC con respecto a
otros inhibidores de las enzimas -lactamasas bacterianas (AC, sulbatam, tazobactam), y se
encontr que el AC muestra mayor efectividad, sobre un mayor nmero de bacterias
aerobias y anaerobias, hacindolo til en una amplia diversidad de aplicaciones clnicas
(Legnani, 1997; Saglimbeni y Salazar, 2002; Oringer, 2003; Adjei y Opoku, 2004; Varela
Alonso, 2008; Penam y Zaragoza, 2012). El AC se distribuye comercialmente en mezclas
con diferentes antibiticos -lactmicos, son prescritos en ms de 150 pases, sus ventas
exceden los 2 billones de dlares anuales (Saudagar, 2008; Li y Townsend, 2006), estos
medicamentos son combinaciones de AC y otro antibitico -lactmico estable. Algunos de
los nombres de estos productos son: Augmentin XR, que contiene amoxicilina/AC, en
relaciones de 2:1 a 5:1 (su costo puede estar entre US$0,87-3,83/ Tableta de 125 mg de
AC); Amoxi-Tabs C que contiene amoxicilina trihidratada/AC, empleada especialmente
en animales y Timentin que contiene ticarcilina de sodio/AC en una relacin de 15:1(Lian
y colaboradores, 2006). El desarrollo de diversas formulaciones de antibiticos que
contengan este inhibidor, requiere de una alta produccin industrial de AC (K. Chen y
colaboradores, 2003), es por esto que las investigaciones se encaminan a aumentar la
produccin del AC, ya que hasta el momento, solo se ha logrado incrementar este valor
hasta un 1.3 g AC/L (Saudagar y Singhal, 2007).
22

Se han desarrollado quimioteraputicos -lactmicos, que son inhibidores activos de las
enzimas -lactamasas, pero su eficacia, comprobada por ensayos clnicos, determin que
son compuestos que no tienen una lnea de accin biolgica continua (Almaraz y
colaboradores, 1996). El cido clavulnico se puede obtener por sntesis qumica, proceso
que es conocido desde 1977, cuando se present por primera vez la forma de sintetizar este
compuesto qumicamente (Bentley y colaboradores, 1977); el resultado es un
quimioteraputico que se obtiene en mayor produccin industrial, cuya composicin
qumica es una mezcla racmica de ismeros de cido clavulnico, la cual no es totalmente
compatible biolgicamente con el microorganismo y con el paciente, lo que hace que sean
compuestos con un nivel de hepatoxicidad ms alto, que el compuesto obtenido
biolgicamente. Adicionalmente su proceso de obtencin qumica, requiere de altas
temperaturas y de solventes para su purificacin que son contaminantes, por lo cual el
proceso por sntesis qumica es de costos muy altos y no amigable con el ambiente (Bentley
y colaboradores, 1977). Estudios clnicos con cido clavulnico, demostraron que el
compuesto biolgico, se absorbe sin mayor problema por va oral e intravenosa, que sus
propiedades farmacocinticas son compatibles con las penicilinas de amplio espectro
bacteriano, la amoxicilina y la ticarcilina. An muchos antibiticos -lactmicos de uso
clnico, son sintetizados bioqumicamente con bajos rendimientos de produccin, procesos
costosos y de uso comercial complejo, lo que ha ocasionado que se fabriquen estos
compuestos de manera semisinttica, con el fin de obtener estos productos a mayor escala
(Ramos, 2008). La fermentacin es el procedimiento ms utilizado con buenos
rendimientos, a costos moderados, en especial para producir la penicilina; sin embargo, el
AC tiene un proceso de produccin de bajo rendimiento y altos costos, ya que la
productividad depende de muchos factores como son, tipo y concentracin de nutrientes,
condiciones de operacin en la fermentacin, comportamiento y mecanismos intracelulares
de biosntesis. Muchos investigadores a nivel mundial trabajan en el tema y an no se
obtienen concentraciones de AC biolgico mayores a 1g/L (Jensen y colaboradores, 2004;
Teodoro y colboradores, 2010). GlaxoSmithKline, uno de los grandes laboratorios que lo
produce, ha reportado titulaciones de 561mg/L (Saudagar y colaboradores, 2008).
Townsend y colaboradores (2007) patentaron un incremento en la produccin de AC, por
23

medio de ingeniera gentica a partir de la adicin de arginina como precursor en la
biosntesis del metabolito secundario, obteniendo tan solo 420 mg/L de AC (Townsend y
Rong-Feng, 2007). Por lo tanto el desafo de la comunidad cientfica, consiste en la
creacin de alianzas y el desarrollo de frmulas para ampliar el acceso a los
antimicrobianos (Labarca y Araos, 2009).
La modelacin de sistemas juega un papel importante en el diseo, optimizacin, operacin
y el control de los procesos qumicos, bioqumicos y biotecnolgicos industriales (Gmez y
Alvarez, 2012). El modelo matemtico es una herramienta til, que permite predecir el
comportamiento de las variables dependientes del tiempo, evaluar el rendimiento del
proceso y planificar estrategias de produccin.
Como el fin es mejorar la produccin de AC, este trabajo est orientado a encontrar los
parmetros cinticos de la produccin de AC, en un proceso en lote y en continuo, que
permitan predecir su comportamiento bajo algunas modificaciones en las condiciones
operacionales tales como la concentracin de los nutrientes en el medio, la velocidad de
dilucin (D) y la concentracin de oxgeno disuelto (OD).
Las fases de este estudio consistieron en la fermentacin en lote y en continuo, planteando
un modelo cintico semifsico de base fenomenolgica para cada caso. A partir de los datos
experimentales obtenidos en lote, se ajustaron los parmetros del modelo matemtico
propuesto, los cuales se estimaron por medio de la regresin mltiple no lineal de
Levenger-Marquartd. Los resultados del modelado cintico en lote muestran las tendencias
experimentales y describen la velocidad mxima especfica de crecimiento del
microorganismo, la constante de saturacin, el rendimiento de formacin de biomasa con
respecto al sustrato, el rendimiento especfico del producto y la constante de muerte del
microorganismo, con un 3.99% de error en el modelo; generando los parmetros de entrada
al modelo cintico en continuo, que permiti evaluar el comportamiento dinmico del
sistema en un reactor agitado.

24

2. MARCO TERICO

2.1 Salud pblica y enfermedades infecciosas

La era de los antibiticos se inicia desde el descubrimiento de la penicilina como producto
eficaz para combatir infecciones, por Alexander Fleming en 1928, su sntesis fue realizada
por los qumicos Ernst Boris Chain y Howard Walter Florey, quienes desarrollaron su
purificacin, lo cual permiti su distribucin, este hecho desencaden entre los aos 1930 y
1970, el descubrimiento de una serie de antibiticos como las estreptomicinas, tetraciclinas,
quinolonas, antimicticos, antiparasitarios y recientemente, los antivricos. Estos
medicamentos que se conocen colectivamente como antimicrobianos, con los cuales se
han salvado vidas, se ha reducido la morbilidad y ha sido posible el tratamiento exitoso de
muchas infecciones. Hoy se conocen ms de 150 compuestos antimicrobianos, an existe la
necesidad de descubrir y sintetizar nuevos compuestos de este tipo y con funciones
parecidas e iguales, debido a la resistencia que adquieren los microorganismos patgenos,
aumenta da a da (Labarca y Araos, 2009). Adicionalmente, el acceso a los
antimicrobianos es insuficiente debido a sus altos costos, la malnutricin de la poblacin, el
mal uso y el abuso de estos compuestos por la disponibilidad de estos agentes sin
prescripcin mdica en los pases en desarrollo, lo cual hace que los beneficios que aportan
estas molculas, se perciban de manera muy reducida en el tratamiento de cuadros clnicos
infecciosos (Declaracin AMM, 2008).
Las enfermedades infecciosas generadas por bacterias multiresistentes causan una amplia
mortalidad y morbilidad en la poblacin infantil y en adultos jvenes del mundo. As
mismo causan un mayor costo por la amplia estancia hospitalaria y las complicaciones
mdicas (Sussmann y colaboradores, 2003). En el mundo anualmente mueren 200 personas
por cada 100 mil habitantes debido a enfermedades infecciosas, en Colombia este ndice es
de 37 por cada mil habitantes, siendo las enfermedades respiratorias, intestinales y la
meningitis las causas ms comunes (UNICEF, 2011).
La resistencia bacteriana es un fenmeno creciente, que se ha convertido rpidamente en un
grave problema de salud pblica, con implicaciones econmicas, sociales y polticas de
alcance mundial, que sobrepasan las barreras medioambientales y tnicas. Muchos agentes
25

infecciosos han desarrollado resistencia a los antibiticos, donde los ms utilizados son los
antibiticos -lactmicos biolgicos, que son agentes importantes que se han usado
teraputicamente para combatir las infecciones bacterianas (Surez y Gudiol, 2009); su
amplio rango de actividad antibacterial junto con sus excelentes propiedades farmacuticas,
adicional a su poca toxicidad hacen de estos compuestos los ms utilizados en la medicina
clnica (Schmidt, 2002). Sin embargo, la eficacia de este tipo de antibiticos se ha reducido
dada la resistencia generada por algunos microorganismo patgenos a estos compuestos, los
cuales producen la enzima -lactamasa, la cual hidroliza la molcula del antibitico antes
de que actu; lo que ha incentivado los estudios y las investigaciones hacia la produccin
de los inhibidores de las enzimas -lactamasas, encontrando que el AC es la mejor opcin
(Li y Townsend, 2006).
2.2 Resistencia microbiana

Los antibiticos son diseados para combatir las bacterias y microorganismos que causan
diferentes enfermedades infecciosas; cuando estos microorganismos que son
extremadamente numerosos, son inicialmente expuestos al antibitico, los ms sensibles y
susceptibles mueren, otros sobreviven y en sus generaciones se dan mutaciones biolgicas
aleatorias en la generacin de su ADN, que implican modificaciones genticas. Por medio
de la mutacin o modificacin gentica, estos microorganismos desarrollan mecanismos de
defensa contra el antibitico como intercambiar fragmentos de ADN, que son genes
resistentes al antibitico y quedan incorporados en otras bacterias, cuya reproduccin es
rpida, as en poco tiempo las bacterias resistentes se multiplican en gran cantidad
(Iyalombe y colaboradores, 2011). Debida a la resistencia adquirida, muchos de estos
microorganismos que causan enfermedades infecciosas, han dejado de verse afectados por
el efecto de los compuestos antimicrobianos de uso comn.
El desarrollo de la resistencia a los compuestos antimicrobianos por parte de
microorganismo en su mayora patgenos es un fenmeno natural, que surge como
resultado del abuso y uso a un ritmo acelerado e inapropiado de estos compuestos en usos
teraputicos (OMS, 2005).
26

Los fenmenos de resistencia a los compuestos antimicrobianos son conocidos desde la
era antibitica, este problema ha sido resuelto con el descubrimiento o sntesis de nuevas
sustancias capaces de controlar este fenmeno. Sin embargo, la incidencia de organismos
patgenos humanos resistentes a los antibiticos es cada vez mayor, mientras que el
descubrimiento y desarrollo de nuevos antibiticos es un proceso ms lento, por el tiempo
de desarrollo, estudio, sntesis y costo del compuesto hasta su mercadeo final (Sussmann y
colaboradores, 2003). An hoy, los antibiticos -lactmicos son los antimicrobianos ms
prescritos, tanto en atencin primaria (72%) como en la atencin hospitalaria (67%).
Las bacterias desarrollan resistencia a los antibiticos -lactmicos mediante 3 mecanismos
diferentes que son: (1) Produccin de enzimas (-lactamasas) que hidrolizan el anillo -
lactmico e inactivan el antibitico; este es el principal mecanismo de resistencia,
especialmente por microorganismos gram negativos, algunos gram positivos y anaerobios;
(2) Modificacin de la diana en las PBP (protenas enlazadas o fijadas a las penicilinas,
tambin conocidas como las DD-transpeptidasas), que son alteraciones en la PBP
(mutaciones, hiperexpresin y modificacin de la afinidad con las PBP), que dificulta la
unin del antibitico -lactmico a la protena, disminuyendo la actividad del
antimicrobiano, este es el mecanismo de resistencia de los microorganismos gram positivos
y (3) Alteraciones en la permeabilidad y bombas de expulsin, esta clase de resistencia se
da en microorganismos gram negativos ante la presencia de la membrana celular, que acta
como una barrera donde las sustancias poco lipoflicas (como los antibiticos -lactmicos)
precisan de protenas (poros) que les facilitan la entrada al compuesto antimicrobiano al
espacio periplsmico para poder as unirse a las PBP (Surez y Gudiol, 2009).
Los PBPs son enzimas enlazadas a la membrana que catalizan el entrecruzamiento de los
polmeros peptidoglicanos, en la sntesis de peptidoglicanos de la membrana celular de los
microorganismos. Este compuesto es esencial en la pared celular de los microorganismos,
el cual no est presente en las clulas eucariotas. Las -lactamasas actan como
seudosutratos de los PBPs y el anillo -lactmico acila la forma activa de la serina
formando un complejo estable covalente denominado enzima-acil. Los antibiticos -
lactmicos son los antimicrobianos ms usados debido a su espectro de actividad
antimicrobiana, su seguridad, su eficacia y su baja toxicidad; dentro de los antimicrobianos
27

que bloquean el mecanismo de resistencia ms importantes se encuentran los inhibidores de
las enzimas -lactamasas de serina, dentro de los cuales se encuentra el AC, el sulbatam y
el tazobactam, estos compuestos carecen habitualmente de accin antibacteriana intrnseca
con verdadera importancia clnica, pero se unen irreversiblemente a algunas enzimas -
lactamasas protegiendo de su accin desactivante a los antibiticos -lactmicos (Calvo y
Martinez, 2009).
El cido clavulnico (AC) es un antibitico -lactmico que presenta una accin combinada
efectiva como inhibidor de la enzima -lactamasa y como agente antibacterial. Diversos
estudios se han realizado para determinar la eficacia clnica de varios inhibidores de -
lactamasas bacterianas (AC, sulbatam y tazobactam), donde el AC mostr la mayor
efectividad sobre bacterias aerobias y anaerobias (Saudagar y colaboradores, 2008).

2.3 Antibiticos

Un antibitico es una clase de antimicrobiano, una sustancia qumica producida por
microorganismos y que es capaz de matar o inhibir el crecimiento de otros
microorganismos. Los antimicrobianos que no son antibiticos se conocen como agentes
quimioteraputicos y se producen por sntesis qumica. Un agente quimioteraputico es
definido como una droga (chemical) utilizada para tratar enfermedades causadas por la
invasin de bacterias, virus, protozoarios o metazoarios. Otras terminologas empleadas
son: agente bactericida como es la penicilina que mata al microorganismo y agente
bacteriosttico como las tetraciclinas o la eritromicina que inhiben el crecimiento
bacteriano y por tanto evitan su multiplicacin.
El uso de agentes antimicrobianos en el tratamiento de las enfermedades infecciosas es un
hecho realmente importante en lo que se refiere a la curacin, control de las infecciones y
que ha permitido disminuir los ndices de morbilidad y mortalidad por estas causas
(Cordis y colaboradores, 1998).

Los antibiticos se clasifican segn el efecto que ejercen sobre el microorganismo patgeno
(Bacteriosttico o Bactericida), segn el mecanismo de accin del compuesto y segn su
28

composicin qumica en la cual se pueden encontrar los antibiticos -Lactmicos que son
los ms utilizados clnicamente.
La presencia del anillo -lactmico, define qumicamente esta familia de antibiticos y
determina el mecanismo de accin del compuesto (inhibicin de la sntesis de la pared
celular), propiedades como su escasa toxicidad directa y su especificidad de accin, hacen
que sean compuestos muy atractivos para la industria farmacutica. Los antibiticos -
lactmicos estn conformados por las penicilinas, cefalosporinas, carbapenems,
monobactamas e inhibidores de las -lactamasas, referenciados en la figura 1, sus
diferencias se encuentran en la estructura qumica, la cual modifica las caractersticas del
antimicrobiano como son el espectro de accin, la afinidad por determinados receptores o la
resistencia a las enzimas -lactamasas (Surez y Gudiol, 2009).

Los -lactmicos son antibiticos de actividad bactericida lenta para microorganismos
sensibles, ya que la concentracin bactericida mnima (CBM) que elimina el 99.9% de los
microorganismos viables es igual o ligeramente superior a la concentracin inhibitoria
mnima (CIM), es decir, la concentracin mnima del antimicrobiano que inhibe el
crecimiento bacteriano. En las cepas tolerantes (definidas como aquellos microorganismos
con una CBM igual o mayor a 32 veces la CIM) el antibitico -lactmico se comporta
como un bacteriosttico. Hay tres inhibidores de enzimas -lactamasas de uso clnico, el
AC, el Sulbatam y el Tazobactam (Saudagar y colaboradores, 2008).

El AC presenta una escasa actividad antibitica frente a la mayora de las bacterias, sin
embargo, es un potente inhibidor de las enzimas -lactamasas, por lo cual se usa combinado
generalmente con amoxicilina o con ticarcilina (Saudagar y colaboradores, 2008). El AC se
enlaza de manera irreversible al grupo hidroxilo en la serina del centro activo de las
enzimas -lactamasas, produciendo un intermediario acilado estable que conlleva a la
inactivacin de la enzima permitiendo as, que el antibitico acompaante actu (Liras y
colaboradores, 2008).
29

Figura 1. Estructura qumica de los antibiticos -lactmicos. Surez y Gudiol (2009)

2.4 Produccin de cido clavulnico

Higgens C.E. y Kastner R.E. (1971) durante el desarrollo de una investigacin para la
produccin de metabolitos a partir del cultivo de la bacteria Streptomyces clavuligerus (Sc),
encontraron que se produca una diversa variedad de antibiticos relacionados con las
cefalosporinas y las penicilinas dentro de las cuales se hallaron un poderoso inhibidor de las
enzimas -lactamasas producidas por microorganismos como Escherichia coli, Klebsiella
aerogenes, Proteus mirabilis y Sthaphilococcus aureus. Este inhibidor fue detectado por
procedimientos de bioensayos para la inhibicin de las enzimas -lactamasas, dndole el
nombre de cido clavulnico (Brown y colaboradores, 1976).
Anillo -lactmico + Anillo secundario = Ncleo del -lactmico GRUPO ANTIBITICO
NH
O
N
O
R
S
N
O
R
R
R
N
O
R
R
R
R-NH
R-NH
O
N
S
R
N
O
R
O
Anillo tiazolidnico cido 6-aminopenicilnico PENICILINAS
Anillo pirrolinico Carbapenem CARBAPENEMS
Ninguno Monobactamo MONOBACTMICOS
a
Todos los inhibidores de las -lactamasas que se usan en la prctica (cido clavulnico, sulbactam y tazobactam) tienen estructura
-lactmica. El sulbactam y tazobactam son derivados sulfnicos del cido penicilnico.
Anillo dihidrotiacnico cido 7 -cefalospornico CEFALOSPORINAS
Anillo oxazolidnico Clavama/oxapenam CIDO CLAVULNICO
a

30

Otras investigaciones concluyeron que la Sc crece muy bien en un medio qumicamente
definido que contiene glicerol como nica fuente de carbono, y que las mejores condiciones
de produccin son un pH de 7.0 y una temperatura de 30C; encontraron que el
gliceraldehido 3-fosfato un derivado del glicerol es el precursor directo del AC (Salowe y
colaboradores, 1990; Janc y colaboradores, 1995;Mianbres y colaboradores, 1991).
Uno de los problemas encontrados en la produccin de AC es la inestabilidad del producto
ocasionada por variaciones en el pH, la temperatura y la presencia de ciertas sales.
Hanigaka y Nakagawa (1981) fueron los primeros en estudiar la estabilidad de producto
comercial de AC (sal de clavulanato) en soluciones tampn en un rango de pH de 3.15-
10.10, observando que la degradacin del metabolito procedi aproximadamente 10 veces
ms rpido en un medio cido que en los medios alcalinos sugiriendo que los componentes
del medio de cultivo tambin tienen un efecto sobre la estabilidad del producto. Mayer y
Deckwer (1996) estudiaron la produccin y descomposicin simultanea del AC en un
medio complejo en experimentos en in vivo e in vitro con AC, observaron una diferencia en
la cintica de descomposicin en cada experimento donde la ausencia del microorganismo
durante los experimentos en in vitro dio lugar a una rpida descomposicin, lo que sugiri
que el microorganismo ayuda a que el AC se degrade ms lentamente concluyendo que el
microorganismo utiliza la descomposicin de productos en el medio como una fuente de
nutrientes. Lynch y Yang (2004) estudiaron la estabilidad del AC cuando existe
acumulacin de biomasa y produccin de AC en un proceso en lote, empleando un medio
de cultivo qumicamente definido pero utilizando tres concentraciones diferentes de lisina
(Lys) como fuente de nitrgeno (en exceso, bajo limitacin y bajo limitacin de Lys con
adicin de AC degradado), obteniendo la mejor produccin de AC (2.2 g/L) en el tercer
caso. Por ltimo, Carvalho y colaboradores (2009) tambin evaluaron la estabilidad del AC
a largo del tiempo bajo diferentes condiciones de pH en un rango de 4.0 a 8.0 y de
temperatura en un rango de 20C a 45C en presencia de diferentes sales a diferentes
concentraciones, sugiriendo que las mejores condiciones para la produccin y recuperacin
simultanea de AC son a un pH entre 6.0-7.2, a una temperatura de 20C y que en presencia
de sales se incrementa la inestabilidad del AC (Carvalho Santos y colaboradores, 2009).

31

2.4.1 Fermentacin en lote

La mayor concentracin de AC y de biomasa se ha logrado en medios de cultivos
complejos en los cuales se emplea como fuente de nitrgeno protena hidrolizada de soja
(Gouveia y colaboradores, 1999). Almeida y Regalo (2000) lograron producir 1.22 g de
AC/L y 15.6g de biomasa/L, en un biorreactor de tanque agitado de 8 L con control de pH,
de temperatura y una aireacin entre 0.7 y 1.2vvm. En otras investigaciones reportadas en
la literatura se presentan produccin de concentraciones de AC entre 280 a 500mg/L (Large
y colaboradores, 1998).
Otros factores importantes a considerar en una fermentacin son el efecto de la velocidad
de agitacin y la concentracin de oxgeno disuelto (OD) sobre la Sc, Belmar-Beiny y
Thomas (1991) estudiaron la influencia de la velocidad de la agitacin en la biomasa,
morfologa y rendimiento a AC en cultivos por lote de Sc en un biorreactor de 5 L
utilizando un medio de cultivo complejo, encontrando que el crecimiento y la produccin
de AC (200 mg/L) eran independientes de la velocidad de agitacin. Large y colaboradores
(1998), con el mismo medio y el mismo microorganismo investigaron el efecto de la
velocidad de la punta del impeler ( )
tip
v dentro del rango de 1.9 a 3.8 m/s sobre el
crecimiento y produccin de AC, observaron que valores menores de 2.8 m/s incrementan
la produccin de biomasa, siendo 2.4 m/s la velocidad ptima del impeler para producir
AC. Roubos y colaboradores (2001) estudiaron el efecto de la velocidad de la agitacin
mecnica sobre el proceso de lisis celular en cultivos con medio qumicamente definido de
20 y 30 L, encontrando que el microorganismo es sensible al efecto de corte. As, mientras
Belmar-Beiny y Thomas indicaron que no haba dependencia entre la velocidad de
agitacin y la produccin de AC, Large y colaboradores (2001) encontraron un valor
ptimo para la velocidad de la punta del impulsor o agitador ( )
tip
v para lograr la mayor
produccin de AC.
Rosa y colaboradores (2005) tuvieron en cuenta las dos variables sobre la produccin de
AC, encontrando que es ms significativa a altas velocidades de agitacin y que el nivel
OD no tiene un efecto marcado sobre la produccin del metabolito, lo cual contradeca las
32

observaciones de Belmar-Beiny y Thomas (1991) indicando que hay que tener en cuenta la
fisiologa del microorganismo y la reologa del medio cultivo empleado.
En el auge de que el AC producido por la Sc era un potente inhibidor, llevo a ciertos
investigadores a identificar la dependencia de la produccin de AC en funcin de la
afinidad entre el microorganismo y los sustratos utilizados, en un proceso de produccin en
lote y continuo (Ives y Bushell, 1997), identificando los metabolitos intermediarios cuyas
velocidades de produccin estn estrechamente vinculadas con la biosntesis del
antibitico, utilizando esta informacin para disear cultivos que dieran lugar a aumentar la
produccin del AC, probablemente mediante el aumento en el suministro del precursor de
la fuente de carbono. Estudios muestran trabajos con tres medios de cultivos qumicamente
definidos, uno limitado en fsforo (P), uno limitado en carbono (C) y uno limitado en
nitrgeno (N), investigando como un sustrato limitante afectaba la produccin del
metabolito secundario y como estaba asociado a los fluxes metablicos en la fermentacin,
concluyendo que cuando el medio estaba limitado por fosfato la velocidad de produccin
del AC fue mxima (3.65 mg/g de X.h), mientras que si el medio estaba limitado por N o C
se desfavoreca la produccin, esto se llev a cabo realizando un anlisis de flujo
metablico (AFM), dilucidando que la limitacin de sustratos en el medio de cultivo
favorece o desfavorece la produccin del precursor de C3 (gliceraldehido 3-fosfato)
afectando directamente la produccin del AC (Kirk y colaboradores, 2000).
Otros trabajos han evaluado el efecto de la fuente de nitrgeno en el medio de cultivo, uno
con peptona y el otro Samprosoy 90NB (protena de soja) como fuente de nitrgeno a 28C
y un nivel de OD controlado automticamente a un valor de saturacin de 40% con una
aireacin de 0.5 vvm, dando como resultado que la produccin de AC puede ser sensible a
la fuente de nitrgeno en el medio de cultivo, presentando producciones de AC de 400
mg/L cuando la fuente de nitrgeno fue la peptona y 800 mg/L cuando la fuente de
nitrgeno era el Samprosoy 90NB (Baptista-Neto y colaboradores, 2000).
Diferentes tipos de operacin del biorreactor han sido estudiados en la produccin del
metabolito secundario como lote, lote alimentado y en continuo, en los cuales reportaron
que el cultivo en continuo es ms eficiente que el proceso en lote o en lote alimentado, en
trminos del tiempo de procesamiento (ya que no existen tiempos muertos debido a
33

operaciones de carga y descarga, preparacin y esterilizacin del biorreactor que son
evitadas en continuo), sin embargo la productividad es a menudo baja por posibles
variaciones genticas que pueden ocurrir cuando el cultivo en continuo dura mucho tiempo
y porque se puede contaminar (Neto y colaboradores, 2005).

2.4.2 Fermentacin en continuo

La produccin de AC en continuo, ha servido para hacer estudios de anlisis de flux
metablico de la biosntesis del cido, de tal forma que se puedan establecer estrategias de
alimentacin o modificacin del medio de acuerdo con la distribucin de fluxes que se da
en el sistema bajo limitacin de nutrientes con un medio qumicamente definido, en este
tipo de trabajos se pueden encontrar el de Bushell y colaboradores (2000), quienes
trabajaron a una tasa de tasa de dilucin de 0.05h
-1
y establecieron que bajo limitacin de
fsforo se favoreca mas la produccin de AC, lo que conllevo a que se realizara un estudio
a varias tasas de dilucin y se establecieran estrategias de alimentacin de aminocidos al
medio; las condiciones de operacin empleadas fueron una temperatura de 30C, 750 rpm y
un pH de 6.8 a 4 velocidades de dilucin diferentes de 0.03, 0.05, 0.07 y 0.1 h
-1
; obteniendo
que a la menor velocidad de dilucin se produce ms AC, con un valor reportado de 0.32
mg/g de biomasa.h,, pero se desfavorece la formacin de biomasa, cuyo valor fue de 0.036
g de biomasa/L.h a comparacin de 0.09 g de biomasa/L.h obtenida a la velocidad de
dilucin ms alta, pero con una velocidad de produccin especfica de cido clavulnico de
0.1 mg /(g de biomasa.h), menor que la obtenida en las otras magnitudes de velocidad de
dilucin.
Baptista-Neto y colaboradores (2005) estudiaron la produccin de AC en lote, lote
alimentado y en continuo, realizando los tres procesos a las mismas condiciones,
temperatura de 28C, aireacin de 0.5 vvm y agitacin de 800 rpm, logrando la mayor
productividad en continuo del metabolito de 10.6 mg AC/L.h y una produccin de AC de
293 mg/L. Domingues y colaboradores (2010), realizaron un diseo de experimentos para
optimizar el valor de la relacin 40:1 glicerol-ornitina en un medio complejo para la
fermentacin de Sc a 28C, 250 rpm, un pH de 6.8, 1 vvm y a una tasa de dilucin de 0.05
h
-1
, en los resultados reportados no se muestra una cintica experimental de continuo si no
34

una cintica de cultivo en lote alimentado, con una produccin de cido clavulnico de 390
mg de cido clavulnico/L.

2.5 Modelacin y simulacin de la cintica de produccin
de AC

La modelacin de sistemas juega un papel importante en el diseo, la optimizacin, la
operacin y el control de los procesos qumicos, bioqumicos y biotecnolgicos industriales
(Gmez y Alvarez, 2012). Los procesos biotecnolgicos y con metabolitos de inters
industrial, se estn investigando, modelando y simulando, con el fin de entender el
comportamiento qumico y cintico que predomina en estos sistemas. Los modelos
fenomenolgicos que han sido exitosos en varios campos de la ciencia lo son por el arduo
trabajo acadmico de muchos investigadores, sin embargo estos modelos no son totalmente
fenomenolgicos ya que alguna de las caractersticas del proceso se describen mediante
correlaciones empricas particulares para una condicin dada; adicionalmente los valores de
algunas propiedades se obtienen mediante mediciones experimentales (Gmez y Alvarez,
2011).
En los modelos matemticos relacionados con bioprocesos y la produccin de cido
clavulnico, Tarbuck y colaboradores (1985) propusieron un modelo cintico para la
estimacin en lnea de la produccin de antibiticos a partir de la fermentacin de Sc
utilizando un medio qumicamente definido y un medio complejo para determinar la
cintica de la biomasa, modelo que no estima parmetros cinticos en el proceso. Gudi y
colaboradores (1994), propusieron estrategias de estimacin de la concentracin de la
biomasa en lnea, por medio de la medicin de la velocidad de incremento del CO
2
en el
bioproceso, pero sin tener en cuenta la estimacin de parmetros cinticos de crecimiento
del microorganismo; Baptista-Neto y colaboradores (2000) propusieron un modelo cintico
para la formacin de biomasa, consumo sustrato y produccin de AC, con la velocidad de
crecimiento especfico por medio de la ley de Monod y considerando significativa la
velocidad de muerte del microorganismo por medio de la constante de muerte especfica
( )
d
k , adicionalmente plantearon una ecuacin estequiomtrica para explicar la produccin
35

de cido clavulnico en lote, incluyendo en su modelo los parmetros cinticos y la
determinacin de los coeficientes de rendimiento, llevaron a cabo este estudio utilizando
dos diferentes fuentes de nitrgeno en medio complejo a 28 C, 250 rpm y 0.5 vvm; la
estimacin de los parmetros del modelo se hizo con el mtodo de regresin no lineal de
Levenger-Marquartd, utilizando el algoritmo DDASSL, que es una rutina para resolver un
sistema de ecuaciones diferenciales y algebraicas, con un modelo de regresin aplicable a
problemas de alto grado de complejidad y con pocos datos disponibles, este programa fue
creado por L. R. Petzold, para Laboratorios SANDIA NATIONAL en 1982 y significa
segn las siglas en ingles Drug Design And Semi-Supervised Learning; este algoritmo fue
utilizado para la solucin numrica de las tres ecuaciones cinticas simultneamente, la
solucin del sistema de ecuaciones se desarrollo con tres funciones de paso, la primera
funcin de paso hace que la solucin numrica de la ecuacin cintica de la produccin de
cido clavulnico sea igual a 0 entre las 0 a 10 horas y la segunda funcin de paso, hace que
la solucin numrica de la ecuacin cintica de consumo de sustrato sea igual a 0 entre las
18 a 36 horas; los resultados obtenidos por Baptista y colaboradores (2000) se presentan en
la figura 2 y en la tabla 1, en las cuales se observa que se ajusto el modelo de las tres
ecuaciones simultneamente solo para un medio, para el segundo medio trabajado solo se
pudo ajustar el modelo a la produccin de cido clavulnico. La ecuacin estequiomtrica
planteada por ellos, es la ecuacin para un medio qumicamente definido, donde el sistema
experimental es complejo, an as en los resultados se observa un buen ajuste, el cual no es
reportado en magnitud y la fraccin de sustrato que se est transformando en producto no
pudo ser determinada.

Figura 2. Comparacin entre datos simulados y experimentales en: a) medio peptona y b) medio Samprosoy.
Baptista y colaboradores (2000).
36

Tabla 1.Valores de los parmetros estimados, con un 95% de nivel de confianza, utilizado para la simulacin
de un proceso de produccin de cido clavulnico en medio con peptona y Samprosoy 90NB.

Parmetros Medio con peptona Medio con Samprosoy 90NB
( )
1
max
*

h
0.2070.009 ---
( ) L g K
s
/ *
3.480.40 ---
( ) g g Y
s x
/ *
0.5740.0451 ---
( )
1
*

h k
d

0.0380.001 ---
( ) L g C
S
/ *
1

0.0040.008 ---
( ) L g C
X
/ * *
0

--- 0.580.03
( ) h g mg . /
3.511.21 12.81.3
( )
1
h k
p

0.0380.032 0.1120.016
( ) L g C
S
/
2

11.144.39 11.840.80
*Estimado en medio con peptona
**Estimado en medio Samprosoy 90NB cuando los valores experimentales no son disponibles

Baptista-Neto y colaboradores (2005) estudiaron la cintica que describa el crecimiento del
microorganismo, el consumo de sustrato y la produccin de AC en un medio complejo, con
el fin de desarrollar y obtener un modelo que describe la cintica de fermentacin y que
fuera capaz de aplicarse a diferentes estrategias de produccin, por lo tanto los datos
obtenidos del cultivo en continuo fueron usados para estimar los parmetros del modelo
matemtico propuesto. La ecuacin de crecimiento se bas en el modelo de Contois y se
asumi que la cintica de crecimiento no estaba asociada a la formacin de producto, pero
fue capaz de explicar muy bien el comportamiento del proceso a diferentes condiciones;
todos los experimentos se llevaron a cabo a 28C, 0.5 vvm, 250 rpm y un pH controlado a
6.8 por adicin de HCl 4 M o solucin de NaOH 2 M, el cual fue realizado a 7 diferentes
velocidades de dilucin (D) entre 0.02 y 0.2 h
-1
; la simulacin mostr que el mejor proceso
es el cultivo en continuo por productividad, que es la mejor alternativa, pero que deben ser
ms estudiados an. En la tabla 2 se presentan los valores obtenidos por Baptista y
colaboradores (2005), para los parmetros de la ecuacin de Contois que describe el
crecimiento especfico del microorganismo, pero no se presentan valores para los
parmetros cinticos de las ecuaciones planteadas, para modelar y simular la cintica de
37

formacin de biomasa, consumo de sustrato y produccin de cido clavulnico
simultneamente.

Tabla 2.Valores de los parmetros del modelo cintico obtenido utilizando los datos experimentales de un
cultivo continuo
Parmetros Valores Parmetros Valores
( )
1
1 max

h
0.150
( )
x N
g g /
2

0.119
( )
1
2 max

h
0.051 ( ) h g g m
x g
. /
0.363
( )
x g X
g g K /
1

2.000
( ) h g mg
x
. /
2.270
( )
x N X
g g K /
2

0.143
( )
1
h k
dp

0.017
( )
x g
g g /
1

0.374

Figura 3.Comparacin entre datos experimentales obtenidos desde un cultivo continuo y los valores
simulados de un modelo cintico propuesto por Baptista y colaboradores (2005)

Domingues y colaboradores (2009) realizaron un diseo de experimentos de 2 niveles,
diseo factorial central compuesto, para estudiar el cultivo de Sc en lote alimentado y en
continuo a una velocidad de dilucin de 0.005 h
-1
en un medio complejo a 28C, 250 rpm,
pH de 6.8 y 1 vvm, planteando un modelo cuadrtico emprico para modelar y simular la
produccin de cido clavulnico, obteniendo muy buen ajuste, pero donde solo se ajusta
una cintica solamente.
Un modelo puede ser principalmente de tres grandes tipos: Fenomenolgico, semifsico o
emprico (Ljung, 1987), el rol de los modelos basados en principios qumicos y fsicos
(modelos fenomenolgicos) ha sido poco reportado con aplicaciones exitosas, sin embargo
38

algunos modelos que han sido elaborados por investigadores no son totalmente
fenomenolgicos, ya que algunas caractersticas del proceso se describen mediante
correlaciones empricas y los valores de algunas propiedades se obtienen a travs de
mediciones experimentales, es decir, este tipo de modelado se apoya en la identificacin de
relaciones matemticas por medio de la estadstica, lo que hace que los modelos adquieran
un carcter semifsico y deje en evidencia la enorme dificultad para desarrollar un modelo
exclusivamente basado en principios qumicos y fsicos (Gmez y Alvarez, 2012). Los
modelos semifsicos o de caja gris, son los modelos en los cuales se utiliza tanto el
conocimiento del fenmeno como datos experimentales tomados del sistema (Lindskog,
1996), estos modelos que contribuyen en el diseo, operacin, escalamiento, control y
optimizacin de biorreactores (Dunn y colaboradores, 2003).
El modelado matemtico est constituido por ecuaciones diferenciales, las cuales no tienen
comnmente una solucin algebraica o simple, por lo cual se requiere del uso de mtodos
numricos para su solucin, para lo cual se realiza la programacin de la solucin de las
ecuaciones diferenciales.
Esta solucin consiste en la aplicacin de un mtodo numrico y un algoritmo que permite
la solucin de las ecuaciones diferenciales, un mtodo numrico conocido es el mtodo de
Levengerg-Marquartd (1963), el cual es una tcnica de interpolacin cuya funcin objetivo
estimar parmetros cinticos con la minimizacin de la suma de cuadrados de los
residuales. Estos mtodos matemticos son utilizados desde 1963 y su aplicacin puede
estudiarse en diversas bibliografas (Constantinides y Mostoufi, 2000).
Un modelo matemtico es una herramienta muy til, ya que permite describir bien un
sistema solo con la introduccin de valores iniciales, que pueden ser manipulados y
replicados fcilmente de forma experimental. Una vez desarrollado el modelo permite
conocer la evolucin de cada variable involucrada y manipular los parmetros de ajuste
segn el conocimiento y la experiencia que se tiene del proceso (Godia Casablancas y
Lpez Santn, 1998).
En los modelos dinmicos propuestos para las fermentaciones, la concentracin de
biomasa, sustrato y producto son variables dependientes del tiempo, las cuales permiten
evaluar el rendimiento de la fermentacin, se propone entonces la utilizacin de modelos
39

matemticos que sirvan de herramientas para la simulacin de procesos fermentativos en
lote, con el fin de obtener informacin detallada del comportamiento del proceso en
cualquier instante de tiempo. Las investigaciones en procesos fermentativos han dado
como resultado un alto nmero de ecuaciones que describen el crecimiento microbiano, la
ms famosa de ellas es la expresin propuesta por Monod; aunque cada uno de los modelos
que se propongan pueden ser descrito por una ecuacin flexible, en general de tres
parmetros, la falta de consistencia con los datos experimentales ha conducido a desarrollar
ecuaciones alternas como las propuestas por Contois, Teissier, Moser, entre otras (Trejos y
colaboradores, 2009).
Muchas compaas e industrias estn usando modelos y simulaciones como una
herramienta esencial para el desarrollo de nuevos productos, la industria farmacutica se ha
quedado un poco rezagada, debido a la complejidad y al poco entendimiento que an hay
de los sistemas biolgicos. La industria farmacutica es uno de los sectores que ms se
beneficia del desarrollo de sofisticadas herramientas de simulacin para mejorar el
desarrollo de drogas, mejorando la productividad y reduciendo los costos (Gmez y
Alvarez, 2012).
Existen pocos modelos cinticos propuestos para la cepa Streptomyces en general, entre
algunos de los trabajos realizados estn el de Ozergin-Ulgen (1993), el cual fue el primer
trabajo orientado a obtener los parmetros cinticos que describen la actividad de
Streptomyces coelicolor para producir actinorrodina en un cultivo en lote en el cual la
formacin de biomasa y el consumo de sustrato se model por la ecuacin logstica, y la
formacin de producto se ajust con la tercera ecuacin de Luedeking-Piret, encontrando
que la produccin del metabolito secundario era asociada al crecimiento (Ozergin-Ulgen y
Mavituna, 1993). King (1997), propuso un modelo altamente estructurado y
compartimentalizado para el metabolismo celular, el cual no solo describe el
comportamiento dinmico complejo de la especie Streptomyces tendae, sino de una clase o
especies en general, el cual presenta la velocidad de crecimiento como una funcin del
contenido de algunos compartimentos intracelulares.
El modelo planteado para el desarrollo de este trabajo, es semifsico y est constituido por 4
ecuaciones diferenciales de parmetros concentrados, en su mayora no lineales, con
40

ecuaciones capaces de reproducir el crecimiento del microorganismo, el consumo de
sustrato y la produccin del metabolito de inters; el fenmeno limitante es el consumo de
sustrato, adicionalmente el modelo simula los perfiles de concentracin del cido
clavulnico, el metabolito secundario que solo se manifiesta cuando la concentracin del
nutriente es baja y la formacin de la biomasa se encuentra en la terminacin de la fase de
crecimiento exponencial (Godia Casablancas y Lpez Santn, 1998).
41

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo General

Estudiar la fermentacin de Streptomyces clavuligerus, y encontrar las mejores
condiciones a escala laboratorio para producir cido clavulnico en continuo.

3.2. Objetivos Especficos

Realizar un cultivo en lote de Streptomyces clavuligerus en un medio mnimo
(qumicamente definido) para la determinacin de la tasa de dilucin mxima para
operar un cultivo continuo.

Obtener un modelo matemtico que describa las cinticas experimentales en una
operacin por lotes y simular las condiciones encontradas en un proceso en
continuo.

Evaluar el efecto de la tasa de dilucin, el flujo de sustrato y la concentracin de
OD sobre la produccin de cido clavulnico.

42

4. METODOLOGA

Encontrar las mejores condiciones a escala laboratorio para producir el AC en continuo fue
el objetivo central de este estudio, para lo cual se llevo a cabo el siguiente procedimiento; la
cepa es activada en medio TSB a partir de un tubo semilla de Sc, el cual contiene el
microorganismo crioconservado en una solucin 50% de TSB y 50% de glicerol al 40%.
Luego la cepa activada es transferida a un matraz con medio de produccin. Como medios
de produccin se utilizaron tres medios, dos medios qumicamente definidos y un medio
complejo. El inters de este trabajo de investigacin, es analizar y estudiar un medio
qumicamente definido, por medio del cual se pueda en trabajos posteriores, mejorar la
produccin de AC, realizando anlisis de flux metablico (AFM) (Ros, 2012). La
produccin de AC en medio complejo es de aproximadamente 450 mg/L (Baptista_Neto y
colaboradores, 2000), por lo cual se trabajo un medio complejo como medio control, ya que
se ha demostrado que los medios complejos favorecen la produccin del metabolito de
inters, con el fin de encontrar un valor mximo de produccin de AC a partir de la cepa
activada.
Con los tres medios de cultivo, se estudiaron las cinticas de formacin de biomasa,
consumo de sustrato y produccin de AC en matraz; datos que son tiles para determinar
los parmetros del cultivo en lote, como son
max
,
s
K ,
d
K
,
s x
Y y
p x
Y . Luego se cultivo Sc
en un proceso en lote en biorreactor con el mejor medio qumicamente definido, con el fin
de obtener
max
,
s
K ,
s x
Y ,
p x
Y y D, parmetros importantes para el cultivo en continuo de
Sc. Con los datos obtenidos en cada uno de los procesos anteriores, se estimaron los
parmetros por medio de un modelo, que representa las cinticas experimentales de
formacin de biomasa, consumo de sustrato y produccin de AC. A continuacin se
describir en ms detalle cada una de las etapas realizadas para lograr los objetivos
propuestos.

43

4.1 Microorganismo

Se emple una cepa ATCC 27064 de Sc (equivalente a NRRL 3585 y CECT 3125), fue
proporcionada por la Coleccin Espaola de Cultivos Tipo.
4.2 Medio de cultivo
4.2.1 Control de contaminacin

La bacteria en crio-conservacin se sembraba en medio TSB que contiene por litro de
solucin, 17 g de casena, 3 g de extracto de soya, 5 g de cloruro de sodio, 2.5 g de
dipotasio fosfato y 2.5 g de dextrosa, el cual se prepara pesando 30 g del medio en un litro
de agua destilada, se calienta con agitacin constante hasta ebullicin por un (1) minuto,
hasta disolucin total, luego se autoclava a 121C y 15 psi por 15 minutos. Este medio tiene
un pH de 7.3 0.2 a 25C.
4.2.2 Medio de cultivo para mantenimiento y activacin de cepas

Para la activacin de la cepa se emple el medio TSB, en el cual se siembra la Sc,
tomando un vial de 1.5 mL con la cepa en crio-conservacin y se siembra en el medio de
activacin, se incuba a 28C y 200 rpm por 36 h.
Su conservacin se llev a cabo en tubos semilla de 1.5 mL de 50% v/v de TSB con
glicerol al 40%, los cuales fueron crio conservados a -80C. Se hicieron repiques
semestrales sobre TSB para garantizar la obtencin de clulas jvenes por 24 o 48 horas,
para luego ser almacenadas en tubos ependorf de 1,5 mL para crioconservacin.
4.2.3 Medios de cultivo para produccin de AC

Para el cultivo de Sc, se emplearon tres medios; dos medios qumicamente definidos y un
medio complejo. Inicialmente se trabajo con el medio reportado por Bushell y
colaboradores modificado en cuanto a la concentracin del fosfato, este medio es
qumicamente definido con la siguiente composicin (valores por litro): 20 g de glicerol,
0.8 g de KH
2
PO
4
, 2.33 g de NH
4
Cl y 21 g de MOPS, pH hasta 6.8 0.2. El medio fue
44

suplementado con 10 mL de una solucin de trazas de sales por cada litro de medio, la cual
contiene (valores por litro): 25 g de MgSO
4
.7H
2
O, 2.5 g de FeSO
4
.7H
2
O, 0.053 g de CuCl
2
,
0.055 g de CoCl
2
, 1.38 g de CaCl
2
.2H
2
O, 1.04 g de ZnCl
2
, 0,62 g de MnCl
2
y 0,03 g de
Na
2
MoO
4
, esta solucin se esteriliza y se adiciona al medio de cultivo por filtracin a travs
de un filtro con dimetro de poro de 0.2 m (Bushell y colaboradores, 2006). A este medio
se le denomino medio Gly-NH
4
.
Se trabajo con el medio qumicamente definido, denominado Gly-Asn, con la siguiente
composicin (valores por litro): 20 g de glicerol, 3.5 g de K
2
HPO
4
, 2 g de L-asparagina y
21 g de MOPS, pH hasta 6.8 0.2 (Malmberg y colaboradores, 1993). Este medio se
suplemento con 1 mL de una solucin de trazas de sales por cada litro de medio y con 2
mL/L de medio, de una solucin 0.615 g/mL de MgSO
4
.7H
2
O. La solucin de trazas de
sales, contiene (valores por litro de solucin): 1g de ZnSO
4
.7H
2
O, 1g de FeSO
4
.7H
2
O, 1 g
de CaCl
2
y 1 g de MnCl
2
.4H
2
O, esta solucin se esteriliza por filtracin a travs de un filtro
con dimetro de poro de 0.2 m (Malmberg y colaboradores, 1993).
Se realizaron cultivos con medio complejo, denominado medio Gly-HS, con la siguiente
composicin (valores por litro): 20 g de glicerol, 0.8 g de K
2
HPO
4
, 7.5 g de Harina de Soya
y 21 g de MOPS, pH hasta 6.8 0.2 (Snchez y colaboradores, 2012). Este medio se
suplemento con 1 mL de una solucin de trazas de sales por cada litro de medio y con 2
mL/L de medio, de una solucin 0.615 g/mL de MgSO
4
.7H
2
O. La solucin de trazas de
sales, contiene (valores por litro de solucin): 1g de ZnSO
4
.7H
2
O, 1g de FeSO
4
.7H
2
O, 1 g
de CaCl
2
y 1 g de MnCl
2
.4H
2
O, esta solucin se esteriliza por filtracin a travs de un filtro
con dimetro de poro de 0.2 m (Malmberg y colaboradores, 1993).
Para el inculo, se toma el micelio de Sc proveniente de 10 mL de la suspensin
provenientes de un erlenmeyer con medio TSB, se siembran en un erlenmeyer de 500 mL
con 100 mL de medio de fermentacin. Los matraces se incuban a 28C con una agitacin
entre 220 rpm durante 36-48 h (Chen y colaboradores, 2002).
4.3 Fermentacin

Con el fin de conocer las cinticas experimentales del cultivo en lote de Sc, se realizaron
cultivos en matraz en los tres medios, con el fin de determinar el mejor medio
45

qumicamente definido para producir el AC y las condiciones que favorecen la produccin
ms alta de AC, la cual se da comnmente en medios complejos. Luego se cultivo Sc en
lote en biorreactor para obtener las cinticas experimentales de formacin de biomasa,
consumo de sustrato y produccin de AC, determinando parmetros cinticos como
max
,
s x
Y ,
p x
Y y realizando la obtencin de la cintica de oxgeno en el biorreactor durante del
cultivo, por medio de la determinacin de a K
L
y
2
O
Q , informacin que es til para disear
un cultivo en continuo de Sc. Se calcularon tambin los rendimientos tericos
estequiomtricos con el fin de valorar que tan eficiente es el proceso experimental de la
produccin de AC a partir del cultivo de Sc.
4.3.1 Cultivo en lote

Los cultivos de Sc en matraz, se realizaron con los medios Gly-NH
4
, Gly-Asn y Gly-
HS, para determinar el mejor medio qumicamente definido para producir AC y la mejor
produccin de AC en un cultivo de Sc, se realizaron en erlenmeyers de 500 mL con un
volumen de medio de 100 mL y un inoculo del 10% v/v, el criterio utilizado para inocular
el medio de produccin fue la concentracin de la biomasa en el medio de activacin, debe
ser mayor a 5 g de biomasa/L. Se incubaron a 28C y 220 rpm, la toma de muestras se
realiz cada 12 h (Snchez y colaboradores, 2012).
Se hicieron cultivos en lote de Sc, utilizando el medio Gly-Asn en biorreactor New
Brunswick Bioflo 110, con control de oxgeno, pH y agitacin, de 3L con 1L de volumen
de cultivo empleando un inculo del 10% v/v. Temperatura de 28C, pH de 6.8, 1 vvm y
500 rpm, la toma de muestras se realiz cada 12 h (Neto y colaboradores, 2005).

4.3.1.1 Determinacin de coeficientes de transferencia de oxgeno

Para determinar la cintica de OD, se realiz la determinacin experimental del coeficiente
de transferencia de oxgeno ( ) a K
L
con unidades de h
-1
y la velocidad especfica de consumo
de oxgeno ( )
2
O
Q con unidades de mmol O
2
/g de biomasa.h, por medio de la tcnica
dinmica en el biorreactor; est tcnica se realiz en el cultivo en lote.
46

Est tcnica fue propuesta por Taguchi y Humphrey (1966), mtodo que mide la actividad
respiratoria del microorganismo, consiste en desconectar la aireacin del fermentador y
desgasificar el sistema, la concentracin de oxgeno disuelto disminuye a una velocidad
igual al consumo de oxgeno debida al proceso respiratorio del microorganismo, hasta que
la concentracin de oxgeno disuelto en el recipiente se encuentre cerca al 20% de oxgeno
disuelto, evitando que el microorganismo sufra de escases de oxgeno (Rosa y
colaboradores, 2005); bajo estas condiciones
( ) X Q C C a K OUR OTR
dt
dC
O L O L
L
O
O
.
2
2
2
2 *
= = (Ec. 1)
Se simplifica a
OUR X Q
dt
dC
O
L
O
= = .
2
2
(Ec. 2)
La ecuacin dos, mediante la cual se puede obtener de la pendiente de la grafica de los
datos experimentales correspondiente a concentracin de oxgeno disuelto (despus de
haber parado el flujo de aire) vs. tiempo; el dato de biomasa se selecciona de los datos de
biomasa experimental a ese tiempo de realizacin de la prueba los datos experimentales y
es obtenido por la tcnica de peso seco.
Luego se restablece la aireacin, el flujo de aire se suministra de nuevo al sistema y se mide
el aumento de la concentracin de oxgeno en funcin del tiempo, hasta que alcanza una
concentracin de oxgeno estable, utilizando el valor estimado de la OUR, se puede
determinar el a K
L
, desde la medida del perfil de incremento de la concentracin de
oxgeno. Bajo estas condiciones, con la concentracin de la biomasa conocida, la ecuacin
1, se puede despejar la concentracin de oxgeno en medio lquido, tomando en cuenta el
tiempo en el cual el flujo de aire fue suministrado, como el valor de
2
O
L
C es conocido, se
aplica la siguiente ecuacin:
|
|
\
|
+ = X Q
dt
dC
a K
C C
O
L
L
O L
O
O 2
2
2
2
1
*
(Ec. 3)

Luego con el valor de X Q
O
2
, obtenido experimentalmente con los valores de la
concentracin de oxgeno consumido por el microorganismo, se ajustan los datos que
47

presentan una tendencia lineal, cuya pendiente es igual a a K
L
1 (Garcia-Ochoa y Gmez,
2009).
Para realizar el procedimiento anterior es necesario tomar en cuenta el tiempo de respuesta
del electrodo( )
r
, el cual es un parmetro crtico para la determinacin confiable de los
valores de la concentracin de oxgeno, ya que es un parmetro que puede afectar la
correcta determinacin del coeficiente de transferencia de masa.
El tiempo de respuesta del electrodo de oxgeno, es el tiempo que tarda el electrodo en
alcanzar el 63% del valor final de la medida estable de la concentracin de oxgeno
disuelto, cuando se ha realizado un cambio en la concentracin de oxgeno (Torres y
colaboradores, 2008). El valor de oxgeno disuelto en el medio de cultivo, que toma en
cuenta el tiempo muerto del electrodo se calcula con la siguiente frmula:

( ) ( )
( )
|
\
|
+ =
dt
t dE
k
t E T t E
e
1
'
(Ec. 4)

Donde ( ) T t E
'
es el valor del oxgeno disuelto sin retraso por el tiempo de respuesta del
electrodo, ( ) t E es el valor del oxgeno disuelto con retraso, T es el tiempo muerto del
electrodo,
e
k es el inverso del tiempo de respuesta, donde
r e
k 1 = . Al determinar
e
k por
medio de la pendiente de los valores del oxgeno disuelto ledos por el electrodo vs. el
cambio de concentracin de oxgeno en funcin del tiempo, se puede calcular el
r
. Si el
tiempo real del procedimiento experimental es mayor a 6 veces el
r
, implica que no hay
que hacer correccin por el tiempo de respuesta del electrodo. El valor de
r
, se determin,
transfiriendo el electrodo desde una solucin de agua caliente, la cual se considera
desgasificada y cuya concentracin de oxgeno es cero, hasta una solucin saturada con aire
al 100% (Gmez, 1995).
Con los resultados de la concentracin de OD se modelo la cintica de oxgeno como un
sustrato en la produccin del cido clavulnico y la formacin de biomasa. La tendencia de
la lnea modelada se compar con la cintica experimental del consumo de oxgeno
disuelto.
48

4.3.1.2 Obtencin de rendimientos tericos

De acuerdo a Pauline Doran (1995), se puede realizar un balance de materia en las
reacciones biolgicas, a partir de la estequiometra de la reaccin, cuando se conoce la
concentracin del sustrato, del producto de inters y de la biomasa. Para el cultivo de Sc en
el cual no se considera la produccin o formacin de cido clavulnico en el medio, ya que
es muy poca su produccin, por lo cual la conversin biolgica terica se puede representar
de la siguiente forma (Doran, 1995; Baptista_Neto y colaboradores, 2000):

O H CO Biomasa fsforo de fuente nitrgeno de fuente Oxgeno Glicerol
2 2
+ + + + + (Ec. 5)

Teniendo en cuenta la composicin especfica de la biomasa de la clula de Sc, estudiada en
medio qumicamente definido la cual es CH
1.77
O
0.51
N
0.225
P
0.020
K
0.028
presentada por Roubos
y colaboradores (2002), utilizando la fuente de nitrgeno del medio Gly-Asn, en este
caso el aminocido L-asparagina, cuya formula molecular es C
4
H
8
N
2
O
3
y teniendo en
cuenta el efecto de la concentracin de la fuente de fsforo, KH
2
PO
4
. Entonces la
estequiometria de la reaccin biolgica queda as:
O fH eCO P O N dCH PO cH O N H bC aO O H C
2 2 020 . 0 51 . 0 225 . 0 77 . 1 4 2 3 2 8 4 2 3 8 3
+ + + + +

(Ec. 6)

Donde
3 8 3
O H C es la formula molecular del glicerol, la principal fuente de carbn. Los
balances elementales de C, H, O, N y P dan como resultado las siguientes ecuaciones:
e d b C + = + 4 3 (Ec. 7)
f d c b H 2 77 . 1 2 8 8 + = + + (Ec. 8)
f e d c b a O + + = + + + 2 51 . 0 4 3 2 3 (Ec. 9)
d b N 225 . 0 2 = (Ec. 10)
d c P 020 . 0 = (Ec. 11)

Ecuaciones que constituyen un sistema de ecuaciones simultaneas, donde hay 6 variables a
determinar que son f y e d c b a , , , , , por lo cual se necesita de una ecuacin o variable
adicional con la cual se pueda resolver el sistema de ecuaciones simultaneas. Si se conoce o
49

se tiene un dato experimental, se puede resolver el sistema de ecuaciones y todos los
coeficientes estequiomtricos de la ecuacin 6. Con esta ecuacin tambin se pueden
determinar tericamente otros parmetros como son el cociente de respiracin (RQ), el
rendimiento de biomasa a partir de consumo de oxgeno ( )
2
O x
Y , el rendimiento de
produccin de CO2 a partir de sustrato ( )
x CO
Y
2
, los cuales se calculan de la siguiente
forma:

a
e
r
r
RQ
O
CO
=
=
2
2
(Ec. 12)

a
d
Q r
r
Y
O O
x
O x
= =
=
2 2
2
(Ec. 13)

e
r
r
Y
s
CO
x CO
=
=
2
2
(Ec. 14)

Los rendimientos calculados por medio de las ecuaciones 12, 13 y 14, sirven para
comparar el rendemiento del sistema experimental, as como para el diseo de sistemas ms
eficientes para la produccin de AC.
4.3.2 Cultivo en continuo

Con la eleccin del medio qumicamente definido, para realizar la fermentacin de
Streptomyces clavuligerus en continuo, se trabaj en el bioreactor Bioflo 110 como cultivo
tipo quimiostato, estrategia de operacin en estado estacionario; para seleccionar la tasa de
dilucin se tuvo en cuenta la mxima velocidad de crecimiento obtenida en lote, y a este
valor se tomo el 80%, , ver tabla 5 o 6, donde la mxima tasa de dilucin ( ) D , corresponde
al valor de la velocidad especfica de crecimiento del microorganismo y la cual establece
50

tambin el tiempo de residencia ( ) . Estos parmetros estn relacionados de la siguiente
forma:

V
F
D
F
V
D
= = =
1
(Ec. 14)

Donde F es el caudal volumtrico de entrada de medio de alimentacin y de salida de
medio de cultivo con clulas libres, V el volumen de lquido en el reactor.
Se realizaron fermentaciones en continuo empleando clulas de Streptomyces clavuligerus
en suspensin, a condiciones de operacin constantes de 28C, 500 rpm, 1 v.v.m. de
aireacin y un pH controlado de 6.8 0.2 (ver figura 4). El tiempo de residencia del
proceso fue el correspondiente a la tasa de dilucin evaluada (0.02 y 0.03 h
-1
); el sistema
oper en lote por un perodo de 36 horas antes de iniciar la operacin en continuo. El flujo
de entrada y salida de medio se hacen mediante una manguera maxterflex estril, conectada
a una bomba peristltica que garantiza los flujos de trabajo. La toma de muestras se realiz
cada 12 horas en un recipiente especial para la toma de muestra, hasta lograr tres tiempos
de residencia en el estado estable.

Figura 4. Ilustracin del montaje del biorreactor en quimiostato en operacin.

1. Dispositivo de toma de muestras; 2. UPS (Sistema de energa ininterrumpida); 3. CPU (Unidad central de procesamiento) y visor / display;
4. Unidad de control de nivel de medio y nivel de espuma; 5. Unidad de control de oxgeno y de pH; 6. Unidad de control de temperatura,
velocidad de agitacin y encendido de las bombas peristlticas; 7. Rotmetro o medidor de flujo de entrada de aire.
Suministro de
Energa

Suministro de
Agua de
enfriamiento
Salida
de Agua
Motor del
agitador
Medio de
alimentacin
Bombas
peristlticas NaOH
HCl
1 2
3
4
5
6
7
Medio de
salida o
descarga
51

4.4 Mtodos Analticos

Las muestras analizadas fueron tomadas en el sistema cada 12 horas, centrifugadas a 14000
rpm, 4 C por 10 minutos. Los pellets resultantes se emplearon para determinar la
concentracin de la biomasa y los sobrenadantes fueron utilizados para otros anlisis de la
siguiente manera: el filtrado se recoge, parte de este filtrado se derivatiza para posterior
anlisis de AC y la otra parte se almacena a -20C para posteriores anlisis de glicerol,
amonio y fosfato; en el caso de medio complejo se hizo peso seco por DNA.
En el proceso en lote y en continuo realizadas en el biorreactor, utilizando el medio Gly-
Asn, el volumen de la muestra era de aproximadamente 4 mL, de los cuales 1 mL se
utilizaba para determinar biomasa y los tres restantes se utilizaban para determinacin de
sustratos y el producto en el medio de cultivo, as como la verificacin constante de no
contaminacin en el sistema. Las tcnicas analticas utilizadas se enumeran a continuacin.
4.4.1 Anlisis de determinacin de biomasa

Se utilizaron tres tcnicas para cuantificar el crecimiento del microorganismo, densidad
ptica por espectrofotometra, peso seco y DNA. El crecimiento celular monitoreado por la
tcnica de densidad ptica OD
600
. A 100 L de caldo de cultivo con clulas, se adiciona
900 L de agua destilada, esta solucin se homogeniza en vrtex (Snchez y Braa, 1996).
En la figura 5, se presenta la curva de calibracin empleada para determinar la
concentracin de biomasa en medio TSB, utilizada como parmetro o criterio para
inocular los medios de produccin, a una concentracin de biomasa 0.5 g de biomasa/ L.
La concentracin de biomasa en los medios de cultivo, se determin por la tcnica de peso
seco, para los medios qumicamente definidos. Por medio de esta tcnica se midi el
crecimiento de la bacteria Sc; este mtodo se basa en obtener muestras de medio fresco, a
un volumen determinado, generalmente 1 mL, filtrar con un papel de filtro 0.2 m,
previamente presecado y prepesado, luego se lleva con la muestra a 105C por 4 horas,
hasta sequedad total. Se pesa el papel de filtro secado con muestra, a este valor se le resta el
peso inicial del papel de filtro presecado sin muestra y el resultado se divide por el volumen
52

de la muestra, obtenindose as la concentracin de la biomasa en un tiempo determinado
(Bushell y colaboradores, 2006).

Figura 5. Curva de calibracin para la determinacin de biomasa en medio TSB.

La concentracin de la biomasa en medio complejo, se cuantific usando la tcnica de
DNA con el mtodo de la difenilamina (Burton,1956), ya que como el medio es complejo,
no es posible determinar la biomasa del microorganismo por medio de un mtodo directo.
En esta tcnica la biomasa fresca se extrae en caliente con cido perclrico y son estimadas
por comparacin con una solucin estndar de DNA de esperma de arenque (Sigma), con
una concentracin de 100 g/mL en NaOH 5 mM. A 400 L de muestra (caldo de cultivo,
solucin de DNA estndar), se adicionan 400 L de cido perclrico 1M, se homogeniza y
se colocan a 70C por 15 minutos, luego se le agregan 800 L de difenilamina con
acetaldehido acuoso al 1.6% y se incuban a 30C por 15 a 17 horas; con este procedimiento
se obtiene la concentracin de DNA de la Sc en unidades de g/mL y se relaciona con el
peso seco de biomasa por medio de la relacin de 3g de DNA hay por cada 100 g de
biomasa. En la figura 6, se presenta la curva de calibracin empleada para los anlisis de
concentracin de biomasa, para cuantificar la concentracin de biomasa de Sc en medio
complejo.
53

Figura 6. Curva de calibracin para la determinacin de DNA en medio complejo.

4.4.2 Viabilidad del microorganismo y control de contaminacin

La salud y viabilidad de la bacteria se valoro por medio de dos formas, se utiliz la tcnica
de observacin en fresco del medio de cultivo, que permite detectar el movimiento
microbiano y la no contaminacin del medio de cultivo (ver figura 7) y por medio de la
tcnica de coloracin de Gram, que permite diferenciar tipos morfolgicos microbianos, as
como visualizar la morfologa de la Sc (Lodish et al., 2006).

(a) (b)
Figura 7. Imagen de la bacteria Sc en microscopio (x 40);
(a) En medio fresco; (b) Con coloracin de Gram.

54

4.4.3 Determinacin de glicerol

Para cada una de las muestras tomadas en las fermentaciones se realizaron seguimientos al
sustrato (glicerol como fuente de carbono) mediante la tcnica de espectrofotometra. Este
mtodo se basa en la reaccin de oxidacin de alditoles por el metaperyodato sdico,
NaIO
4
, para producir formaldehido, de la siguiente forma: a 1 mL de muestra de caldo de
fermentacin adecuadamente diluido, se le adiciona 1 mL de solucin de metaperyodato
sdico 0.015M en HCl 0.12M, se deja reaccionar por 10 minutos a temperatura ambiente y
a la solucin resultante se le adicionan 2 mL de solucin de L-rhamnosa al 0.1% a cada
muestra para remover el exceso de iones peryodato. Se agita bien hasta homogenizacin
total, luego adicionar 4 mL de solucin de reactivo de Nash (150 g/L de acetato de amonio,
20 mL/L de cido actico glacial, 2 mL de 2-4 pentanodiona y aforar con agua destilada
hasta completar 1 L de solucin), despus se debe agitar de nuevo, esta mezcla se lleva a
bao mara a 53C por 15 minutos hasta obtener un producto de color amarillo, la cual se
puede leer a una absorbancia de 412nm. Se utiliz como sustancia estndar una solucin de
glicerol al 95% de pureza. La curva de calibracin empleada para la determinacin de
glicerol, se presenta en la Figura 8 y se obtiene en un rango de 0 a 25 g (Lynch y Yang
2004; Hae Bok y Demain 1977).

Figura 8. Curva de calibracin para determinacin de glicerol por espectrofotometra.
55

4.4.4 Determinacin de fosfato

La concentracin de iones fosfato se determin utilizando la tcnica del ortofosfato
molibdato. La cual se basa en la formacin del cido molibdofosfrico en una solucin con
H
2
SO
4
, a partir de los iones ortofosfato (PO
4
3-
) e iones molibdato; el cido
molibdofosfrico se reduce luego a fosfomolibdeno azul, es un complejo coloreado el cual
se le puede medir por espectrofotometra, permitiendo as cuantificar la concentracin de
los iones fosfato. Para aplicar est tcnica, se prepara una mezcla de reactivos que
contienen 1 mL de H
2
SO
4
6N, 2 mL de agua destilada, 1 mL de molibdato de amonio al
2.5% y 1 mL de cido ascrbico al 10%, de esta solucin se toman 500 L y se le adicionan
500 L de la muestra diluida adecuadamente, esta mezcla se homogeniza y se incuba en
bao mara a 37C por 2 horas, donde se forma un complejo azul, que se deja enfriar y se
cuantifica por espectrofotometra a una longitud de onda de 828 nm. Los lmites de
deteccin de el mtodo son de 0-8 g PO
4
3-
/mL, rango en el cual el mtodo es muy estable.
Se emple como sustancia estndar K
2
HPO
4
, con un pureza de 98%. En la figura 9 se
presenta la curva de calibracin empleada para la determinacin de la fuente de fosfato
(Saudagar y Singhal 2007; Chen y colaboradores, 1956).

Figura 9. Curva de calibracin para determinacin de la fuente de fosfato por espectrofotometra

56

4.4.5 Determinacin de nitrgeno

La concentracin de la fuente de nitrgeno se determin de dos formas distintas en los
medios qumicamente definidos. En el medio de Bushell, la concentracin de amonio se
determino usando una tcnica colorimtrica de Nessler, su uso fue reportado por Bushell
(2006), en esta tcnica los iones NH
4
+
reaccionan con el reactivo de Nessler, produciendo
un compuesto de color entre amarillo a marrn, dependiendo de la concentracin de
amonio. El reactivo de Nessler es una solucin de yoduro de mercurio, la cual se forma con
una solucin de yoduro de potasio 6.02M, a la que se le adiciona lentamente una solucin
saturada de dicloruro mercrico, con agitacin constante, luego se le adiciona 400 mL
NaOH 6 M y se afora a 1 L con agua grado HPLC, se deja en reposo entre 24 horas a una
semana, tiempo durante el cual se forma un precipitado, el cual se debe filtrar para
descartar. El reactivo de Nessler es el sobrenadante. A 1mL de la muestra diluida, se le
adicionan 2 gotas del reactivo de Nessler, se homogeniza y se deja en reposo por 10
minutos, tiempo durante el cual se desarrolla el complejo de color amarillo, el cual se puede
cuantificar por espectrofotometra a 425 nm. El rango de deteccin del mtodo es de 20 a
180 mg de NH
4
+
/L. Se empleo como sustancia estndar el NH
4
Cl de 98% de pureza. La
curva de calibracin utilizada para la cuantificacin de la concentracin de iones NH
4+
,

se
muestra en la figura 10 (Vogel y Svehla, 1979).

Figura 10. Curva de calibracin para determinacin de la fuente de amonio por espectrofotometra.

57

En el medio Gly-Asn, la fuente de nitrgeno de determino por HPLC. El uso de este
mtodo ha sido referenciado por Ives y Bushell (1997) y descrito por Jones (1986). 10 mL
de medio con biomasa, se centrifuga por 15 minutos a 5000 rpm, se retira el sobrenadante y
a este se la adicionan 5 mL de HCl 6 M, se hidroliza a 110C por 22 horas, se neutraliza y
ajusta el pH a 2.2 con buffer citrato 0.02 N, se afora la solucin a 100 mL con la misma
buffer (Umagat y Kucera, 1982); de la solucin anterior se toma una alcuota de 10 mL y se
filtra con un papel de tamao de poro 0.22 m y luego se inyecta 0.5 L de la muestra al
HPLC, instrumento que utiliza una columna Zorbax Eclipse AAA, con una longitud de 150
mm, un dimetro interno de 4.6 mm y un dimetro de poro de 3.5 m; Se eluy con
gradiente de la fase mvil, a partir de una mezcla de las soluciones de 40 mM NaH
2
PO
4
a
pH 7.8 ajustado con una solucin de NaOH 10N y de Acetonitrilo: Metanol:Agua en una
relacin de 45:45:10 v/v/v a 2 mL/min. Previo al anlisis de la muestra se paso una mezcla
de estndares de aminocidos (Agilent Technologies S.A.), la cual se derivatiza en lnea
con OPA (o-ftalaldehido), que reacciona con los aminocidos primarios y el FMOC-Cl
(cloruro de 9-fluoroenilmetil cloroformato) que reacciona con grupos aminos secundarios.
El aminocido L-Asparagina se detecta por espectrofotometra UV-Vis a una longitud de
onda de 338 nm. La curva de calibracin utilizada para la cuantificacin de la
concentracin de L-Asparagina por HPLC se observa en la figura 11.

Figura 11. Curva de calibracin para determinacin de Asparagina por HPLC

58

4.4.6 Determinacin de cido clavulnico

La concentracin de cido clavulnico se determin por HPLC, con el mtodo descrito por
Foulstone y Reading (1982), ha sido referenciado por Bushell (2006) y Snchez (2012),
donde el sobrenadante del caldo de fermentacin filtrado, reacciona con una solucin de
imidazol 3M (pH 6,8) a 37C por 30 minutos en una proporcin de 3:1 respectivamente. El
derivado de imidazol se detecta a una longitud de onda de 321 nm, donde la lectura se
realiza por comparacin de una curva patrn con un solucin de Curam de 250mg/5mL en
polvo para suspensin oral, cada 5 mL de suspensin contienen 250 mg de amoxicilina,
62.5 mg de cido clavulnico y 8.5 mg de aspartamo. El mtodo se llevo a cabo con una
columna especial para cido orgnicos de 250 mm de longitud por 4.6 mm de dimetro
interno, donde el derivado del imidazol (50L) se puede analizar a 312 nm, la fase mvil
consiste de una solucin buffer fosfato de KH
2
PO
4
50 mM (donde el pH es ajustado a 3.2
con H
3
PO
4
) y 6% de metanol (CH
3
OH), a una velocidad de flujo de 1mL/min (Snchez y
colaboradores, 2012). En la figura 12 se presenta la curva de calibracin utilizada para la
cuantificacin de la concentracin cido clavulnico por HPLC.

Figura 12. Curva de calibracin para determinacin de cido clavulnico por HPLC

59

4.4.7 Reproducibilidad y replicacin de los experimentos

Todos los resultados experimentales de matraz fueron obtenidos de cultivos individuales.
Los experimentos fueron llevados a cabo por triplicado para asegurar que las tendencias de
los datos y las relaciones observadas en los parmetros medidos del cultivo son
reproducibles.
Los resultados experimentales de biorreactor se obtuvieron de cultivos individuales y se
realizaron por duplicado para mayor confiabilidad y reproducibilidad de los resultados.
4.5 Determinacin de la cintica de fermentacin

La cintica de fermentacin se evalu en matraces de 500 mL con un volumen de trabajo de
100 mL, el cual se inocula con 10% v/v, a 28C, pH entre 6.8-7.0 y agitacin de 220 rpm.
En biorreactor de 3L con un volumen de trabajo de 1 L e inculo del 10% v/v. La
temperatura se ajust y controlo a 28C, con un pH inicial entre 6.8 -7.0, la aireacin 1
v.v.m y con agitacin de 500 rpm. El cual se oper en inicialmente en lote y posteriormente
en lote y continuo. Se tomaron muestras cada 24 h, para cuantificar la formacin de
biomasa, produccin de cido clavulnico y el consumo de glicerol. Informacin mediante
la cual se obtuvo el comportamiento cintico de la fermentacin.
Con base en est cintica se desarroll un modelo matemtico con el fin de predecir las
velocidades de crecimiento, consumo de sustrato y formacin del producto en funcin de
las condiciones del cultivo.
4.6 Modelado

El modelo planteado para el desarrollo de este trabajo, es un modelo matemtico
macroscpico y semifsico de base fenomenolgica, constituido por 3 ecuaciones
diferenciales de parmetros concentrados, en su mayora no lineales, ecuaciones capaces de
reproducir el crecimiento del microorganismo, el consumo de sustrato y la produccin del
metabolito de inters donde el fenmeno limitante en el modelo es el consumo de sustrato.
El procedimiento para modelar, ajustar, validar y realizar el anlisis de sensibilidad de los
parmetros de modelo, se presenta en la figura 13.
60

Figura 13. Diagrama de flujo de la secuencia del proceso de Modelamiento matemtico, anlisis de regresin
y validacin del modelo planteado.
Los principales supuestos del modelo son:
El nutriente limitante es el sustrato.
Valores semilla de
los parmetros
( )
d p x s x
k Y Y b , , ,
0
=

Conjunto de datos
experimentales.
) ( : , t f P y S X

Proceso (Lote)

Desarrollo experimental y
adquisicin de datos

Modelo matemtico
Estimacin de parmetros (b)
0 = |
\
|

=
b
b
Funcin objetivo.
Anlisis estadstico

Teora y literatura
Simulacin: integracin de las
ecuaciones diferenciales

Funcin: ODE45
(Runge Kutta 4/5 orden)
Mediante: MATLAB 2008b
i i i
P S X , ,
Anlisis de
regresin no
lineal de
mnimos
cuadrados
Valores iniciales
de las variables.
(Experimentales)

No
Si
Mtodo:
Levengerg-Marquartd
Mediante MATLAB 2008b
Mediante:
Anlisis de varianza
Validacin del modelo
95% de confiabilidad
Si

No
Anlisis de sensibilidad de los
parmetros estimados

Fin
Modelo

Nuevo conjunto de
datos
experimentales.

) (
estimados P
b f S
i
=
estimados
b
61

El volumen de reaccin, la temperatura, la aireacin, el pH y la velocidad de agitacin
son constantes durante el cultivo.
La produccin de metabolitos secundarios como los antibiticos, utilizando Sc se lleva a
cabo en reactores que pueden ser realizados en cultivos en lote, en lote alimentado y en
continuo, todo con el objetivo de incrementar la produccin de AC.
Es un reactor CSTR donde se lleva a cabo una fermentacin, la reaccin se puede expresar
de la forma:
X P X S + + (Ec. 15)

Donde S es el sustrato (fuente de carbono), X es la biomasa y P es la concentracin del
producto. Se pretende obtener un modelo matemtico que describa el proceso, se asume el
volumen de reaccin, pH, temperatura, agitacin, nivel y aireacin constantes. Lo cual se
puede representar como se muestra en las figura 14, 15 y 16.
Representacin Grfica:

Figura 14. Diagrama de bloques del sistema.

Figura 15. Diagrama del sistema en vista transversal.

dQ/dt
t
Lado de interno
de espiral
Xo, S
Fo, To
X, P
F, T
Reactor: Lado de
Reaccin
Ro
FRo, TRo
R
FR,, TR

S, X

Fo,To,So
FRo,TRo
Ro
T Cx
X, P
R
F, T, P
FR,TR
62

Figura 16. Diagrama de flujo de informacin.

Obtencin de un modelo semifsico de base fenomenolgica
El proceso se ha dividido en dos unidades, cada una con caractersticas funcionales bien
definidas (Ver figura 14).
Fenmeno controlante:
Al tratarse de una fermentacin el fenmeno controlante es la conversin del sustrato
(Glicerol) en el producto (AC); de una manera similar lo hace el nivel al afectar el rea de
transferencia de calor entre el fluido de servicio y el seno de la reaccin, por lo que se
concluye que la dinmica de segundo nivel es la temperatura en el reactor.
Suposiciones iniciales
i. Se asume agitacin perfecta, lo que implica propiedades uniformes dentro del reactor,
por lo tanto el flujo de salida tiene las mismas propiedades que el contenido del
reactor, razn por la cual se pueden utilizar en el modelo parmetros concentrados
ii. Los fluidos son lquidos incompresibles
iii. Las propiedades como el Cp y la densidad son constantes con la temperatura (rango
de operacin de T estrecho) e iguales para todos los fluido sin involucrados en el
sistema (sistema acuoso diluido)
iv. No se presenta prdida de masa y energa por evaporacin.
v. El tanque es cilndrico, por lo cual rea del tanque es constante.
vi. Las componentes de la energa cintica y la energa potencial son despreciables, por
lo tanto E
Total
= U
Sistema
.
vii. Al tratarse de una reaccin biolgica, puede despreciarse el calor de la reaccin en los
balances de energa, debido a que este no es significante comparado con las otras
magnitudes.
viii. No existe trabajo mecnico de expansin, ni de compresin, W=0.
S, X
Fo,To,So
FRo,TRo
Ro
V
X, P
R
F, T, P
FR,TR
63

ix. El sistema no se ve afectado por los cambios de momentum provenientes del agitador
mecnico.
x. El sistema puede considerarse de parmetros concentrados.
xi. El volumen del espiral es mucho menor que el volumen donde se da la reaccin.
xii. La reaccin es de estado cuasi-estacionario. (es decir hay un tiempo de residencia
corto y un periodo de operacin largo).
xiii. El aumento de las incrustaciones en el rea de transferencia de calor no es
significativo para el tiempo de anlisis.

Planteamiento de ecuaciones
Principio de conservacin.
sistema del
volumen el en
neto Consumo
sistema
del neta
Generacin
sistema
del neta
Salida
sistema
al neta
Entrada
tiempo el en
neta
n Acumulaci
(Ec. 16)

Ecuaciones diferenciales de leyes de conservacin (Fenomenologa principal).
Durante el desarrollo matemtico se llamara S al glicerol, P al producto o AC y X a la
biomasa.
Ecuaciones de balance de Masa (Sistema Abierto)
Reactor: Lado reaccionante, balance de materia por componentes. Dinmica de
Concentracin.

C G f i
R R M M
dt
dM
+ =

(Ec. 17)
Donde
dt
dM
es el cambio en el contenido de masa en el sistema con respecto al tiempo,
i
M
es el caudal msico que entra al reactor,

f
M
es el caudal msico que sale del reactor,

G
R es la velocidad de generacin de materia por reaccin y
C
R es la velocidad de consumo
de materia por reaccin.
Balance por componente S :
64

V r S F S F V
dt
dS
S i
=
(Ec. 18)
Balance por componente X :
V r V r X F X F V
dt
dX
d X i
+ =
(Ec. 19)

V r P F P F V
dt
dP
P i
+ =
(Ec. 20)

Donde las ecuaciones (18), (19) y (20) representan el comportamiento dinmico de la
biomasa, el sustrato y el producto.

Ecuaciones constitutivas
Se consideran las velocidades volumtricas como reacciones de primer orden, ya que son
las ms utilizadas en la literatura (Godia Casablancas y Lpez Santn, 1998). Donde
x
r es la
velocidad volumtrica de crecimiento (g X/L.h);
d
r es la velocidad volumtrica de muerte
celular (g X/L.h);
s
r es la velocidad volumtrica de consumo o utilizacin del sustrato (g
S/L.h) y
p
r es la velocidad volumtrica de formacin de metabolito secundario (g P/L.h) y
se definen como:
X r
x
. = (Ec. 21)
X k r
d d
. = (Ec. 22)
s x
s
Y
X
r

= (Ec. 23)
p x
p
Y
X
r
.
= (Ec. 24)
V
F
D = (Ec. 25)

Donde es la velocidad de crecimiento especfica (h
-1
),
d
k es la constante de muerte (h
-1
),
s x
Y es el rendimiento de biomasa a partir de sustrato (g de biomasa/g de sustrato),
p x
Y es el
rendimiento de biomasa a producto (g de biomasa/g de producto) y F es el flujo de la
corriente de entrada o salida del reactor cuando el sistema se encuentra en continuo (L/h).
65

El metabolismo secundario se activa en las etapas finales de la fase de crecimiento de los
microorganismos, esta fase se conoce como idiofase, se condiciona por los cambios en las
condiciones fisiolgicas determinadas por las limitaciones de nutrientes, la disminucin de
la velocidad de crecimiento especfica, la presencia de una alta densidad celular u otro
factor de estrs metablico, que en conjunto o de manera individual, ponen en marcha el
metabolismo secundario. Este retraso en el inicio del metabolismo secundario, se relaciona
con la velocidad de crecimiento especfica en el microorganismo, se determina
genticamente e implica, posiblemente, un incremento de la probabilidad de supervivencia
para el organismo productor (Godia Casablancas y Lpez Santn, 1998).

Si la velocidad volumtrica de crecimiento de biomasa se expresa por medio de una
cintica exponencial, se expresa as:
X
dt
dX
r
x
. = = (Ec. 26)

El crecimiento especfico de las clulas es un fenmeno muy complejo, pero se han
obtenido descripciones globales razonablemente buenas, utilizando ecuaciones simples. La
ms comn, es la ecuacin de Monod, que describe el crecimiento celular en funcin de
la disponibilidad de sustrato limitante y se expresa as:
S K
S
s
+
=
.
max
(Ec. 27)

Donde
max
es la velocidad mxima de crecimiento especfica (h
-1
) y
s
K es la constante de
Monod, conocida como la constante de saturacin para el sustrato limitante (g S/L),
relacionada el crecimiento a un sustrato limitante de la siguiente manera, si S es >>> que
s
K , entonces el valor de
s
K es el valor de la concentracin de sustrato limitante del
crecimiento del microorganismo, concentracin a la que
2
max
= . Por lo cual el
crecimiento disminuye una vez que los sustratos limitantes comienzan a agotarse. Esta
ecuacin es muy utilizada por su simplicidad y con ella se puede obtener una buena
66

representacin de los datos de crecimiento de un microorganismo. Tambin podemos
encontrar la ecuacin de Contois:
S X K
S
s
+
=
.
max
(Ec. 28)

La ecuacin 28, relaciona el crecimiento del microorganismo a un sustrato limitante y la
densidad celular; modela mejor los perfiles de una cintica microbiana, cuando las
concentraciones de biomasas son altas (Gelmi Weston, 1999).
La cintica de consumo de sustrato y formacin de producto, depende de cada
microorganismo y se pueden clasificar de la siguiente manera (Dunn y colaboradores,
2003):
Tipo I: Producto asociado al crecimiento, donde la formacin del metabolito, es funcin la
velocidad de consumo de sustrato y de la formacin de biomasa. La energa libre de
reaccin es menor que 0, por lo tanto la formacin del producto es espontanea.
Tipo II: Producto parcialmente asociado al crecimiento, la formacin del metabolito no
depende del consumo del sustrato. La energa libre de reaccin es menor que 0, entonces la
formacin del producto es espontanea.
Tipo III: Son productos no asociados al crecimiento, la formacin del metabolito
(generalmente secundario), no es funcin del consumo de sustrato, adicionalmente la
energa libre de reaccin es mayor que 0, por lo tanto la formacin del producto no se da
espontneamente, si no que hay que inducir el metabolismo del microorganismo para que
se produzca el metabolito de inters. Se puede presentar tambin como una combinacin de
la velocidad de crecimiento especfica y la concentracin celular con un trmino que no
depende de la velocidad de crecimiento especfica.

Reactor: Lado interno del espiral.
El fluido de servicio es agua, lquido incompresible, (densidad es constante,
Ro R
= ),
entonces no hay acumulacin de materia en la chaqueta
R Ro
F F = .
67

Verificacin de consistencia dimensional: El anlisis de consistencia dimensional, se le
hizo a cada ecuacin correspondiente al nmero de la ecuacin utilizada, y que es
importante para los resultados en el modelo planteado.
Modelo matemtico propuesto en este trabajo:
El modelo para el proceso de produccin de AC a partir de Sc, se obtiene realizando
balances de masa por componentes en un sistema en lote para la biomasa, el sustrato y el
producto. Para la velocidad de crecimiento especfica se propuso el modelo de Monod (Ec.
27). Aunque se ha observado que en cultivos de Sc, la viscosidad del caldo se incrementa
con el aumento de la concentracin de la biomasa (Baptista_Neto y colaboradores, 2000),
entonces la viscosidad genera reduccin en la transferencia de masa y esto puede limitar la
velocidad de crecimiento. Estos fenmenos son representados por la cintica tipo Contois
(Ec. 28), en la que la velocidad especfica de crecimiento es inversamente proporcional a la
biomasa.
4.7.1 Modelado de la cintica en una fermentacin en lote

En un proceso en lote, no hay materia (clulas del microorganismo, sustratos o producto)
que entre ni salga; la biomasa se genera por duplicacin, creciendo equilibradamente, de
manera exponencial y luego muere. El sustrato se consume, no hay producto al inicio de la
reaccin, pues el producto se genera. Se considera que en el bioreactor hay una mezcla
perfecta en un volumen constante, por lo tanto las cinticas de la biomasa, el sustrato y la
formacin del producto se deducen de la siguiente forma:

Cintica de la Biomasa
La cintica de formacin de biomasa se define por un balance de materia dinmico, ya que
es una variable que cambia con respecto al tiempo. En una fermentacin en lote, solo hay
generacin de biomasa y esta se representa mediante el trmino, XV V r R
x G
= = , el cual
considera una tasa de crecimiento especfica; se considera tambin el trmino de muerte
celular para el microorganismo, el cual se representa por el trmino de consumo
XV k V r R
d d C
= = , asumiendo una cintica de muerte de primer orden, ya que es la ms
utilizada en la literatura (Doran, 1995), el volumen de trabajo es constante, el cual se
68

representa por V . De lo anterior se puede deducir que la ecuacin para la cintica de
formacin de la Biomasa est representada por la ecuacin 29.
( )X k
dt
dX
d
= (Ec. 29)
Consumo de la fuente de sustrato
Para la cintica de consumo de sustrato en un proceso en lote, no entra ni sale material del
biorreactor, el primer termino de la cintica, es asociado al crecimiento del
microorganismo, aportando los elementos necesarios para la sntesis de biomasa y la
energa necesaria para este proceso. El sustrato no se genera, entonces 0 =
G
R , pues solo es
consumido por el microorganismo para su crecimiento, formacin de producto y energa
para el mantenimiento celular. Como el producto de inters es un metabolito secundario, se
desprecia el trmino por mantenimiento, el cual considera el aporte de energa para
mantener vivo al microorganismo y el aporte de los materiales necesarios para la formacin
de productos extracelulares, entonces la cintica toma para el trmino de consumo de
sustrato, solo lo que el microorganismo consume para la formacin de la biomasa, el cual
se representa por el trmino de consumo V r R
s C
= ; se trabajo a un volumen de trabajo
constante, el cual se representa por V . De lo anterior se puede deducir la ecuacin para la
cintica de consumo del sustrato, la cual es representada por la ecuacin 30.

X
Y dt
dS
s x
.
= (Ec. 30)

Produccin de cido clavulnico
La velocidad neta de produccin del AC est representada por un trmino de produccin
especfica, el cual sigue una cintica tpica de metabolito secundario y de produccin de
cido clavulnico, independiente del crecimiento de la bacteria (Duarte Torres, 1995). En el
proceso en lote, el producto no se consume, entonces el trmino 0 =
C
R ; el producto se
genera o produce, lo cual se representa por el trmino de produccin V r R
p G
= . Se trabaj a
un volumen constante, el cual se representa por V . De lo anterior se puede deducir la
ecuacin 31, que representa la formacin del cido clavulnico.
69

X
Y dt
dP
p x
.
|
|
\
|
+ =
(Ec. 31)

La velocidad de consumo de glicerol se representa como una funcin directa de la
velocidad de crecimiento microbiano (Ec. 30) y la velocidad de produccin de cido
clavulnico, se representa como una funcin aditiva de la velocidad de crecimiento
microbiano y la concentracin de biomasa (Ec. 31) es decir, se representa como un
metabolito producido con un aporte del metabolismo primario y un aporte del metabolismo
secundario. La estimacin de los parmetros del modelo cintico y la solucin numrica de
las ecuaciones diferenciales que representan el modelo, se realizaron empleando el mtodo
de regresin no lineal de mnimos cuadrados, basado en el algoritmo de Levenberg-
Marquardt, asociado con la herramienta ODE45 de Matlab 2008b.

Oxgeno disuelto en el medio
El oxgeno disuelto durante el transcurso de la reaccin en la fermentacin en un proceso
por lote, se puede estudiar desde la transferencia de materia gas-lquido, debido que es un
proceso aerbico y hay necesidad de suministrar oxgeno como un sustrato. El
microorganismo tomara el oxgeno del lquido lo cual depende de la solubilidad del
oxgeno en soluciones acuosas, que a temperatura y presin ambientales es muy pequea y
por lo tanto rpidamente consumida. Un biorreactor bien diseado para cultivos aerbicos,
debe proporcionar condiciones ptimas de transferencia de materia. El oxgeno disuelto se
representa matemticamente por un trmino de velocidad de transferencia de materia
menos un trmino de velocidad de consumo de oxgeno; El primer trmino, est constituido
por un coeficiente de transferencia de oxgeno de la fase lquida por el rea interfacial
lquido-gas a K
L
, multiplicado por la diferencia ( )
OD
C C
*
, entre la concentracin de
oxgeno en el medio de cultivo en equilibrio con la fase gas o la mxima concentracin
posible en el medio ( )
*
C , conocida tambin como la solubilidad y la concentracin de
oxgeno disuelto en el medio de cultivo ( )
OD
C , que simboliza la fuerza impulsora para la
transferencia de masa. El segundo trmino, velocidad de consumo de oxgeno, que est
70

formado por la velocidad especfica de consumo de oxgeno ( )
2
O
Q y la concentracin de
celular que hay en el medio de cultivo (Garca-Ochoa y Gomez, 2009). La concentracin de
oxgeno disuelto en el medio de cultivo se determina mediante la ecuacin 32, donde los
trminos a K
L
,
*
C y
2
O
Q son medidos experimentalmente.
( ) X Q C C a K
dt
dC
O OD L
OD
2
*
= (Ec. 32)

4.7.2 Estimacin de parmetros

El modelo matemtico est compuesto de ecuaciones diferenciales con variables mltiples
dependientes, de la forma:
( ) b y x g
dt
dY
, , = (Ec. 33)
Donde
dt
d
es el vector de las derivadas de Y , siendo y una funcin cualquiera; g es el
vector de funciones, x es la variable independiente, y es el vector de las variables
dependientes y b es el vector de parmetros que minimiza la suma de los cuadrados de los
residuales con respecto a b de la siguiente forma 0 =

b
, siendo est la funcin
objetivo a cumplir en la estimacin de los parmetros. es no lineal con respecto a los
parmetros, por lo tanto se deben ajustar las funciones no lineales por mnimos cuadrados y
se logra por un mtodo iterativo, que involucra una serie de aproximaciones lineales, en
cada etapa de la iteracin, los cuadrados lineales pueden ser usados para obtener la prxima
aproximacin, este mtodo aproxima la funcin por una expansin de una serie de
Taylor alrededor de un valor estimado del vector de parmetros b , de la siguiente manera:

( ) ( ) ( )
( )
b J Y b
b
Y
b x Y b b x Y b x Y
m
b
m m
+ =
+ = + = , , , (Ec. 34)

71

La anterior serie de Taylor es truncada despus del segundo trmino y el proceso se fija en
encontrar la correccin del vector de parmetros b . Este vector b puede ser estimado y
las ecuaciones diferenciales pueden ser integradas numricamente o analticamente.
El gradiente de una funcin escalar es un vector que da la direccin de un incremento de la
funcin en algn punto, donde el vector inicial de parmetros estimados es corregido en la
direccin del gradiente negativo de , se hace de la siguiente forma:
|
\
|

=
b
b (Ec. 35)
b es el vector corregido para ser aplicado al valor estimado de b para obtener un nuevo
estimado para el vector de parmetros.
( ) ( )
b b b
m m
+ =
+1
(Ec. 36)
Donde mes el nmero de la iteracin
( ) ( )
( ) =
|
\
|

=
|
\
|

=
*
* *
' 2
'
J
b b
b
(Ec. 37)
Entonces
*
Y es el vector de los datos experimentales, Y es el vector de los datos estimados
desde las ecuaciones del modelo, J es la matriz Jacobiana de las derivadas parciales de
con respecto a la evaluada en todos los n puntos donde hay observaciones o datos
experimentales y est dada por:
(
(
(
(
(
(
(
(

=
v
n n
v
b b
b b
J
....... ....... .......
. . .
. . .
. . .
..... ........ .......
1
1
1
1
(Ec. 38)

Donde ' J es la transpuesta de la matriz Jacobiana calculada. Las ecuaciones diferenciales
son resueltas simultneamente mediante el uso de mtodos numricos, el desarrollo
matemtico de estos procesos se lleva a cabo con el anlisis de regresin no lineal a partir
de datos experimentales. Para esto existen mtodos matemticos, con los cuales se realiza
estimacin de parmetros y su respectivo anlisis estadstico (Marquardt, 1963;
Constantinides y Mostoufi, 2000); el mtodo de Levengerg-Marquartd es una tcnica de
interpolacin con la cual se puede realizar un anlisis de regresin mltiple no lineal, donde
72

se tienen v variables dependientes en el modelo (X, S y P) donde la suma ponderada de
cuadrados residuales es dada por:

( ) ( )
=
=
v
j
j j j
b J b J
1
*
'
*
(Ec. 39)
Tomando la derivada parcial de con respecto a b , igualando a cero y resolviendo b ,
luego adicionando una matriz diagonal I a la matriz J J
'
, se obtiene:
( ) ( ) + = = |
\
|

* '
1
'
0 J I J J b
b
(Ec. 40)
es un factor de escala, que da un tamao pequeo de paso en cada iteracin, y su valor es
encontrado en cada iteracin, as el vector de parmetros corregido, disminuye la suma de
los cuadrados de los residuales en la siguiente iteracin.

Para aplicar el mtodo de Levengerg-Marquardt se debe tener en cuenta lo siguiente:
1. Se asume o supone valores iniciales para el vector de parmetros b , puede ser cualquier
valor. Se recomienda dar valores referenciados en bibliografas asociadas a trabajos
similares al modelo que se est trabajando.
2. Se asigna inicialmente un valor grande a , inicialmente se recomienda 1000.
3. Se evala la matriz Jacobiana, representada por la ecuacin 38, desde las ecuaciones
cinticas del modelo.
4. Se calcula b por medio de la ecuacin 40.
5. Se evala el nuevo estimado del vector de parmetros por medio de la ecuacin 36.
6. Se calcula el valor de . Si
m m
>
+1
, se mantiene el valor de los parmetros
estimados en la ltima iteracin,
( ) ( ) m m
b b =
+1
, e incremente el valor de en un factor de
2.
7. Se repiten los pasos de 3 a 6 hasta que las siguientes condiciones se satisfacen:
a. no cambia apreciablemente.
b. b es muy pequeo

Una vez obtenido el modelo se realiz la estimacin de los parmetros del modelo cintico,
se aplic el mtodo de regresin no lineal (Marquardt, 1963), conllevando esto a la
73

construccin del modelo computacional, el cual consiste en la programacin de las
ecuaciones diferenciales, que permiten la solucin de estos sistemas de ecuaciones. Se
utiliz el software Matlab R2008b, para la solucin numrica simultanea del conjunto de
las tres ecuaciones diferenciales que representan el modelo, el criterio utilizado para la
optimizacin de los parmetros cinticos, fue la minimizacin de la suma de los cuadrados
de los residuales (Constantinides y Mostoufi, 1999).
Las cinticas del modelo con los parmetros estimados y la programacin de las
ecuaciones diferenciales, fueron luego simuladas por medio de la integracin de las
ecuaciones diferenciales, mediante un algoritmo corrector/predictor con el mtodo de
Runge-Kutta de 4/5 orden, en el software Matlab R2008b con la herramienta ODE45,
para verificar que las tendencias de las curvas si modelan el proceso experimental
(Mathews y Kurtis, 2000), el horizonte simulado fue el tiempo de fermentacin en horas
obtenido en cada cultivo.
Los datos experimentales utilizados en la modelacin, ajuste paramtrico de los datos y la
simulacin, son los resultados experimentales en el procedimiento de determinacin de la
cintica de fermentacin y con los cuales se corrieron las rutinas programadas en Matlab.
4.7.3 Anlisis estadstico

Con el fin de validar el ajuste del modelo, la suma residual de los cuadrados de los
componentes del modelo en forma individual, se llev a cabo por medio del anlisis de
varianza, donde se examinaron un conjunto de datos no lineales y se asumi la
disponibilidad de mltiples valores de las variables dependientes
j i
y en cada punto de la
variable independiente
i
x , en este caso el tiempo.
En la regresin de mnimos cuadrados, la suposicin que se hace es que el modelo se ajusta
correctamente, y que las observaciones se desvan desde el modelo de forma aleatoria. La
aleatoriedad (o la falta de ajuste) se puede detectar visualmente, graficando los residuales
( ) y y
*
contra la variable independiente x y tambin contra la variable dependiente y .
Cuando se presenta gran dispersin en los datos experimentales, se debe utilizar
herramientas estadsticas para el clculo de intervalos de 95% de confianza en las
74

estimaciones obtenidas. El mtodo requiere de modelos matemticos capaces de reproducir
las dinmicas no lineales de las variables experimentales. Los parmetros de los modelos
son ajustados mediante la funcin nlinfit del toolbox estadstico de MATLAB 2008b. Esta
funcin se basa en el mtodo iterativo de regresin no lineal de mnimos cuadrados, el cual
minimiza la suma de los errores cuadrticos entre los datos experimentales y las
predicciones, en sistemas no lineales (Bates and Watts, 1988; Seber and Wild, 2003). Para
la determinacin de intervalos de 95% de confianza, se utilizaron las funciones nlparci
(produce intervalos de confianza en la estimacin de los parmetros del modelo) y nlpredci
(produce intervalos de confianza en las predicciones) del mismo toolbox estadstico. Estas
funciones, se basan para sus clculos en la aplicacin de la prueba estadstica t Student
(Dixon y Massey, 1996; Rice, 1995). Ingresando al programa los datos experimentales y el
modelo no lineal, estas funciones nlparci y nlpredci que arrojan los intervalos de confianza
para la media de los parmetros modelados.

Validacin del modelo en lote realizado en biorreactor
Despus de que se realiza el anlisis estadstico se valida el modelo con los parmetros
obtenidos en lote en biorreactor con el mejor medio qumicamente definido utilizando datos
experimentales, para lo cual se realizaron cinco (5) cultivos a iguales condiciones de
temperatura, pH, velocidad de agitacin y aireacin, donde se obtienen siete (7) datos
experimentales para cada cintica (X, S y P) en cada cultivo realizado, es decir se utilizan el
60% de los datos experimentales para realizar la identificacin de los parmetros y con el
40% de los datos experimentales restantes se valida el modelo.
4.7.4 Simulacin de la cintica en una fermentacin en continuo

El cultivo en continuo se llevo a cabo bajo la estrategia de quimiostato, los parmetros de
operacin caractersticos en reactores en continuo son D(la velocidad de dilucin) y (el
tiempo medio de residencia) y se relacionan de la siguiente forma:

F
V
D
= =
1
(Ec. 41)
75

Como estrategia de operacin, se puede trabajar el biorreactor como un quimiostato, es
decir, que el volumen sea constante, esto es posible ajustando los flujos de entrada y salida,
para que la tasa de dilucin sea un parmetro constante.

Cintica de formacin de la biomasa
En la operacin de un cultivo en continuo no hay acumulacin de materia cuando se
alcanza el estado estacionario, es decir no hay variacin de materia con respecto al tiempo,
por lo tanto en la ecuacin 17, el trmino 0 =
dt
dM
, que si se aplica a un balance de
biomasa, implica que 0 =
dt
dX
, el caudal msico de clulas que entran al reactor es
i i
X F M .
= , pero generalmente la corriente de alimentacin de un cultivo continuo es

estril, entonces el trmino del caudal msico de entrada es 0
=
i
M ; el caudal msico de
biomasa que sale del reactor es X F X F M
f f
. .
= = , la formacin de biomasa se representa

con el trmino de la velocidad de generacin es XV R
G
= , el trmino de consumo es
XV k R
d C
= , donde se asume que la velocidad de muerte celular es muy pequea y menor
que , por lo tanto 0 =
d
k y se trabaja a un volumen efectivo constante.
XV k XV FX FX
d f i
+ = 0 (Ec. 42)

Que al ser despejada y como se asume que la velocidad de crecimiento especfica es
representada por la ecuacin de Monod, entonces:
S K
S
D FXV XV
s
+
= = =
max
(Ec. 43)

La ecuacin del balance de materia en estado estacionario para la Biomasa es:
D
DK
S
s
=
max
(Ec. 44)

76

Consumo de la fuente de sustrato
En estado estacionario, no hay variacin de materia con respecto al tiempo, entonces
0 =
dt
dS
, el caudal msico de entrada
i i
S F M .
= y el caudal msico de salida

S F S F M
f f
. .
= = , el sustrato se consume no se genera, por lo tanto 0 =

G
R , pero si es
consumido por el microorganismo principalmente como fuente de energa para crecer, al
sustituirse en la ecuacin 17 del balance de masa total, queda as:

V r FS FS
s f i
+ = 0 (Ec. 44)

Despreciando el trmino de mantenimiento el cual considera el aporte de energa para
mantener vivo al microorganismo y adems aporta los materiales necesarios para la
formacin de productos extracelulares, en este caso, es despreciable debido a las pequeas
cantidades de metablito producido.
( ) ( ) S S Y X X
Y
S S D
i s x
s x
i
= = . 0

(Ec. 45)

Produccin de cido clavulnico
En estado estacionario, no hay variacin de materia con respecto al tiempo, entonces
0 =
dt
dP
, el caudal msico de entrada es 0, ya que al inicio de la fermentacin no hay
producto 0
= =
i i
FP M y el caudal msico de salida P F P F M
f f
. .
= = , ya que el producto
se genera XV r R
p G
= y no se consume, entonces 0 =
C
R ; el volumen de trabajo es
constante, al sustituirse en la ecuacin del balance de masa total, queda as:
D
r
P r DP
p
p
= + = 0 (Ec. 46)

La velocidad neta de produccin de cido clavulnico est representada por un trmino de
produccin especfica relacionada al crecimiento del microorganismo, el cual sigue una
cintica tpica de metabolito secundario y un trmino de produccin relacionado a la
biomasa y su viabilidad en el medio acuoso (Duarte Torres, 1995).
77

D
X
Y
P
p x
|
|
\
|
+ =
(Ec. 47)

Concentracin de oxgeno disuelto

La concentracin de oxgeno disuelto en estado estacionario, donde el
trmino 0 = =
dt
dC
dt
dM
OD
, por la tanto la ecuacin del balance de materia en estado
estacionario para el oxgeno disuelto se representa as:
X
a K
Q
C C
L
O
OD
2
*
= (Ec. 48)

Las cinticas se simularon en el software Matlab R2008b, para obtener las tendencias de las
curvas del proceso (Mathews y Kurtis, 2000). Se cambiaron el valor del flujo de sustrato, la
velocidad de dilucin y el oxgeno disuelto, para ver la influencia de estos parmetros sobre
la produccin de cido clavulnico en estado estacionario.

4.7.5 Anlisis de sensibilidad de los parmetros

El objetivo del anlisis de la sensibilidad consiste en valorar la influencia de cada
parmetro en alguna variable de salida o respuesta del mismo modelo. Un mtodo numrico
para realizar un anlisis de sensibilidad, consiste en evaluar la respuesta elegida para un
determinado rango de valores de un parmetro. Si los parmetros del modelo son denotados
con la letra k , se puede calcular el valor de la perturbacin, que es causado por un intervalo
de variacin de 10% con respecto al valor ptimo del mismo parmetro, es decir un
intervalo de 0.9
i
k a 1.1
i
k . Este mtodo incluye todos los aspectos sensibles del modelo
computacional (ecuaciones y soluciones numricas) y pueden evaluarse siempre, sin que
importe la complejidad de las ecuaciones matemticas. La ventaja de esta tcnica de
anlisis de sensibilidad, es que los resultados ofrecen una indicacin cualitativa de la
78

desviacin del sistema respecto a la variacin de dicho parmetro (Arahal y colaboradores,
2006).
Con el fin verificar que tan robusto es el modelo, se perturbaron los parmetros nominales
del modelo en + o 10%, con el fin de medir su influencia de los parmetros estimados en
las variables simuladas, se tomo como caso de estudio el modelo del cultivo en lote y la
simulacin del cultivo en continuo (Tang y Zhong, 2004). La siguiente ecuacin
corresponde al ndice de sensibilidad empleado:
( )
n
X X
X X
S
n
t
i i
n
t
i i
P
t t
t t
i
|
|
\
|
=
=
+
=
+
1
* /
1
* /
max
(Ec. 49)
El termino
i
P
S representa el valor promedio de la sensibilidad de una variable i ( P S X , , ) al
cambio o perturbacin de un parmetro del modelo,
+/
t
Xi es la variable de inters
perturbada positivamente o negativamente,
*
t
Xi es la variable nominal, n es el nmero
respuestas de la variable i y el trmino
( )
n
t
t t
Xi Xi
1
* /
max
=
+
, representa el valor de la
mxima perturbacin de la variable analizada. De esta manera el numerador del trmino
i
P
S , es un vector de n valores de sensibilidad de la variable i, que quedan acotados entre 0
y 1; el valor de
i
P
S debe ser muy cercano a 0, lo que significa que no hay diferencia
significativa entre los valores de salida de la varible de inters con perturbacin de un
parmetro del modelo y los valores de la variable nominal sin perturbacin de algn
parmetro del modelo (Gelmi, 1999). Este tipo de anlisis de sensibilidad es de
metodologa univariante, es decir la sensibilidad a cambios en el valor de un elemento del
modelo cuando el resto de ellos permanece constante o inalterado. Para cuantificar la
sensibilidad a los parmetros de un modelo, se pueden calcular tres tipos diferentes de la
sensibilidad de una variable con respecto al parmetro perturbado, dentro de las cuales se
encuentran los tres tipos de sensibilidad.
a) Sensibilidad absoluta: La cual se cuantifica con la ecuacin 50, la cual se evala para
cada variable del modelo (X, S y P).
( ) ( )
n
t
i i i i P
t t t t i
X X X X S
1
* * / *
=
+
+ =
(Ec. 50)
79

b) Sensibilidad relativa: Este tipo de sensibilidad se cuantifica por medio de la ecuacin 51,
la cual se evala para cada variable del modelo
( ) ( )
( )
n
t
i i
n
t
i i i i
P
t t
t t t t
i
X X
X X X X
S
1
* /
1
* * / *
=
+
=
+
+
=
(Ec. 51)
c) Sensibilidad relativa ajustada: Es la misma sensibilidad calculada con la ecuacin 51
multiplicada por un factor el cual se cuantifica como el valor del parmetro sobre el valor
de la variable nominal.
Para calcular un valor nico de la sensibilidad del sistema de ecuaciones, en el intervalo de
tiempos muestreados, se pueden adoptar varios enfoques, donde el utilizado en este trabajo,
es la media aritmtica de los valores de los coeficientes de sensibilidad en el tiempo de
simulacin, el cual se determina cuantitativamente tomando la ecuacin 51 por el nmero
de datos de la variable (Llavador, 2005). En el anlisis de sensibilidad no solo se
consideran los valores de los parmetros, sino de las propias relaciones funcionales del
modelo (sistema de ecuaciones) (Aracil, 1995).
79

b) Sensibilidad relativa: Este tipo de sensibilidad se cuantifica por medio de la ecuacin 51,
la cual se evala para cada variable del modelo
( ) ( )
( )
n
t
i i
n
t
i i i i
P
t t
t t t t
i
X X
X X X X
S
1
* /
1
* * / *
=
+
=
+
+
=
(Ec. 51)
c) Sensibilidad relativa ajustada: Es la misma sensibilidad calculada con la ecuacin 51
multiplicada por un factor el cual se cuantifica como el valor del parmetro sobre el valor
de la variable nominal.
Para calcular un valor nico de la sensibilidad del sistema de ecuaciones, en el intervalo de
tiempos muestreados, se pueden adoptar varios enfoques, donde el utilizado en este trabajo,
es la media aritmtica de los valores de los coeficientes de sensibilidad en el tiempo de
simulacin, el cual se determina cuantitativamente tomando la ecuacin 51 por el nmero
de datos de la variable (Llavador, 2005). En el anlisis de sensibilidad no solo se
consideran los valores de los parmetros, sino de las propias relaciones funcionales del
modelo (sistema de ecuaciones) (Aracil, 1995).
80

5. RESULTADOS Y DISCUSIN

5.1 Cultivo en lote
5.1.1 Cultivo en matraz

Las cinticas obtenidas en matraz con los tres medios utilizados en el cultivo de Sc en
suspensin a una temperatura de 28C, un pH de 6.8 y una velocidad de agitacin de 220
rpm, se presentan en las figuras 17, 18 y 19, donde se utilizaron dos medios qumicamente
definidos, el medio Gly-NH
4
y el medio Gly-Asn, junto con un medio complejo Gly-
HS para la produccin de cido clavulnico. El crecimiento de la biomasa en los tres
medio de cultivo fue acelerado desde el inicio de la fermentacin, no present en estos
cultivos etapa de adaptacin, lo que conduce a un proceso de fermentacin de menor
duracin, que puede ser inducido por la concentracin del inculo.

Figura 17. Cultivo en matraz con el Medio Gly-NH
4
, cintica en lote de Streptomyces clavuligerus.

81

Figura 18. Cultivo en matraz con el Medio Gly-Asn, cintica en lote de Streptomyces clavuligerus.

Figura 19. Cultivo en matraz con el Medio Gly-HS, cintica en lote de Streptomyces clavuligerus.
82

Con los tres medios utilizados en cultivos de Streptomyces clavuligerus en lote realizados
en matraz, se obtuvieron los parmetros presentados en la tabla 3.

Tabla 3. Valores de parmetros experimentales del cultivo de Streptomyces clavuligerus en matraz con los
tres medios utilizados.

El consumo de sustrato, la formacin de producto y biomasa en la fermentacin con los
medios Gly-Asn y Gly-HS, son ms significativos que en la fermentacin con el medio
de Gly-NH
4
, donde el sustrato al final de la fermentacin sin consumir es alrededor del
27.49%. La formacin y el rendimiento del producto a partir del sustrato en el medio Gly-
HS es 29.22% ms alto que el medio Gly-Asn, ya que la fuente de nitrgeno utilizada en
el medio Gly-HS es la harina de soya, la cual aporta nutrientes de aminocidos libres que
participan en las reacciones del metabolismo primario de la bacteria Streptomyces
clavuligerus como en el ciclo de la urea (Kuo-Cheng y colaboradores, 2003), nutrientes
que son utilizados como precursores para la biosntesis de AC y como precursores que
favorecen la disponibilidad de metabolitos en el ciclo del cido tricarboxilico (TCA) hacia
la formacin de aminocidos (Kirk y colaboradores, 2000; Snchez, 2012).
En la Tabla 3 los resultados obtenidos para el crecimiento de la biomasa en los dos
cultivos con los medios Gly-Asn y Gly-HS son bastante cercanos, 7.490.49 y
6.110.082 respectivamente. Otros autores han presentado valores mucho ms bajos en el
crecimiento de biomasa de hasta 2.6 g/L empleando la misma concentracin de sustrato y
Parmetros Medios
Gly-NH
4
Gly-Asn Gly-HS
X
max
(g/L) 3.840.16 7.490.49 6.110.082
P(mg/L) 31.351.021 111.130.49 380.300.30
Y
x/s
(g X/g S) 0.27 0.29 0.12
Y
x/p
(g X/g P) 1.19 4.59 14.65
r
s
(g S/h) 0.16 0.24 0.21
r
p
(g P/h) 0.43 1.10 3.06
(h
-1
) 0.087 0.054 0.044
Tiempo de duplicacin (h) 7.97 12.85 15.80
Productividad (mg/L.h) 0.41 1.46 5.00
Tiempo fermentacin (h) 76
83

condiciones de operacin muy similares, cuando el medio es qumicamente definido
(Malmberg y colaboradores, 1993).
En medio complejo otros autores han reportado valores mayores en el crecimiento de la
biomasa de hasta 9 o 14 g/L a condiciones de operacin similares (Baptista_Neto y
colaboradores, 2000; Neto y colaboradores, 2005; Costa y Badino 2012). En cuanto a la
cantidad de producto formado se obtuvo en medio complejo 269.17 mg/L mas de AC que
lo que se obtuvo en medio qumicamente definido y que se ve reflejado en el valor de
s p
Y
obtenido en el medio complejo. Se obtuvo tambin un valor de produccin de cido
clavulnico alto con respecto a valores de produccin reportados en la literatura, como son
194 mg/L (Netoy colaboradores, 2005) y 450 mg/L (Baptista_Neto y colaboradores, 2000).
Sin embargo el inters de este estudio es analizar la produccin de AC en un medio
qumicamente definido, en el cual el valor de
s p
Y fue de 4.60 g de AC/g de glicerol, un
valor muy alto comparado a valores de
s p
Y de 2.92 g de AC/g de glicerol en un medio
qumicamente definido, limitado en la concentracin de la fuente de fsforo (Kirk y
colaboradores, 2000) y al valor obtenido por Bushell y colaboradores (2006) el cual fue de
s p
Y igual a 0.71 g de cido clavulnico/g de glicerol en un medio qumicamente definido.
Adicionalmente la mejor productividad de AC obtenida en medio qumicamente definido
fue de 1.462 mg de cido clavulnico/L.h; hay valores reportados en la literatura como
0.336 mg/L.h (Ives y Bushell, 1997) y 0.5 mg de AC/L.h (Bushell y colaboradores, 2006),
sin embargo, Kirk y colaboradores (2000), obtuvieron en medio qumicamente definido una
productividad de 4.82 mg de AC/L.h, empleando el mismo medio.

5.1.2 Cultivo en biorreactor
5.1.2.1 Determinacin de K
L
a y Q
O2

Al realizar el procedimiento para obtener los datos de la demanda de oxgeno, se verific si
se requera hacer correccin de las medidas de oxgeno disuelto (OD) por el tiempo de
84

respuesta (
r
) del electrodo. La figura 20 muestra los datos obtenidos del procedimiento
experimental, para el clculo de
r
.

Figura 20. Calculo de tiempo de respuesta del electrodo de oxgeno.

El tiempo de respuesta del electrodo para alcanzar un 63% del valor final medido de OD
cuando se cambia la concentracin de este sustrato, es de 7 segundos, por lo tanto,
s
r
42 7 6 6 = = , que es un valor nominal menor del tiempo real del ensayo lo que
implica que no hay que hacer correccin por el tiempo de respuesta del electrodo, ms sin
embargo en la figura 21 se muestra la determinacin de
2
O
Q tomando en cuenta la
correccin por el tiempo de respuesta del electrodo.
De acuerdo con los datos obtenidos de la demanda de OD en el cultivo en lote realizado en
el biorreactor, se obtuvo el valor de la velocidad especfica de consumo de oxgeno (
2
O
Q )
por medio de la tcnica dinmica, la cual se realiz en la fase final de la etapa de
crecimiento exponencial del microorganismo. En la figura 21 se presenta la grafica de los
datos experimentales para la determinacin de
2
O
Q , tomando en cuenta la correccin por el
tiempo de respuesta del electrodo.
r

85

Figura 21.Calculo de Q
O2
por la tcnica dinmica, datos de la etapa de desgasificacin.

De acuerdo a los resultados que se presentan en la figura 21 y aplicando la ecuacin 32 se
tiene que
2 2
.
3163 . 1
.
12 . 42
.
0117 . 0
2 2 2
O O
r
h L
O mmol
h L
O mg
s L
O mg
X Q = = = = y como la
concentracin de la biomasa en la fase exponencial es
L
X g
X 7 = , entonces
h X g
O mg
Q
O
.
0171 . 6
2
2
= . Con el valor de
2
O
r obtenido experimentalmente y con los valores de
la concentracin de oxgeno consumido por el microorganismo, se obtuvo la figura 22, que
nos permite calcular el coeficiente de transferencia de oxgeno, a K
L
.
86

Figura 22.Clculo del a K
L
por la tcnica dinmica empleando los datos de la etapa de gasificacin.

La pendiente de la ecuacin en la grafica 22 es 599 . 25
1
=
a K
L
, despejando se obtiene el
valor de
1 1
630 . 140 0391 . 0

= = h s a K
L
. El valor de
1
0391 . 0

= s a K
L
es similar al valor
reportado en la literatura para un cultivo de Streptomyces clavuligerus por Cerri y Badino
(2012). Como la concentracin de oxgeno disuelto en equilibrio con la fase lquida a las
condiciones de Medelln es
L
O mg
C
O
2 *
07 . 8
2
= , valor con el cual se obtiene la velocidad de
transferencia de oxgeno, ( )
h L
O mg
L
O mg
h
OTR
.
884 . 1134 0 07 . 8
63 . 140
2 2
= = , as como la
velocidad de consumo de oxgeno
h L
O mg
X Q OUR
O
.
12 . 42 .
2
2
= = y
h L
O mg
dt
dC
O
.
764 . 1092
2 2
= ,
se deduce entonces que en el biorreactor siempre hubo disponibilidad de OD para el
microorganismo y que nunca estuvo realmente con limitacin de concentracin de oxgeno
como sustrato limitante. Los valores de los coeficientes de
2
O
Q y a K
L
son constantes
87

utilizadas en la cintica experimental del consumo de oxgeno disuelto por parte del
microorganismo.
5.1.2.2 Cinticas obtenidas en el biorreactor

Con la informacin obtenida de la cintica experimental de los cultivos de Streptomyces
clavuligerus en matraz, se realizaron fermentaciones en lote en biorreactor. En la figura 23
se presentan las cinticas del cultivo en lote realizadas en biorreactor con el medio de
produccin Gly-Asn.

Figura 23. Cintica en biorreactor operando en lote con medio Gly-Asn. X: Biomasa; Gly: Glicerol; AC:
cido clavulnico; FP: Fuente de fsforo; Asn: Fuente de nitrgeno y OD: oxgeno disuelto.

El valor del sustrato no consumido al final del cultivo es de 16.44%, lo que podra
significar que el consumo del glicerol como fuente de carbono, es mejor en las
fermentaciones realizadas en el biorreactor. El crecimiento de la biomasa fue acelerada
desde el inicio del proceso, lo que reitera que la concentracin del inoculo es importante,
para que la cintica de formacin de biomasa se d en menor tiempo, el inculo debe tener
una concentracin mayor o igual a 0,5 g/L. La fuente de fsforo no se consume totalmente
y se obtiene el producto de inters, lo que indica que no son necesarias las condiciones de
88

agotamiento de esta fuente para producir el AC, pero si se consume durante la produccin
del metabolito y su consumo decrece notablemente a partir del valor de mayor
concentracin de AC detectado en el medio de cultivo; se observa que la fuente de
nitrgeno empieza a disminuir su concentracin en el medio, cuando se detecta la mayor
produccin de AC, est fuente est totalmente agotada. El OD es consumido por el
microorganismo lentamente durante el crecimiento, cuando la curva de la cintica de
crecimiento llega a la fase estacionaria, el consumo de oxgeno disuelto es constante en el
medio de cultivo. En las primeras horas de cultivo, el AC no se produce y a partir de un
tiempo determinado, cuando el microorganismo se encuentra en la mitad de la fase
exponencial, se inicia la produccin de AC, siendo exponencial su produccin en la fase de
idiofase.
En la Tabla 4, se muestran los valores obtenidos para los parmetros ms importantes en las
fermentaciones en lote, realizadas en biorreactor. Se puede ver que a mayor formacin de
biomasa, la produccin de cido clavulnico es mucho menor, por lo tanto tambin lo son
el rendimiento de formacin de producto a partir de sustrato y la productividad.

Tabla 4. Valores de parmetros experimentales del cultivo en lote con el medio Gly-Asn en biorreactor.

El valor de
s p
Y fue de 5.16 g de AC/g de glicerol, este valor obtenido supera el valor
encontrado por Kirk y colaboradores (2000), que indica que la produccin de cido
clavulnico se vio desfavorecida por la velocidad de consumo de la fuente de sustrato.
Parmetros Medio Gly-Asn
X
max
(g X/L) 7.670.01
P(mg P/L) 54.972.75
Y
x/s
(g X/g S) 0.39
Y
p/s
(mg P/g S) 5.16
r
s
(g S/h) 0.15
r
p
(mg P/h) 0.76
(h
-1
) 0.041
Tiempo de duplicacin (h) 16.77
Productividad (mg P/L.h) 0.72
89

Adicionalmente, la productividad obtenida en medio qumicamente definido fue de 0.76 mg
de cido clavulnico/L.h, un valor de productividad muy alto respecto a los valores
reportados en la literatura son 0.34 mg de cido clavulnico/L.h (Ives y Bushell, 1997), 0.5
mg de cido clavulnico/L.h (Bushelly colaboradores, 2006) y 4.82 mg de cido
clavulnico/L.h (Kirk y colaboradores, 2000). Resultados que son utilizados para modelar
la cintica de produccin de cido clavulnico en una fermentacin en lote en biorreactor,
utilizando como medio de produccin, el medio Gly-Asn.
Se realiz otra fermentacin en el biorreactor a las mismas condiciones de trabajo, con el
fin de validar el modelo, en la figura 24 se presentan las cinticas del cultivo en lote en
biorreactor con el medio de produccin Gly-Asn obtenidas nuevamente, donde el sustrato
al final del proceso sin consumir es de 37.87%, que es un resultado an mayor al obtenido
en las fermentaciones llevadas a cabo en matraz, valor que es muy variable, por lo tanto es
posible establecer que bajo las condiciones dadas hay exceso de glicerol. El crecimiento de
la biomasa fue acelerada desde el inicio de la fermentacin disminuyendo la fase de
adaptacin, la cintica obtenida es muy similar a la primera fermentacin en biorreactor. La
fuente de fsforo no se consume totalmente y se obtiene AC, lo que muestra un
comportamiento atpico encontrado por otros autores, quienes han visto que la mxima
produccin de AC se da cuando la fuente de carbono se agota en el medio, en nuestro caso
hubo agotamiento de la fuente de nitrgeno, pero no de fsforo, por lo tanto parece ser que
no son necesarias las condiciones de agotamiento de esta fuente para producir el AC, pero
el consumo de este sustrato es diferente a las otras fermentaciones, ya que se puede decir
que no hubo consumo de fsforo al igual que en los cultivos anteriores, se observa que la
fuente de nitrgeno empieza a disminuir su concentracin en el medio cuando se detecta la
produccin de AC. El OD es consumido por el microorganismo lentamente durante el
crecimiento de manera constante en el transcurso del cultivo y el AC se detect en el
medio, cuando el crecimiento exponencial ya se ha iniciado.

90

Figura 24. Validacin de la cintica en biorreactor operando en lote con medio Gly-Asn. X: Biomasa; Gly:
Glicerol; AC: cido clavulnico; FP: Fuente de fsforo; L-Asn: Fuente de nitrgeno y OD: oxgeno disuelto.

En la Tabla 5 se muestran los valores obtenidos para los parmetros ms importantes en el
cultivo en lote, realizada en biorreactor. Se observa que se formo mayor cantidad de
biomasa y la produccin de cido clavulnico es similar, por lo tanto tambin aumentan el
rendimiento de formacin de producto a partir de sustrato y la productividad. El valor
obtenido de crecimiento de biomasa es muy bueno, similar al obtenido en la tabla 4.
El valor de
s p
Y obtenido supera el valor encontrado por Kirk y colaboradores (2000), que
indica que la produccin de cido clavulnico se vio muy influida por la velocidad de
consumo de la fuente de sustrato, mas sin embargo esto no es definitivo, ya que en los
cultivos anteriores, ver figura 18 se obtuvo mayor consumo de sustrato y menos produccin
de AC.

91

Tabla 5. Valores de algunos parmetros de la fermentacin en lote en biorreactor.

Adicionalmente la productividad obtenida fue de 0.97 mg de AC/L.h, un valor de
productividad alta respecto a los valores reportados en la literatura como 0.34 mg de cido
clavulnico/L.h (Ives y Bushell, 1997) y 0.5 mg de cido clavulnico/L.h (Bushell y
colaboradores, 2006), pero que al compararlo con el resultado de Kirk y colaboradores
(2000) sera un valor normal para la produccin de AC.
Estos resultados se obtuvieron en un desarrollo experimental con iguales condiciones a los
presentados en la figura 18 y en la tabla 3. Una caracterstica que se ha observado en los
cultivos de la bacteria Streptomyces clavuligerus, es que no es un microorganismo de fcil
manipulacin, es sensible a cambios de condiciones ambientales, de conservacin,
mantenimiento, transporte y estas condiciones se ven reflejadas en los resultados
experimentales. La produccin de AC en este cultivo fue similar a la obtenida en la
fermentacin anterior y as mismo con otras corridas experimentales. Estos resultados
fueron obtenidos por duplicado y son utilizados para validar el modelo de la cintica de
produccin de cido clavulnico en un cultivo en lote en biorreactor, utilizando como
medio de produccin el medio Gly-Asn, al cual se le estimaron los parmetros
experimentales de las ecuaciones cinticas.

X
max
(g X/L) 8.830.01
P(mg P/L) 50.29 1.35
Y
x/s
(g X/g S) 1.49
Y
p/s
(mg P/g S) 9.37
r
s
(g S/h) 0.10
r
p
(mg P/h) 0.95
(h
-1
) 0.045
Tiempo de duplicacin (h) 15.56
Productividad (mg P/L.h) 0.97
92

5.1.2.3 Obtencin de rendimientos tericos

El coeficiente de rendimiento
s x
Y obtenido en el cultivo en lote, realizado en el biorreactor,
ver tabla 5, se utiliza para determinar los coeficientes estequiomtricos de la reaccin
biolgica, en el medio qumicamente definido Gly-Asn, dando como resultado los
siguientes valores:
d
S mol
X mol
S g
X g
Y
s x
= = = 343 . 1 391 . 0 (Ec. 50)

O H CO P O N CH
PO H O N H C O O H C
2 2 020 , 0 51 , 0 225 , 0 77 , 1
4 2 3 2 8 4 2 3 8 3
443 . 3 261 . 2 343 . 1
027 . 0 151 . 0 545 . 2
+ +
+ + +

(Ec. 51)

Con la ecuacin 51 se pueden determinar tericamente otros parmetros como son el
cociente de respiracin (RQ), el rendimiento de biomasa a partir de consumo de oxgeno
( )
2
O x
Y , el rendimiento de produccin de CO2 a partir de sustrato ( )
s CO
Y
2
, los cuales se
calculan con las ecuaciones 12, 13 y 14, dando como resultados tericos los siguientes
valores:
2
2
89 . 0
O mol
CO mol
RQ =

2
53 . 0
2
O mol
X mol
Y
O x
=

S mol
CO mol
Y
s CO
2
26 . 2
2
=

Dos de los valores anteriores ya han sido calculados y reportados por Baptista-Neto y
colaboradores (2000) para la fermentacin de Streptomyces Sp y la formacin de cido
clavulnico en medio complejo, quienes obtuvieron valores muy similares para el RQy
s x
Y , pero muy diferente para el rendimiento
2
O x
Y , valor que es mucho mayor en medio
complejo que en medio qumicamente definido; al comparar valores mximos alcanzados
de concentracin de biomasa en los medios complejos reportados por Baptista-Neto y
colaboradores (2000) y el medio complejo trabajado en el cultivo en matraz, con los valores
de concentracin de biomasa alcanzados en los medios qumicamente definidos, deja ver
93

que los valores son muy similares que puede significar que hay menor velocidad de
consumo de oxgeno disuelto en medio complejo que en los medios qumicamente
definidos y esto puede deberse a las propiedades del medio, ya que le medio complejo es
ms turbio, denso y presenta mayor resistencia para la transferencia de oxgeno que los
medios qumicamente definidos.
5.3 Cultivo en continuo

El cultivo en continuo realizado con el medio Gly-Asn, se desarroll a velocidad de
dilucin de 0.02 y 0.03 h
-1
, en la tabla 6 se presentan los valores de concentracin de
sustrato, concentracin de biomasa y produccin de cido clavulnico obtenidas en el
estado estable. A partir del tercer tiempo de residencia se obtuvieron concentraciones de los
sustratos constantes en el medio de cultivo, datos que son reportados como resultado del
cultivo en continuo.

Tabla 6. Valores de variables del cultivo en continuo en el biorreactor

D
Concentracin
X Gly FP FN AC OD
(h
-1
) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (mg/L) (%)
0.03 5.75 0.375 9.84 0.02 3.67 0.2 0.003 1x10
-5
6.31 0.15 20.9
0.02 8.88 0.75 5.81 0.34 3.11 0.014 0.009 1x10
-3
9.73 0.33 18.3
D: Velocidad de dilucin, X: Biomasa, Gly: Glicerol, FP: fuente de fsforo, FN: Fuente de nitrgeno
AC: cido clavulnico y OD: oxgeno disuelto

Los valores de produccin de AC obtenidos en los cultivos en continuo, son demasiado
bajos con respecto a valores reportados en la literatura, donde se ha llegado a obtener hasta
96.36 mg de cido clavulnico/L en medio qumicamente definido (Kirk y colaboradores,
2000), puede deberse a muchos factores externos al cultivo del microorganismo que no se
han estudiado en este trabajo, como son las condiciones ambientales o como se ve afectado
el microorganismo por la hidrodinmica del proceso en un cultivo en continuo, ya que se
logro obtener 18.38 mg de AC/L a D de 0.02 h
-1
y 24.7 mg de AC/L a D de 0.03 h
-1
, antes
de alcanzar el estado estable, lo que muestra un comportamiento de degradacin del AC.
Un resultado interesante en la tabla 6, son los valores de la concentracin de OD (%), lo
que muestra que el mnimo valor de OD que debe haber en el medio debe ser mayor o igual
94

al 18%. En la tabla 7 se presentan las velocidad de formacin de biomasa, consumo de
sustratos y produccin de AC obtenidos en el cultivo en continuo.

Tabla 7. Valores de las velocidad de formacin, consumo y produccin obtenidos en el cultivo en continuo
en el biorreactor.

D
Velocidades de consumo y generacin
r
x
r
s
r
p
Q
O2
r
o2

(h
-1
) (g X/L.h) (g S/g X.h) (mg P/g X.h) (mg O
2
/g X.
h)
(mg O
2
/L.h)
0.03 0.17 0.051 0.033 0.0422 0.2427
0.02 0.18 0.013 0.022 0.0160 0.1421
D: Velocidad de dilucin, r
x
: Velocidad de formacin de biomasa, r
s
: Velocidad especfica de consumo de
sustrato, r
p
: Velocidad especfica de produccin de AC, Q
O2
: Velocidad especfica de consumo de oxgeno y
r
O2
: Velocidad de consumo de oxgeno en el medio.

En el efluente del biorreactor se obtuvieron valores cercanos a 8.49 g/L de glicerol, 4.2 g/L
de fuente de fsforo, 0.03 g/L de fuente de nitrgeno y 20 % de oxgeno disuelto como
valores de cada sustrato respectivamente no consumidos. De los resultados presentados en
la tabla 7 se nota que la produccin de AC es mayor a menor tasa de dilucin, donde a una
tasa de dilucin de 0.02 h
-1
se obtuvo un rendimiento de produccin de AC a partir de la
formacin de biomasa ( )
x p
Y de 1.096 mg AC/g de biomasa y para una tasa de dilucin de
0.03h
-1
se obtuvo un rendimiento de produccin de AC a partir de la formacin de biomasa
( )
x p
Y de 1.97 mg de AC/g de biomasa. Bushell y colaboradores (2006) han trabajado a
tasas de dilucin de 0.1 a 0.03 h
-1
obteniendo rendimientos ( )
x p
Y de 0.04 a 0.58 mg de
cido clavulnico/g de biomasa en medio qumicamente definido. Kirk y colaboradores
(2000) obtuvieron a una tasa de dilucin de 0.05 h
-1
un rendimiento ( )
x p
Y de 73 mg de
cido clavulnico/g de biomasa en medio qumicamente definido, con estudios de
limitacin de la fuente de fsforo en el medio de cultivo. La velocidad de consumo de
oxgeno fue 59.2% ms bajo que los obtenidos por Bushell y colaboradores (2006) a igual
velocidad de dilucin, aunque el rendimiento de
x p
Y y la concentracin de cido clavulnico
obtenidas en este trabajo son mayores.
95

En los resultados se puede ver que la velocidad de consumo de glicerol es mucho ms alta a
menor tasa de dilucin lo que corrobora que a menor tasa de dilucin las velocidades
especficas de consumo de sustrato mejoran, lo que puede influir en una mejor velocidad de
produccin especfica de AC. Sin embargo se puede apreciar tambin que se han obtenido
mejores rendimientos de produccin de AC en estudios donde se evalan el efecto de la
limitacin de los nutrientes en el medio de cultivo. Por lo tanto se puede establecer que an
se pueden estudiar e investigar ms a fondo el medio de cultivo, la limitacin de nutrientes,
el efecto de la composicin de las sales que complementan el medio de cultivo y las
condiciones de operacin que permitan obtener mejores rendimientos de produccin.

5.4 Modelado y simulacin

El modelo est constituido por 4 ecuaciones diferenciales capaces de reproducir el
crecimiento del microorganismo, el consumo de sustrato, la produccin del metabolito de
inters y la concentracin de oxgeno disuelto en el medio, donde el fenmeno limitante es
el consumo de glicerol.

5.4.1 Modelado de la cintica de fermentacin en lote

El inters de este trabajo fue analizar y estudiar un medio qumicamente definido, ya que
hace parte de un trabajo de investigacin para mejorar la produccin de cido clavulnico
con anlisis de flujo metablico (AFM). Para lo cual se modelaron el sistema de ecuaciones
diferenciales para la biomasa, el glicerol y el AC simultneamente, se estimaron los
parmetros que ajustan el modelo al perfil o tendencia experimental de los datos. En la
estimacin de parmetros con el modelo en la cintica en lote en matraz o en biorreactor
respectivamente, se tuvieron las siguientes caractersticas presentadas en la tabla 8.

96

Tabla 8. Caractersticas del proceso de estimacin de parmetros en cinticas en lote

Caractersticas No. Matraz y biorreactor Biorreactor
Nmero de datos de identificacin
de parmetros*
7 60%
Nmero de datos de validacin* 7 40%

6
max

S
K
s x
Y
p x
Y

d
k

Valores semilla para cada
parmetro
0.01 0.2 0.1 0.01 0.01 0.01
Funcin objetivo
6
10 1 0

Tolerancia b

Restricciones Segn datos experimentales y referenciados
; 5 . 1 0 ; 23 0 ; 09 . 0 015 . 0
max

s x s
Y K
Segn valores reportados
; 015 . 0 0 ; 7 . 1 0 ; 35 . 0 005 . 0
d p x
k Y
Segn condiciones de cada cultivo
f cultivo
t t t = 0
*Los datos se tomaron para cada cintica y se realizaron por triplicado.

Este procedimiento se hizo, corriendo las siguientes rutinas.

i. Modelo de la cintica obtenida en matraz

a) Modelo tipo Monod, para un proceso en lote, a tres diferentes medios de cultivo.

Medio Gly-NH
4

Se estimaron los parmetros del modelo cintico para el medio reportado por Bushell
(2006), en la figura 25 se presentan los datos experimentales y las curvas obtenidas de las
ecuaciones cinticas, para el consumo de sustrato, formacin de biomasa y produccin de
AC, con su respectivo coeficiente de correlacin, los cuales muestran el buen ajuste en las
cinticas de formacin de biomasa y produccin de AC; el coeficiente de correlacin para
el ajuste de la cintica de consumo de sustrato es de 0.9444, lo que significa que es muy
aproximado, pero que segn el modelo el consumo de sustrato debe ser mayor y que el
sustrato tiende a agotarse en el medio, lo que no ocurre en la parte experimental, an as el
97

ajuste es aceptable; en la figura 26, se muestra la relacin de identidad entre los datos de
cido clavulnico experimentales vs. simulados, lo cual da un grado de correlacin de
0.976.

Figura 25. Modelo tipo Monod de la cintica de consumo de sustrato, formacin de biomasa y produccin de
cido clavulnico en matraz, medio Gly-NH
4
.

Figura 26. Relacin identidad de los datos de cido clavulnico experimentales en matraz vs. los datos de
cido clavulnico simulados, medio Gly-NH
4
, modelo tipo Monod.

98

Medio Gly-Asn

Se estimaron los parmetros del modelo cintico para el medio Gly-Asn; en la figura 27 se
presentan los datos experimentales y las curvas obtenidas de las ecuaciones cinticas para
el consumo de sustrato, formacin de biomasa y produccin de cido clavulnico con sus
respectivos coeficientes de correlacin, los cuales indican que el modelo si representa las
tendencias experimentales y por lo tanto puede ser utilizado con este medio para predecir y
disear cultivos de Sc en lote.

En la figura 28, se muestra la relacin de identidad entre los datos de cido clavulnico
experimentales vs. simulados, con un grado de correlacin de 0.978, lo cual ratifica que el
modelo ajusta muy bien al proceso experimental para la produccin de AC el cual es el
inters de este trabajo.

cido clavulnico en matraz, medio Gly-Asn.

99

cido clavulnico simulados, medio de produccin Gly-Asn, modelo tipo Monod.

Medio Gly-HS

Se estimaron los parmetros del modelo cintico para el medio glicerol-harina de soya; en
la figura 29, se presenta los datos experimentales y las curvas obtenidas de las ecuaciones
cinticas para el consumo de sustrato, formacin de biomasa y produccin de cido
clavulnico, con sus respectivos coeficientes de correlacin, resultados que son muy buenos
en el ajuste del modelo con la cintica de la biomasa y del sustrato, pero el ajuste de la
cintica de produccin de AC, visualmente es pobre y se corrobora con el coeficiente de
correlacin, lo que indica que el modelo planteado no representa la tendencia de los
resultados experimentales para el cultivo de Sc en medio complejo, esto se debe a que la
ecuacin de Monod no toma en cuenta un trmino donde la alta concentracin celular,
afecta la formacin de producto, el cual empieza a formarse en la fase de crecimiento
estacionaria y como esto aporta en el produccin de AC.

En la figura 30 se muestra la relacin de identidad entre los datos de cido clavulnico
experimentales vs. simulados, lo cual da un grado de correlacin de 0.938 que demuestra
que el ajuste no es bueno para representan la produccin de AC en este tipo de medios.

100

cido clavulnico en matraz, medio Gly-HS.

cido clavulnico simulados, medio de produccin Gly-HS, modelo tipo Monod.

En la tabla 9, se muestran los parmetros cinticos estimados en los cultivos realizados en
matraz, ajustados con el modelo tipo Monod el cual presenta las tendencias de los datos
experimentales.

El mejor ajuste que se obtuvo fue en el medio de Gly-Asn. Los valores de los parmetros,
que resultan de la simulacin son comparables y reproducen los valores obtenidos de forma
experimental; al compararlos con modelos reportados en la literatura, para medio complejo
(Baptista_Neto y colaboradores, 2000), los cuales son bastantes diferentes a los obtenidos
en los parmetros de ( )
1
max

h , ( )
1
h k
d
, ( ) P mg X g Y
p x
; los valores obtenidos por Neto
y colaboradores (2000), son 0.21 h
-1
, 0.038 h
-1
, 0.29 g de X/mg de P respectivamente

101

Tabla 9. Parmetros cinticos estimados del cultivo en matraz, con el modelo tipo Monod empleando un
mtodo de regresin mltiple no lineal.

Medios
Parmetros Gly-NH
4
Gly-Asn Gly-HS
Valores estimados Valores estimados Valores estimados
( )
1
max

h
0.089 0.0015 0.042 0.0039 0.041 0.0068
( ) L S g K
s

18.091 1.079 0.23 0.021 15.64 3.05
( ) S g X g Y
s
x

0.28 0.038 0.36 0.052 0.12 0.043
( ) P mg X g Y
p
x

0.23 0,038 0.089 0.014 0.0076 0.0037
( ) X g P mg 9,1110
-12
1.5310
-13
0.023 0.0042 0.016 0.0013
( )
1
h k
d

0.019 0.0039 0.0043 0.00031 1.7910
-9
2.4710
-10

*Estos valores presentan un 95% de confiabilidad dentro del rango establecido.

Los parmetros ( ) L S g K
s
y ( ) S g X g Y
s x
obtenidos son variables, algunos tienen
valores ms bajos y otros tienen valores mucho ms altos que los obtenidos por Neto y
colaboradores (2000), lo que puede verse reflejado en la productividad y en la
concentracin de cido clavulnico obtenida, ya que la formacin de biomasa y el consumo
de glicerol como fuente de sustrato, en los dos modelos tienen comportamientos similares,
pudiendo deducir que el glicerol como fuente de carbono, tiene una fuerte influencia en la
produccin de cido clavulnico. Los valores obtenidos por Neto y colaboradores (2000)
son mucho ms altos que los obtenidos en este trabajo, con la diferencia, de que el modelo
que se plantea no contiene funciones de paso, es ms sencillo y modela las tres cinticas
simultneamente.
El medio complejo presenta menor valor de la constante
d
k , lo que significa que este medio
favorece la estabilidad del microorganismo, hacindolo un medio ideal para la formacin y
mantenimiento de biomasa, lo cual se ve reflejado en el valor de cido clavulnico
obtenido, tambin se puede pensar que es un buen medio para realizar medios en cultivo en
continuo. Se observa tambin que el ajuste del modelo con la ecuacin de Monod, no
presenta una tendencia buena para la produccin de cido clavulnico, lo cual se puede ver
reflejado en el coeficiente de correlacin, ver figura 29, pero donde la ecuacin de Monod
no explica ni representa la influencia del medio de cultivo y la alta concentracin celular, el
102

cual al transcurrir el tiempo de cultivo, el medio se hace mas viscoso con el crecimiento del
microorganismo y al producirse mayor concentracin de AC, la ecuacin de Monod no
modela la produccin del metabolito en medio complejo.

b) Modelo tipo Contois para un proceso en lote, tres diferentes medios de cultivo.

Medio Gly-NH
4

Se estimaron los parmetros del modelo cintico para el medio Gly-NH
4
, en la figura 31, se
presentan los datos experimentales y las curvas obtenidas de las ecuaciones cinticas para
el consumo de sustrato, formacin de biomasa y produccin de cido clavulnico, con sus
respectivos coeficientes de correlacin cuyos valores se alejan de 1, el valor ideal para un
ajuste excelente, lo que significa que el modelo tipo Contois no sirve para modelar las
cinticas experimentales del cultivo en lote de Sc en este medio de cultivo.
experimentales vs. simulados, lo cual da un grado de correlacin de 0.948, que indica que
los datos modelados se alejan del comportamiento real del sistema, que permite descartar el
uso del modelo tipo Contois, para modelar o representar las cinticas del cultivo de Sc en el
medio de cultivo donde los nutrientes no hacen que la solucin del medio sea viscosa.

Figura 31. Modelo tipo Contois de la cintica de consumo de sustrato, formacin de biomasa y produccin de
cido clavulnico en matraz, medio Gly-NH
4
.
103

cido clavulnico simulados, medio Gly-NH
4
, modelo tipo Contois.

Medio Gly-Asn

Se estimaron los parmetros del modelo cintico para el medio Gly-Asn en la figura 33 se
presenta los datos experimentales y las curvas obtenidas de las ecuaciones cinticas para el
consumo de sustrato, formacin de biomasa y produccin de cido clavulnico con sus
respectivos coeficientes de correlacin, en los cuales se ve que solo existe un buen ajuste
para los datos de la cintica de la biomasa pero donde el ajuste de la cintica de consumo de
sustrato y produccin de AC, no son bien representados por el modelo tipo Contois en este
medio de cultivo; en la figura 34, se muestra la relacin de identidad entre los datos de
cido clavulnico experimentales vs. simulados, lo cual da un grado de correlacin de
0.948, demostrando que su ajuste no es bueno y que no representa la cintica experimental
del cultivo de Sc en este medio de cultivo.
104

cido clavulnico en matraz, medio Gly-Asn.

cido clavulnico simulados, medio de produccin Gly-Asn, modelo tipo Contois.

Medio Gly-HS

Se estimaron los parmetros del modelo cintico para el medio Gly-HS, en la figura 35 se
consumo de sustrato, formacin de biomasa y produccin de cido clavulnico con sus
105

respectivos coeficientes de correlacin, los cuales son excelentes, implica que el modelo
tipo Contois, es el modelo con el cual se pueden trabajar cultivos de Sc en medio complejo;
en la figura 36, se muestra la relacin de identidad entre los datos de cido clavulnico
experimentales vs. simulados, lo cual da un grado de correlacin de 0.992, con lo cual se
puede concluir que este tipo de modelo es el indicado para trabajar y utilizar cuando la
condiciones son cultivo en lote de Sc en medio complejo.

Se realizo el modelado y ajuste de parmetros, representando con la ecuacin de Contois,
porque en el desarrollo experimental del trabajo, se observ que en el medio de cultivo, la
concentracin de la biomasa aumenta de manera considerable, al transcurrir el tiempo;
tomando en cuenta que la ecuacin de Contois, expresa la velocidad de crecimiento del
microorganismo en funcin del aumento de la concentracin celular

cido clavulnico en matraz, medio Gly-HS.

106

cido clavulnico simulados, medio Gly-HS, modelo tipo Contois.

En la tabla 10 se presentan los parmetros cinticos estimados en los cultivos en matraz
modelando el crecimiento con la ecuacin de Contois, que ajustan el modelo para que
presente las tendencias de los datos experimentales.

Tabla 10. Parmetros cinticos estimados del cultivo en matraz, con el modelo tipo Contois, empleando un
mtodo de regresin no lineal.

Medios
Parmetros Gly-NH
4
Gly-Asn Gly-HS
Valores estimados Valores estimados Valores estimados
( )
1
max

h
0.088 0,0048 0.053 0.013 0.057 0.0017
( ) L S g K
s

12.98 4.99 0.83 0.011 5.60 1.18
( ) S g X g Y
s
x

0.29 0.042 0.31 0.18 0.12 0.015
( ) P mg X g Y
p
x

0.20 0.015 0.069 0.043 0.0077 0.0024
( ) X g P mg
0.0040 0.0012 0.0062 0.00063 1.68 0.41
( )
1
h k
d

0.016 0.0032 3.4210
-9
3.7310
-10
0.0010 0.00061

Al modelar los datos experimentales del proceso el ajuste para el medio complejo con el
modelo tipo Contois es muy bueno, el cual se cuantifica por medio del coeficiente de
correlacin con un valor de 0.992 ver figura 36.
107

El modelo con la ecuacin de Contois consta de dos funciones de paso, de tal forma que no
se observa produccin de cido clavulnico cuando la concentracin del glicerol es mayor
de 15 g de sustrato/L, en este rango de tiempo entre las 0 35 horas, la funcin de paso
tiene un valor de 0 como factor de la ecuacin de la cintica de produccin. Cuando en la
cintica de consumo de sustrato la concentracin de la fuente de carbono es menor de 15 g
de sustrato/L, se inicia la produccin de cido clavulnico y la funcin de paso adquiere un
valor de 1, lo cual hace que el procedimiento de ajuste con el modelo que utiliza la
ecuacin de Contois, sea ms complejo que el ajuste con el modelo que utiliza la ecuacin
de Monod. Este tipo de modelo y ajuste con funciones de paso ha sido utilizado en la
literatura para medio complejo (Baptista_Neto y colaboradores, 2000). En la literatura no
se encuentran modelos tipo Contois con funciones de paso, que utilicen un desarrollo de las
ecuaciones de forma comparable al planteado en este trabajo, para los medios
qumicamente definidos. El modelado de medios complejos representando con la
ecuacin de Contois da coeficientes de correlacin muy altos, que se interpreta como un
ajuste muy bueno adicional a que la produccin de cido clavulnico en medio complejo es
alta, lo que podra utilizarse para estudiar o mejorar la produccin de este metabolito de
inters en este tipo de medios (Gmez y colaboradores, 2011). Otra ventaja que se puede
ver en el ajuste que utiliza el modelo con la ecuacin de Contois, se debe a que toma en
cuenta el valor de la saturacin cuando la concentracin de la biomasa es muy alta, lo cual
hace que los valores de la constante de saturacin a partir del sustrato,
s
K , sea ms bajo
que cuando se utiliza la ecuacin de Monod, en la cual se le deja toda la inhibicin a la
concentracin del sustrato de saturacin,
s
K , por lo cual este tipo de ajuste es bueno si se
quiere cuantificar que efecto ejerce la concentracin de la biomasa en la cintica de
formacin celular, consumo de sustrato y produccin de cido clavulnico.
El modelado de los medios qumicamente definidos con la ecuacin de Contois no es
satisfactorio, ver figuras 31 y 33. En un procedimiento de anlisis de flux metablico, se
requiere tener claro cules son las fuentes precursoras de la produccin de AC en el
metabolismo del microorganismo, debido a lo cual el medio de cultivo requerido en esta
investigacin es qumicamente definido (Ros, 2012), como los resultados del medio
108

qumicamente definido del cual se obtuvieron mejores rendimientos y productividades de
AC, los cuales de trabajan con un modelo tipo Monod, se continuo el cultivo en biorreactor.

ii. Modelo de la cintica obtenida en biorreactor

c) Modelo tipo Monod para un proceso en lote.

Se estimaron los parmetros del modelo cintico para el medio Gly-Asn en la figura 37 se
consumo de sustrato, formacin de biomasa y produccin de AC con sus respectivos
coeficientes de correlacin, los cuales dan valores muy cercanos a 1, que significa que el
modelo tipo Monod, representa la cintica experimental de un cultivo en lote para producir
AC a partir de Sc en un biorreactor. An as, al comparar los valores de los coeficientes de
correlacin del ajuste al cultivo de Sc en medio Gly-Asn, llevado a cabo en matraz y los
que se realizaron en biorreactor, los coeficientes obtenidos en el cultivo en el biorreactor
son valores ms bajos (ver figura 37) con respecto a los valores obtenidos en el ajuste a los
datos obtenidos en el cultivo en matraz (ver figura 27), lo que significa que hay factores en
el biorreactor que no se tienen en cuenta al pasar de un sistema de matraces a un
biorreactor. Con los datos de a K
L
, de
2
O
Q y con la ecuacin 32, se calcul la concentracin
de oxgeno disuelto en el medio a partir de los datos obtenidos para la biomasa en la
regresin mltiple, y se observa que la tendencia de la cintica del oxgeno disuelto
experimental, resultados del electrodo, con respecto a la cintica simulada, presentan una
tendencia similar, donde se obtiene la tendencia del oxgeno disuelto en el medio de cultivo
de Streptomyces clavuligerus, el cual presenta un coeficiente de correlacin de 0.9307, pero
que no es resultado de un ajuste simultaneo con las otras tres cinticas (X, S y P), sino que
se vale de datos experimentales para verificar si con los datos de biomasa simulados,
representa la tendencia de este sustrato en el medio de cultivo.
El valor de 0.9307, como coeficiente de correlacin del modelo de oxgeno disuelto en el
medio, indica que no es la mejor forma de modelar la cintica de oxgeno disuelto en el
medio de cultivo.
109

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0
10
20
30
40
50
60
Tiempo (h)
C
o
n
c
e
n
t
r
a
c
i
n

Biomasa (g/L) R
2
=0,9681
Sustrato (g/L) R
2
=0,9510
cido Clavulnico (mg/L) R
2
=0.9656
Oxgeno disuelto (mg/L) R
2
=0.9307

cido clavulnico y oxgeno disuelto en biorreactor, medio Gly-Asn.

experimentales vs. simulados, lo cual da un grado de correlacin de 0.952 respaldando los
resultados obtenidos en el modelo para el cultivo en biorreactor, donde los valores de
correlacin son buenos pero ms bajos que para los modelos aplicados a los cultivos en
matraz.
110

Figura 38. Relacin identidad de los datos de cido clavulnico experimentales en biorreactor vs. los datos
de cido clavulnico simulados, medio de produccin Gly-Asn, modelo tipo Monod.

En la tabla 11, se presentan los valores de los parmetros cinticos estimados, para el
modelo tipo Monod, del cultivo en lote de Sc en biorreactor.

Tabla 11. Parmetros cinticos del cultivo fermentacin en biorreactor operando en lote, con modelo tipo
Monod.

Valores estimados
( )
1
max

h
0.041 0.0055
( ) L S g K
s

0.12 0.013
( ) S g X g Y
s
x

0.38 0.00038
( ) P mg X g Y
p
x

0.15 0.025
( ) X g P mg
0.00015 0.00012
( )
1
h k
d

0.0085 0.00043

Se valid el modelo tipo Monod y sus parmetros, con el 40% de los datos obtenidos de un
cultivo en lote, realizado en el biorreactor a iguales condiciones que el cultivo que se
presenta en la figura 35. El resultado logrado es la cintica que se observa en la figura 37,
donde se muestran los datos experimentales y los datos simulados a iguales condiciones, se
111

reportan tambin los coeficientes de correlacin de cada tendencia con respecto a los datos
experimentales.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0
10
20
30
40
50
60
Tiempo (h)
C
o
n
c
e
n
t
r
a
c
i
n

Biomasa (g/L) R
2
=0,9623
Sustrato (g/L) R
2
=0,9507
cido Clavulnico (mg/L) R
2
=0.9807
Oxgeno disuelto (mg/L) R
2
=0.9731

Figura 37. Validacin del modelo tipo Monod de la cintica de consumo de sustrato, formacin de biomasa y
produccin de cido clavulnico en biorreactor, medio Gly-Asn.

En la figura 37, se observa la tendencia del oxgeno disuelto en el medio de cultivo la cual
tiende a ser estable, durante el transcurso del cultivo, lo que indica que no presenta un
efecto sobre la produccin de AC. El valor final y estable de oxgeno disuelto es un valor
muy interesante, el cual es aproximadamente 20.528%, la concentracin oxgeno disuelto
en el medio depende de la velocidad de transferencia de oxgeno (OTR) (Roubos y
colaboradores, 2002), en la literatura se puede encontrar que un valor de 20% de oxgeno
disuelto en el medio de cultivo, es un valor crtico para el microorganismo, el cual tambin
se puede encontrar reportado en la literatura por Rosa y colaboradores (2005) donde se
reporta un 20%, como el valor crtico de oxgeno en un cultivo de Streptomyces
clavuligerus. En este trabajo se puede ver que se garantiz la demanda de oxgeno en el
medio de cultivo.

112

experimentales vs. simulados, lo cual da un grado de correlacin de 0.981, un valor de
coeficiente de correlacin que indica que el modelo representa bien la cintica de
produccin de AC, resultados que validan el modelo y su utilidad.

Al modelar y ajustar los parmetros del cultivo de Streptomyces clavuligerus en lote en el
biorreactor, se obtiene una velocidad de crecimiento especfica muy acorde a los valores
obtenidos experimentalmente. Donde la
max
, tiene valores muy similares, lo que significa
que el modelo representa muy bien la cintica experimental.

Figura38. Relacin identidad de los datos de cido clavulnico experimentales en biorreactor vs. los datos de
cido clavulnico simulados, de la validacin del modelo para el medio Gly-Asn, modelo tipo Monod.

De la misma forma tambin se obtiene valores de rendimientos
s x
Y ,
p x
Y muy similares a
los obtenidos de forma experimental, de lo cual se puede inferir que el modelo y el ajuste
dan una representacin muy significativa de la cintica experimental, y a partir del cual
tambin se puede valorar los constantes como son
s
K , y
d
k , que no son fciles de
cuantificar por otros medios. El modelo se puede utilizar como una herramienta de estudio,
anlisis, diseo y prediccin de cinticas, sin la necesidad de llevarlas a cabo de forma
experimental.
113

En el biorreactor se obtiene una velocidad de crecimiento especfica menor que la obtenida
en el medio Gly-Asn en la fermentacin en matraz, ver tabla 11 donde se presenta un
comportamiento similar con la constante de saturacin
s
K y , lo que puede significar que
la concentracin de oxgeno disuelto en el medio de cultivo, cuando se trabaja en
biorreactor, desfavorece la velocidad de crecimiento del microorganismo, sin embargo la
constante de muerte celular,
d
k , se aumenta considerablemente y su influencia en un
cultivo en lote se representa en el tiempo que el microorganismo mantiene su densidad
celular estable, al igual que la produccin de cido clavulnico, de tal manera que a mayor
d
k , menor es el tiempo en el que el microorganismo produce la misma concentracin de
cido clavulnico. Se observa igualmente que la disminucin de la concentracin de
metabolito, se da durante la fase de decaimiento en la cintica de la biomasa. Tambin se
puede inferir que si la densidad celular se mantiene estable, tambin se puede mantener
estable la produccin de cido clavulnico, pudiendo pensar que el cultivo en continuo es
un proceso prometedor.
El valor de la constante
d
k el cual es mayor en el biorreactor, al igual que los
rendimientos, es un hecho importante en la produccin del metabolito de inters y el
consumo de sustrato haciendo que sus valores disminuyan y que la constante de saturacin
aumente.

5.5.2 Simulacin de la cintica de fermentacin en continuo.

Los datos graficados en la figura 39 corresponden a datos simulados con los valores de los
parmetros estimados y modelados en un cultivo en lote, los valores utilizados se
presentaron en la tabla 12. Al simular un continuo en biorreactor, se observa que en el
estado estable con los parmetros estimados y encontrados en el ajuste realizado al cultivo
en lote realizado en biorreactor, si este proceso se desarrollara en continuo, el glicerol debe
estar agotado, la biomasa en un valor aproximadamente de 5 g/L y la produccin de cido
clavulnico, segn las condiciones dadas al programa, a menor tasa de dilucin mayor
formacin del producto. En los resultados obtenidos se observa que el sustrato no se agota
114

totalmente y que la concentracin de AC en estado estable simulada, es mucho ms baja
que la que se obtiene en los cultivo en lote, durante la fase estacionaria. En la literatura se
pueden encontrar valores de la concentracin de AC mas altos a los simulados en este
trabajo, Kirk y colaboradores (2000) a una tasa de dilucin de 0.05 h
-1
que lograron
producir 96.36 mg de AC/L. Lo que significa que an queda factores que se deben estudiar
en la produccin de este metabolito con un medio qumicamente definido, para poder
definir cul es el parmetro y las variables ms influyentes en el proceso de produccin
biolgica del AC. Bushell y colaboradores (2006), trabajaron a diferentes tasas de dilucin
entre 0.03 a 0.1 h
-1
, logrando la mejor produccin de AC a la menor tasa de dilucin y con
un valor de 12.80 mg de AC/L, reportndolo como 0.32 mg de AC/(g de biomasa.h) y con
0.036 g de biomasa/(L.h), trabajo que desarrollaron en medio qumicamente definido. En la
tabla 7 se puede observar que a una velocidad de dilucin de 0.03 h
-1
se obtuvo 6.31 mg de
AC/L, que sera la mitad de lo producido por Bushell y colaboradores (2006) a la misma
velocidad de dilucin. Otro trabajo reportado fue el desarrollado por Baptista Neto y
colaboradores (2005), donde presentan resultados de un cultivo de Streptomyces
clavuligerus en un proceso en continuo en medio complejo, lo cual fue desarrollado en una
rango de tasas de dilucin desde 0.03 a 0.18 h
-1
, resultados a los cuales le hicieron un ajuste
de curvas, donde se puede ver que a menor D, mejor produccin del metabolito obteniendo
425 mg de AC/L a una D de 0.03 h
-1
, con una concentracin de biomasa formada de 10
g/L, donde el glicerol debe haberse agotado o tener un valor mximo de 1 g de fuente de
carbono/L.

Lo interesante de estas simulaciones es notar que cuando se simula el proceso a unas
condiciones parecidas a las experimentales, se obtienen resultados que pueden ser
obtenidos en el laboratorio, ya que si se observa la produccin de AC en las simulaciones
de la figura 39 se puede notar que a las ( )
1
max

h trabajadas experimentalmente, se podra
obtener entre 30 a 35 mg de AC/L , resultado que es ms bajo que el valor obtenido en el
cultivo en lote realizado en el biorreactor, ver tabla 11 y figura 37. En la grafica 39 el
oxgeno disuelto esta agotado, lo que sugiere que si se trabaja con limitacin de la fuente de
oxgeno la concentracin de cido clavulnico se mantendra estable.
115

Figura 39. Simulacin de la cintica en la fermentacin de Streptomyces clavuligerus en biorreactor
operando en continuo en rgimen estacionario.

5.5.3 Anlisis de sensibilidad de los parmetros estimados

Se analiz la sensibilidad del modelo hacindole perturbaciones de 10% del valor nominal
obtenido en los ajustes de los parmetros encontrados en cada caso segn las condiciones
experimentales. En la tabla 12 se presentan los valores de la sensibilidad promedio para
cada variable (X, S y P) calculados en el anlisis de sensibilidad, realizado a los parmetros
del modelo para el cultivo con el medio Gly-Asn, fermentaciones llevadas a cabo en
biorreactor con un medio qumicamente definido, donde se puede concluir que los
parmetros con mayor sensibilidad a un cambio en su valor de 10% y que influyen en las
variables del modelo se presentan en la tabla 13.
Tabla 12. Valores de sensibilidad promedio de las variables en el modelo en lote
Variable perturbada Sensibilidad promedio
X S P
max

10% 0.1139 0.1083 0.1084
s
K
10% 0.1399 0.1361 0.1361
s x
Y
10% 0.0447 0.0925 0.0375
p x
Y
10% 0.1402 0.1363 0.1399
10% 0.0367 0.0367 0.0367
d
k
10% 0.1387 0.1343 0.1343
116

Tabla 13. Parmetros ms relevantes del anlisis de sensibilidad

Variables del modelo Parmetros
X
max
,
s
K
p
x
Y y
d
k
S
max
,
s
K
p
x
Y y
d
k
P
max
,
s
K
p
x
Y y
d
k

Las figuras 40 a 44 se muestran grficamente cmo los parmetros de la tabla 13 afectan las
variables del modelo. En la mayora de los casos no se observan fuertes desviaciones
producto de perturbaciones positivas (+10%) y negativas (-10%) efectuadas a los
parmetros del modelo, la variable que cualitativamente ms afecta el modelo es
max
, se
puede deducir que la cintica de produccin de AC, tiene parte de su cintica asociada al
crecimiento del microorganismo,
p
x
Y y otra parte de su cintica, asociada a la biomasa pero
no al crecimiento,
p
x
Y , lo cual es similar a la ecuacin desarrollada por Luedeking y Piret
(Dunn y colaboradores, 2003). La produccin de cido clavulnico fue la variable ms
sensible, producto de las perturbaciones en los parmetros respectivamente.

max
medio Gly-Asn en lote.

117

s
K

s x
Y

p x
Y

118

Figura 43. Anlisis de sensibilidad del parmetro medio Gly-Asn en lote.

d
k

De las graficas 40 a 45, se deduce que el modelo es robusto, ya que la sensibilidad de los
parmetros es menor a 0.14, como influencia de la perturbacin de los parmetros. Las
perturbaciones significativas, que muestran mxima sensibilidad son
d
k
,
s
K y
p
x
Y ;
entonces el tipo de sustrato y la compatibilidad metablica del microorganismo con la
fuente de carbono son muy importante en el proceso. Tambin se puede inferir que la
formacin de la biomasa es muy significativa, ya que
p
x
Y es de los parmetros ms
sensibles lo que explicara en el proceso de formacin de biomasa y su relacin con la
produccin del cido clavulnico. En la figuras 41, 43 y 45 se presenta un estado de
inestabilidad el cual se presenta en la cintica de formacin de cido clavulnico, cuando el
parmetro
d
k
es perturbado negativamente, lo que indica que es importante considerar en la
119

cintica del cultivo de Sc este parmetro y que entre menos se considere su influencia,
menos representacin de la cintica tendr el modelo. El valor de este parmetro es
pequeo e importante componente de la ecuaciones cinticas, ya que el decrecimiento del
microorganismo control la produccin del AC.

Se analiz la sensibilidad del modelo en continuo, hacindole perturbaciones de 10% del
valor de los parmetros utilizados para la simulacin, segn las condiciones
experimentales. Los valores de la sensibilidad promedio obtenidas para cada variable (X, S
y P) son de 0.0476 en el anlisis de sensibilidad, el cual fue realizado a los parmetros del
modelo para el cultivo con el medio Gly-Asn en los cultivos realizados en biorreactor en
un medio qumicamente definido, se puede concluir que los parmetros con mayor
sensibilidad a un cambio en su valor de 10% y que influyen en las variables del modelo,
las cuales se muestran en la tabla 14.

Tabla 14. Parmetros ms importantes del anlisis de sensibilidad al proceso simulado en continuo.

Variables del modelo Parmetros
X
max
,
s
K y
p
x
Y
S
max
,
s
K y
p
x
Y
P
max
,
s
K y
p
x
Y

Estos resultados se muestran en las figuras 46 a 50 donde se puede concluir que en continuo
ningn parmetro, influye ms que otro cuantitativamente, siempre y cuando un cambio en
algn parmetro no exceda una variacin del 10% tanto positiva como negativamente.
Cualitativamente se puede observar que la velocidad mxima especfica de crecimiento,
max
, el coeficiente de rendimiento
p
x
Y y la constante de saturacin ejercen un mayor
efecto sobre la produccin de AC, aunque no es tan fuerte como para decir que se puede
desestabilizar el proceso en continuo.

120

A menor valor de
max
se obtienen valores menores de concentracin de AC, es decir que
su influencia es directamente proporcional sobre la produccin de AC ver figura 46. La
variacin en la constante de saturacin (
s
K
), es ms influyente a menor velocidad de
dilucin, donde a una Dde 0.02 h
-1
y se observa que a menor valor en la constante, la
concentracin de AC aumenta, ver figura 48.

max
como parmetro perturbado.

s
K como parmetro perturbado.

121

s x
Y

p x
Y

Figura 49. Anlisis de sensibilidad, medio Gly-Asn en continuo. como parmetro perturbado.

124

6. CONCLUSIONES
La produccin de cido clavulnico, se favorece en medio complejo, pues presenta
mayor velocidad de crecimiento especfico, mejor adaptacin de la Streptomyces
clavuligerus en el medio y menor velocidad especfica de muerte del microorganismo.
El medio Gly-Asn (qumicamente definido) es el mejor medio evaluado para llevar a
cabo un cultivo en lote de Streptomyces clavuligerus. Se determin que la velocidad
mxima de dilucin para llevar a cabo un cultivo en continuo es de 0.0415 h
-1
, que
equivale a la mxima tasa de dilucin para operar un cultivo en continuo a 28C, 500
rpm, 1 vvm y pH a 6.8.
Se obtuvo un modelo matemtico tipo Monod, que describe las tendencias
experimentales de la operacin por lote para la produccin de AC y que permite predecir
el comportamiento de las variables (biomasa, sustrato y producto) durante el tiempo de
proceso de fermentacin con un 4% de error del modelo; razn por la cual se puede
simular procesos en lote, variando slo la concentracin inicial de los nutrientes en el
medio de cultivo, a 28C, 500 rpm, 1 vvm y pH a 6.8. Adicionalmente, se pueden
evaluar los rendimientos del proceso a las condiciones establecidas en el modelo.
El modelo tipo Contois planteado sirve para describir la velocidad de crecimiento
especfico, es muy acertado para modelar la produccin de cido clavulnico en medio
complejo.
Los parmetros obtenidos en los modelos ms influyentes en en el proceso en lote y en
continuo son la velocidad de crecimiento especfico, la constante de saturacin, el
rendimiento de biomasa con respecto al producto y la constante de muerte celular.
En el anlisis de sensibilidad de los modelos de la cintica de un cultivo de Streptomyces
clavuligerus, se observa que el parmetro ms influyente es la velocidad mxima de
crecimiento especfica,
max
, ya que todo cultivo depende directamente del crecimiento
y estabilidad celular del microorganismo.
El buen ajuste de las cinticas del modelo y el anlisis de sensibilidad de las variables,
muestra que la produccin de cido clavulnico en los medios qumicamente definidos
es afectada de forma negativa por la concentracin de la biomasa.
125

Todas las simulaciones realizadas con los parmetros ajustados a la ecuaciones
matemticas del modelo tipo Monod, empezaron a las 0 horas de la cinticas de
formacin de biomasa, consumo de sustrato y produccin de metabolito de inters, lo
que indica que el modelo es capaz de simular todas las fases de la cintica de un cultivo
de Streptomyces clavuligerus, donde las tres dinmicas se simulan y ajustan
simultneamente.
En este trabajo de investigacin no se lograron resultados concluyentes sobre la
influencia que ejerce la concentracin de oxgeno disuelto sobre la produccin de cido
clavulnico.

126

7. IMPACTOS
El modelo es una herramienta que permite simular y predecir el proceso de produccin
de cido clavulnico con un error pequeo en el modelo. Herramienta con la cual se
pueden evaluar rendimientos y estrategias de produccin, haciendo que los costos sean
mas bajos y en menor tiempo; oportunidad que se debe aprovechar para que esto se vea
reflejado en los precios finales de los medicamentos, lo que da mas acceso a los
antimicrobianos de origen biolgico, por parte de la poblacin carente de recursos, que
sean menos txicos y con una lnea de accin biolgica mas continua.
En Colombia no se produce el cido clavulnico a nivel industrial, la cepa de
Streptomyces clavuligerus es de suelo suramericanos, por lo cual este estudio aporta
conocimiento y herramientas para generar conciencia en la posibilidad de iniciar trabajos
hacia la creacin de una industria farmacutica nacional.
El uso del glicerol como sustrato en la produccin microbiana de cido clavulnico, es
una aplicacin potencial para eprovechar el subproducto de la industria del Biodiesel.
Dada la necesidad de buscar alternativas a las grandes cantidades de glicerol que se
producen como subproducto de la produccin de los agrocombustibles.
Se cuenta con una infraestructura para la produccin del inhibidor y su determinacin
analtica, lo cual es funcional para seguir indagando e investigando en la mejora de su
produccin.
La formacin acadmica lograda a partir de este trabajo experimental, es una formacin
integral e interdisciplinaria, de muy buena calidad acadmica.
El desarrollo de este trabajo de investigacin y sus resultados, amplian la necesidad de
los ingenieros en los desarrollos biotecnolgicos, que aportan a las ciencias de la salud y
a la parte clnica, debido a la formacin matemtica y de los fundamentos en los
procesos industriales que estos actores acadmicos poseen.
La industria farmacutica, requiere de mejorar las produccin de los medicamentos
existentes, en tiempo y costo; adicionalmente, tiene que desarrollar nuevos productos y
estrategias de produccin, para lo cual una visin con formacin de ingeniera es una
buena opcin.
127

La produccin de antibiticos a gran escala se logra a travs de tres etapas principales, el
mejoramiento y seleccin de cepas, la optimizacin de las condiciones del cultivo y del
proceso, y por ltimo, de seleccionar el mejor medio para la produccin, esta
investigacin aporta conocimiento a las dos ltimas etapas requeridas para producir
medicamentos a nivel industrial.
El desarrollo de un modelo de base fenomenolgica y su programa que permite el
modelado simultaneo de las cinticas de formacin de biomasa, consumo de sustrato y
produccin de AC.
128

8. RECOMENDACIONES
Hay que seguir estudiando e investigando el desarrollo de nuevas formulas e innovar los
procesos ya existentes, para producir productos antibiticos e inhibidores y sus procesos
de manera que se pueda seguir contrarrestando el creciente fenmeno de la resistencia
microbiana, de tal forma que se ampli el acceso a los antimicrobianos.
Estudiar las fuentes de nitrgeno y su influencia en la produccin del cido clavulnico.
Estudiar el proceso bajo limitacin de oxgeno disuelto.
La realizacin de una interfaz, puede ser por medio de MATLAB, de tal forma que se
pueda simular el proceso, si necesidad de entender toda la matemtica inserta en su
resolucin numrica y matemtica del proceso.

129

9. BIBLIOGRAFIA

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clavuligerus . Process biochemistry(40), 1161-1166.
138

Yegneswaran, P. K., Gray, M. R., & Thompson, B. G. (1991). Effect of disolved oxygen
control on growth and antibiotic production in Streptomyces clavuligerus
fermentations. Biotechnology progress(7), 246-250.
139

ANEXO No. 1: Modelo computacional

%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
%% PROGRAMA REALIZADO POR: NATHALIA ANDREA GMEZ GRIMALDOS
%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
%% Ajuste por mnimos cuadrados de resultados experimentales en un cultivo en lote, %%
%% modelo de cintica de crecimiento, de consumo de sustrato (GlY) y produccin de AC,
%% mediante el modelo de MONOD. donde dX/dt=U*CXo-kd*CXo; dS/dt=-U/Yxs*CXo;
%% dP/dt=(U/Yxp-Alfa)*CXo y U=((Umax*CSo)/(Ks+CSo)). Sin funciones de paso en el
%% modelo, teniendo en cuenta kd (Cosntante de muerte).
%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
clc,
clear all,
close all,
%Integracin del modelo cintico usando en Matlab con la funcin ode45.m
%para integrar las ecuaciones diferenciales
%Condiciones iniciales para y1=CXo, y2=CSo y y3=CPo.(Valores %experimentales)
%Ts=[min(tdat),max(tdat)];
Ts=[0:124.5]; % [h]
% Variables utilizadas en las ecuaciones
CXo=0.55319; %[g/L]Condicin experimental inicial de biomasa
CSo=23.481; %[g/L]Condicin experimental inicial de sustrato
CPo=0; %[mg/L]Condicin experimental inicial de producto
% Parametros semilla utilizados en las ecuaciones
MiuMax=0.01; %[1/h]Velocidad mxima de crecimiento
Ks=0.2; %[g/L]Constante de saturacin
Yxs=0.1; %[g de X formados/g de S consumidos]Rendimiento terico de X a S
Yxp=0.01; %[mg de P formados/g de S consumido.h] Tasa especfica de produccin de AC
Alfa=0.01;
kd=0.01;
%Encuentre suposiciones iniciales, integre el modelo y grafique las
%predicciones
k0=[MiuMax Ks Yxs Yxp Alfa kd];
y0=[CXo CSo CPo];
%Integre las ecuaciones
%Para Ts<=23 W=0.
dy0=@(t,y,k)[k(1)*(y(2)/(k(2)+y(2)))*y(1)-k(6)*y(1);(-
(1/k(3))*(k(1)*(y(2)/(k(2)+y(2)))*y(1)));((k(1)/k(4))*(y(2)/(k(2)+y(2)))*y(1)+k(5)*y(1))];
ts0=[0:124.5];
[tsim,ysim]=ode45(dy0,ts0,y0,[],k0);
%% Extraccin de los valores experimentales de los puntos para poder
%% aplicar una regresin por mnimos cuadrados por el mtodo de
%% Levenberg-Marquardt en MCNL
%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
140

% T es la matriz de Tiempo (valores experimentales)
T=[0, 22, 46.5, 73, 80.5, 98, 124.5];
% B es la matriz de los valores experimentales de formacin de biomasa
B=[0.55319 4.785 6.7896 6.90307 7.19624 7.4894 6.39243];
% S Es la matriz de los valores experimentales de consumo de sustrato
S=[23.481 16.666 7.9391 0.0455 0.011 0.006 0.001];
% P es la matriz de los valores experimentales de formacin de producto
AC=[0 0 31.67 111.129 100.23 107.874 107.874];
%% Graficando los resultados obtenidos de la regresin no lineal por %% %% mnimos
cuadrados
%% Grfica de los datos extrados de la modelacin la cintica por medio
%% de ecuaciones diferenciales, esto se hace para verificar que si son
%% correctos los datos extrados
figure(1)
plot(tsim,ysim,'-.');
hold on
plot(T,B,'b*');
hold on,
plot(T,S,'g*');
hold on,
plot(T,AC,'r*');
title('Medio Gly-Asn','FontSize',12)
xlabel('Tiempo [h]','FontSize',12);
ylabel('Concentracin','FontSize',12);
figure(2),H=axes('FontName','Times New Roman','FontSize',20,'LineWidth',5);
hold on
plot(tsim,ysim(:,1),'sk','LineWidth',1.5,'MarkerSize',14), box off
hold on
plot(tsim,ysim(:,2),'pk','LineWidth',1.5,'MarkerSize',14), box off
hold on
plot(tsim,ysim(:,3),'^k','LineWidth',1.5,'MarkerSize',14), box off
xlabel('Tiempo (h)','FontSize',32,'FontName','Times New Roman')
ylabel('Concentracin','FontSize',32,'FontName','Times New Roman')
h=legend('Biomasa (g/L)','Sustrato (g/L)','cido Clavulnico (mg/L)'), box off;
set(h,'FontName','Times New
Roman','FontSize',18,'FontAngle','Oblique','box','off','Location','NorthWest')
hold off
%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
%% Ajuste usando Mnimos cuadrados no lineales(Levenberg-Marquardt)
% % Resolver por el mtodo de Levenberg-Marquardt en MCNL
% % Parmetros utilizados en las ecuaciones
b0=[MiuMax Ks Yxs Yxp Alfa kd];
k = length(b0); % Nmero de parmetros
b0 = (b0(:).')'; % Asegrese de que sea un vector columna
%Integre las ecuaciones
141

dy=@(t,y,k)[k(1)*(y(2)/(k(2)+y(2)))*y(1)-k(6)*y(1);(-
(1/k(3))*(k(1)*(y(2)/(k(2)+y(2)))*y(1)));((k(1)/k(4))*(y(2)/(k(2)+y(2)))*y(1)+k(5)*y(1))];
v= 3; % Nmero de variables dependientes (y1, y2 e y3)o de nmero de columnas del
vector y
if size(t) ~= size(y)
error('t e y no tienen el mismo tamao.')
break
end
sy = size(y);
if sy(2) ~= v
error('Nmero invlido de variables dependientes.')
break
end
A=[tsim, ysim];
q = length(A);
B=size(y);
n=B(:,1);
t0=0;
tmax=124.5;
% Chequee las condiciones lmite
if q > 0
ny0 = length(y0);
if ny0 ~= v
error('Nmero invlido de condicion(es)lmite(s).')
break
end
end
%% El mtodo de Marquardt
% "nargin" en el programa se refiere al nmero de argumentos de entrada
% de funcin.
% "isempty" es una matriz verdadera vaca de valores de tolerancia (tol) % donde este
parmetro tiene valores definidos debajo de la funcin.
% "trace" es una funcin que suma los elementos de la diagonal de una
% matriz.
if nargin < 9 | isempty(tol)
tolb = 1e-3;
tolw = 1e-3;
tolphi = 1e-6;
else
tolb = tol(1);
tolw = tol(2);
tolphi = 1e-6;
end
if nargin < 10 | isempty(trace)
trace = 0;
142

end
headerw = ' Variable Weight';
headerb = ' Parameter Value';
%% Calculando los pesos o los ponderados y Nmero de variables dependientes
% "sort" significa ordenar; especficamente esta funcin ordena en forma
% ascendente, devuelve un ndice de matriz "loc", si t es una matriz de mxn
% entonces xx(1:n,v)=t(loc), para j=1:n, xx(:,j)=t(loc(:,j),j).
if v > 1
% Clasificacin de datos
[xx(1:n,v),loc] = sort(t(1:n,v));
yy(1:n,v) = y(loc,v);
tmpy = yy(1,v);
ss(v) = 0;
ns(v) = 0;
% Bsqueda de datos repetidos
for nn = 2:n
if xx(nn-1,v) == xx(nn,v)
tmpy = [tmpy; yy(nn,v)];
else
if length(tmpy) ~= 1
ly = length(tmpy);
ss(v) = ss(v) + (ly-1)*std(tmpy)^2;
ns(v) = ns(v) + (ly-1);
end
end
if nn == n & length(tmpy) ~= 1
ly = length(tmpy);
ss(v) = ss(v) + (ly-1)*std(tmpy)^2;
ns(v) = ns(v) + (ly-1);
end
if xx(nn-1,v) ~= xx(nn,v)
tmpy = yy(nn,v);
end
end
% Estimando la varianza para cada variable
if ns(v) == 0
s2(v) = 1;
else
s2(v) = ss(v) / ns(v);
end
end
w1 = sum(n)./s2(v) / sum(n./s2(v)); % Vector de pesos
maxiterw = 200; % Mximo nmero de iteraciones en pesos
iterw = 0;
w0 = w1 + 2*tolw;
143

maxiterb = 1000; % Mximo nmero de iteraciones en parmetros(b)
b = b0;
unit = eye(k); % Matriz unidad
xmax = max(max(t));
% Inicio de iteracin sobre ponderados o pesos
while max(abs(w1-w0)) > tolw & iterw < maxiterw
iterw = iterw + 1;
w0 = w1;
iterb = 0;
delb = 2*tolb;
lambda = 1000; % Valores iniciales para lambda
% Clculo inicial de la suma de cuadrados residuales (recuerde que el
% tiempo tiene que cuadrarse de tal manera que el paso dado sea el mismo
% numero de filas o de valores de las variables
for m = 1:q
[xc,yc] = ode23(dy,[t0:20:tmax],y0,[],b);
for m = q+1:v
yc(1:n(m),m) = spline(xc,yc(:,m),x(1:n(m),m));
end
end
e = y - yc; % Residuales
for m = 1:v
% Suma del cuadrado de los residuales para cada variable dependiente
ssr(m) = e(1:n,m)'*e(1:n,m);
end
phi = sum(w1.*ssr); % Ponderado de la suma de cuadrado residual
deltaphi = 2*tolphi;
if trace
if v > 1
fprintf('\n\n Iteration on weights = %3d',iterw)
disp(' '), disp(headerw)
for m = 1:v
fprintf(' %2d %10.4e\n',m,w(m))
end
end
fprintf('\n\n Starting values\n')
disp(headerb)
for m = 1:k
fprintf(' %3d %10.4e\n',m,b(m))
end
fprintf(' Sum of squares = %10.4e\n',phi)
if method == 1
fprintf(' Lambda = %10.4e\n',lambda)
end
end
144

end
% Inicio de iteracin sobre los parmetros
p = 0;
while max(abs(delb))>tolb & abs(deltaphi)>tolphi & iterb<maxiterb
iterb = iterb + 1;
b0 = b;
yc0 = yc;
phi0 = phi;
% Construyendo la matriz Jacobiana
for mk = 1:k
% Conjunto db para derivacin
if b(mk) ~= 0
db = abs(b(mk)) / 100;
else
db = 1 / 100;
end
b(mk) = b(mk) + db;
if v > p
[xx,yy] = ode45(dy,Ts,y0,[],b);
for mq = p+1:v
yp = spline(xx,yy(:,mq),t(1:n,mq));
jacob(1:n,mk,mq) = (yp - yc(1:n,mq)) / db;
end
end
b(mk) = b(mk) - db;
end
% Calculando la correccin de parmetros
A = zeros(k);
B = zeros(k,1);
for m = 1:v
J = jacob(1:n,:,m);
A = A + w1 * J' * J;
B = B + w1 * J' * (y(1:n,m) - yc(1:n,m));
end
% Para hacer la RNL(Regresin no lineal) por el mtodo de L-Marquardt
deltab = inv(A + lambda*unit) * B;
% Si se fuera a utilizar el mtodo de Gauss-Newton se hara as:
%% deltab = inv(A) * B;
b = b0 + deltab;
% El nuevo vector de parmetros
% Calculando la nueva suma de residuales cuadrados
if v > p
[xx,yy] = ode45(dy,[t0:11.5:tmax],y0,[],b);
for m = p+1:v
yc(1:n,m) = spline(xx,yy(:,m),t(1:n,m));
145

end
end
e = y - yc; % los residuales
for m = 1:v
% Suma de cuadrados residuales para cada variable dependiente
ssr(m) = e(:,m)'*e(:,m);
end
phi = sum(w1.*ssr); % Ponderado o peso de la suma de los cuadrados residuales
% Incremento relativo de los parmetros
for nk = 1:k
if b(nk) ~= 0
delb(nk) = (b(nk) - b0(nk)) / b(nk);
else
delb(nk) = (b(nk) - b0(nk));
end
end
% Ajustando lambda
deltaphi = phi - phi0;
if trace ~= 2
if deltaphi < 0
lambda = lambda/4;
else
lambda = lambda*2;
b = b0;
yc = yc0;
phi = phi0;
delb = 2*tolb;
end
end
if trace
fprintf('\n Iteration on parameters = %3d\n',iterb)
disp(headerb)
for m = 1:k
fprintf(' %3d %10.4e\n',m,b(m))
end
fprintf(' Sum of squares = %10.4e\n',phi)
fprintf(' Lambda = %10.4e\n',lambda)
end
% Iteracin sobre los parmetros
s2 = ssr./(n-k/v); % Nueva varianzas
w = sum(n)./s2 / sum(n./s2); % Nuevos pesos
if iterb >= maxiterb
warning('Warning : El mximo de iteraciones sobre los parmetros se ha alacanzado.')
end
end
146

% Iteracin sobre pesos
if iterw >= maxiterw
warning('Warning : El mximo de iteraciones sobre pesos se ha alcanzado.')
end
%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
%% function [stdb, CL] = statistics(b, n, x, y, yc, w, A, a, OUTfile)
%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
% Propiedades estadsticas de ajuste de parmetros.
% [STDB,CL]=STATISTICS(B,N,Y,YC,W,JTJ,A,'F') ejecuta un anlisis estadstico
% sobre ajuste de parmetros donde:
% STDB = Es el vector de la desviacin estndar de los parmetros
% CL = es la matriz de lmites de confianza de la variable cuya primera
% columna es el lmite de confianza de menor valor y la segunda columna es el lmite de %
% confianza de mayor valor de los parmetros.
% B = Vector de ajuste de parmetros.
% N = Vector de nmero de puntos experimentales de cada variable dependiente.
% X es el vector/matriz de variables independientes correspondientes a los elementos de Y.
% Y puede ser un vector columna (regresin simple)o una matriz (regresin mltiple) % %
% cuyas columnas son las variables dependientes observadas. Cada columna representa una
% variable dependiente.
% YC = Matriz de variables dependientes calculadas.
% W = Vector de factores de peso o ponderados.
% JTJ = Suma{wj*jacobian'*jacobian}
% a = Porcentaje de intervalo de confianza. Valor por defecto es del 95%.
% F = Nombre del archivo de salida. Si este argumento no es introducido, la funcin se %
% escribe a la salida 'NLRstatistics'.
if nargin < 8 | isempty(a)
a = 95;
end
ss = zeros(1,v);
ns = zeros(1,v);
n1 = zeros(1,v);
n2 = zeros(1,v);
nruns = zeros(1,v);
ncount = zeros(1,v);
lackfitss = zeros(1,v);
% Aportando nmero de parmetros para clculo de grados de libertad
lackfitns = -k/v * ones(1,v);

% Calculando la estadstica de los datos experimentales
disp(' ')
disp(' **********************************************************')
disp('Statistical analysis of the experimental data')
% Anlisis estadstico de los datos experimentales
disp(' **********************************************************')
147

disp(' ')
disp('Unweighted statistics') % Estadsticas sin ponderar
for nv = 1:v
fprintf('\n Variable No. %3d \n', nv)
[xx(1:n,nv),loc] = sort(t(1:n,nv));
yy(1:n,nv) = y(loc,nv);
yyc(1:n,nv) = yc(loc,nv);
tmpy = yy(1,nv);
% Buscando datos repetidos
for nn = 2:n
if xx(nn-1,nv) == xx(nn,nv)
tmpy = [tmpy; yy(nn,nv)];
else
ly = length(tmpy);
if ly ~= 1
ss(nv) = ss(nv) + (ly-1)*std(tmpy)^2;
ns(nv) = ns(nv) + (ly-1);
end
ncount(nv) = ncount(nv) + 1;
resid(ncount(nv),nv) = mean(tmpy)-yyc(nn-1,nv);
lackfitss(nv) = lackfitss(nv)+ ly*(mean(tmpy)-yyc(nn-1,nv))^2;
lackfitns(nv) = lackfitns(nv)+ 1;
% Contando residuales positivos y negativos
if resid(ncount(nv),nv) == 0
resid(ncount(nv),nv) = 1;
end
if resid(ncount(nv),nv) > 0.0
n1(nv) = n1(nv) + 1;
else
n2(nv) = n2(nv) + 1;
end
end
ly = length(tmpy);
if nn == n & ly ~= 1
ss(nv) = ss(nv) + (ly-1)*std(tmpy)^2;
ns(nv) = ns(nv) + (ly-1);
ncount(nv) = ncount(nv) + 1;
resid(ncount(nv),nv) = mean(tmpy)-yyc(nn-1,nv);
lackfitss(nv) = lackfitss(nv)+ ly*(mean(tmpy)-yyc(nn-1,nv))^2;
lackfitns(nv) = lackfitns(nv)+ 1;
% Contando residuales positivos y negativos
if resid(ncount(nv),nv) == 0
resid(ncount(nv),nv) = 1;
end
if resid(ncount(nv),nv) > 0.0
148

n1(nv) = n1(nv) + 1;
else
n2(nv) = n2(nv) + 1;
end
end
if xx(nn-1,nv) ~= xx(nn,nv)
tmpy = yy(nn,nv);
end
end
fprintf(' Total points %3d \n',n)
fprintf(' Degrees of freedom %3d \n',ns(nv))
fprintf(' Sum of squares %10.4g\n',ss(nv))
% Estimando la varianza de los datos para cada variable
if ns == 0
s2(nv) = 1;
else
s2(nv) = ss(nv) / ns(nv);
end
fprintf(' Variance %10.4g\n',s2(nv))
fprintf(' Standard deviation %10.4g\n',sqrt(s2(nv)))
end
% Estimando el peso o ponderado estadstico de los datos
totalpoints = sum(n);
totaldf = sum(ns);
weightedss = sum(w1.*ss);
weighteds2 = weightedss/totaldf;
disp(' '),disp(' Weighted statistics'),disp(' ')
fprintf(' Total points %3d \n',totalpoints)
fprintf(' Total degrees of freedom %3d \n',totaldf)
fprintf(' Weighted sum of squares%10.4g\n',weightedss)
fprintf(' Weighted variance %10.4g\n',weighteds2)
fprintf(' Weighted stand. dev. %10.4g\n',sqrt(weighteds2))
% Suma de los cuadrados debido a la falta de ajuste
lackfitphi = sum(w1.*lackfitss);
% Suma ponderado del cuadrado de los residuales
lackfitdf = sum(lackfitns);
lackfits2 = lackfitphi/lackfitdf;
% Suma de los cuadrados residuales de cada variable dependiente
for m = 1:v
ssr(m) = e(:,m)'*e(:,m);
end
dfvar = n - k/v; % Grados de libertad para cada variable
s2var = ssr./dfvar; % Varianza para cada variable ajustada
phi = sum(w.*ssr); % Suma ponderada del cuadrado de los residuales
df = sum(n) - k; % Grados de libertad para todas las variables
149

s2 = phi / df; % Varianza ponderada para todas las variables
VarCovar = s2*inv(A); % Matriz de varianza - covarianza
for m = 1:k % Matriz de coeficientes de correlacin
for mm = 1:k
CorCoeff(m,mm)=VarCovar(m,mm)/sqrt(VarCovar(m,m)*VarCovar(mm,mm));
end
end
stdb = sqrt(s2 * diag(inv(A)));% Desviacin estndar de los parmetros
tb = b./stdb; % t-calculada para los parmetros
% Calculando el intervalo de confianza
alpha = 1 - a/100;
infinity = 30;
t0 = 1;
t1 = 2;
% Distribucin de la t-Student
pi=3.14159265358979323846;
p1 = 1/sqrt(df*pi) * gamma((df+1)/2)/gamma(df/2) * ...
(1 + t.^2/df).^(-(df + 1)/2);
% Vector de lmites de confianza de los parmetros
CL = [b-t1*stdb , b+t1*stdb];
for m = 1:v
t0 = 1;
t = 2;
CLvar(m) = t*sqrt(s2var(m));
end
% Escribiendo o reporte de los resultados
disp(' ')
disp(' **********************************************************')
disp(' Statistical analysis of the regression')
disp(' **********************************************************')
disp(' ')
disp(' No. Parameter Standard 95% Confidence interval')
disp(' deviation for the parameters')
disp(' lower value upper value')
for m = 1:k
fprintf(' %2d %10.4e %10.4e %10.4e %10.4e\n',...
m,b(m),stdb(m),CL(m,:))
end
fprintf('\n Degrees of freedom = %2d\n', df)
fprintf('\n Total (weighted) sum of squared residuals = %10.4g\n', phi)
fprintf('\n Combined (weighted) residual variance (s^2) = %10.4g\n',s2)
fprintf('\n Significance tests\n\n')
disp(' No. Parameter t-calculated Is parameter significantly')
disp(' different from zero?')
for m = 1:k
150

fprintf(' %2d %10.4e %10.4e ',m,b(m),tb(m) )
if abs(tb(m)) >= t
fprintf(' Yes\n')
else
fprintf(' No\n')
end
end
disp(' '),disp(' Confidence limits of regressed variables')
disp(' ')
disp(' Measured Degrees of Residual 95% Confidence limit')
disp(' variable freedom variance for each measured variable')
for m=1:v
fprintf(' %2d %2d %10.4e %10.4e\n',m,dfvar,...
s2var(m),CLvar(m))
end
disp(' ')
disp(' Covariance analysis')
disp(' ')
disp(' Variance-covariance matrix: s^2*Inverse(J transpose J)')
for m = 1:k
fprintf('\n ')
for mm = 1:k
fprintf(' %10.4e ', VarCovar(m,mm))
end
end
disp(' '), disp(' ')
disp(' Matrix of correlation coefficients')
for m = 1:k
fprintf('\n ')
for mm = 1:k
fprintf(' %10.4g ', CorCoeff(m,mm))
end
end
disp(' '), disp(' ')
disp(' Analysis of variance')
disp(' ')
disp(' Source of Sum of squares Degrees of Variance')
disp(' variance freedom')
disp(' ')
fprintf(' Lack of fit %10.4e %2d %10.4e\n',...
lackfitphi, lackfitdf, lackfits2 )
disp(' ')
fprintf(' Experimental error %10.4e %2d %10.4e\n',...
weightedss, totaldf, weighteds2)
disp(' ')
151

fprintf(' Total %10.4e %2d %10.4e\n',...
phi, df, s2 )
% Realizar prueba de aletoriedad
disp(' ')
disp(' Randomness test')
for nv = 1:v
% Conteo del nmero de corridas
for nn = 1:ncount(nv)-1
if resid(nn,nv)/resid(nn+1,nv) < 0
nruns(nv)= nruns(nv) + 1;
end
end
B = 2*n1(nv)*n2(nv);
C = n1(nv) + n2(nv);
rmean (nv) = B/C + 1;
sigma = sqrt(B*(B-C)/(C^2*(C-1)));
Z = (nruns(nv)-rmean(nv))/sigma;
disp(' ')
fprintf(' Variable %3d\n', nv)
fprintf(' Number of positive residuals %3d\n', n1(nv))
fprintf(' Number of negative residuals %3d\n', n2(nv))
fprintf(' Number of runs (changes of sign) %3d\n', nruns(nv))
fprintf(' Z = %10.4g\n', Z)
disp(' ')
if abs(Z) > 1.96
disp(' Not random at 95% level of confidence')
else
disp(' Random at 95% level of confidence')
end
end
disp(' ')
disp(' **********************************************************')
disp(' End of statistical analysis ')
disp(' **********************************************************')
disp(' ')
disp(' **********************************************************')
disp(' The results of the statistical analysis have been stored ')
disp(' in the output file you specified. This file is located ')
disp(' in the default directory you have operated from. You may ')
disp(' open and view this file using any editor. ')
disp(' **********************************************************')
disp(' ')
% Propiedades Estadsticas
%[sd, cl] = statistics(b, n, x, y, yc, w, JTJ, 95, fout);

152

% Mostrando los resultados finales
disp(' ')
disp(' **********************************************************')
disp(' Final Results')
disp(' **********************************************************')
disp(' ')
disp(' No. Parameter Standard 95% Confidence interval ')
disp(' deviation for the parameters ')
disp(' lower value upper value')
for m = 1:length(b)
fprintf(' %2d %10.4e %10.4e %10.4e %10.4e\n',...
m,b(m),stdb(m),CL(m,:))
end
disp(' ')
disp(' **********************************************************')
153

ANEXO No.2: Produccin cientfica derivada del trabajo
de investigacin

a. Modelo computacional (relacionado en el anexo No.1)
b. Trabajos en eventos aprobados
Anlisis de flujo metbolico en la produccin de cido clavulnico a partir de la
fermentacin con Streptomyces clavuligerus. Primer Congreso Colombiano de
Biologa Computacional. Universidad de los Andes. Bogot, 23-25 de Marzo de
2011.
Estudio del efecto de la variacin de la concentracin de fosfato y glicerol sobre la
produccin de Biomasa de Streptomyces clavuligerus. XIV Congreso Nacional de
Biotecnologa y Bioingeniera. Sociedad Mexicana de Biotecnologa y
Bioingeniera. Juriquilla, Quertaro, 19-24 de Junio de 2011.
Modelado de la cintica de produccin de cido clavulnico empleando un medio
complejo. Congreso Iberoamericano de Biotecnologa y Biodiversidad. Generacin
BIO. Manizales, Colombia, 20-23 de Septiembre de 2011.
Determination of kinetic parameters for the production of Clavulanic acid antibiotic
in culture of Streptomyces clavuligerus using as source nitrogen the Soye Flour.
12
th
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Growing limited Asparagine effects for Clavulanic acid Biosynthesis with the aid of
metabolic Flux analysis. XV Congreso Nacional de Biotecnologa y Bioingeniera
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Sociedad Mexicana de Biotecnologa y Bioingeniera. Cancun, Mexico. 23-28 de
Junio de 2013.
Modeling the production of Clavulanic acid from Streptomyces clavuligerus . XV
Congreso Nacional de Biotecnologa y Bioingeniera and 12
th
International
Symposium on Genetics of Industrial Microorganisms. Sociedad Mexicana de
Biotecnologa y Bioingeniera. Cancun, Mexico. 23-28 de Junio de 2013.
154

Phenomenological Model of the Clavulanic acid production, inhibitor of the
enzymes -lactamases using a method of multiple regression analysis nonlinear.
VIII Panamerican Health Care Exchanges Conference (PAHCE-2013) y el V
Congreso Colombiano de Bioingeniera e Ingeniera Biomdica (V-CCBIO-
2013).Medelln Colombia. 29 de Abril-4 de Mayo de 2013.
c. Artculos en revista
Produccin de cido Clavulnico por fermentacin de Streptomyces clavuligerus:
Evaluacin de diferentes medios de cultivo y modelado matemtico. Dyna, ao 79,
Nro.175, pp.158-165, Medelln, Octubre, 2012. ISSN 0012-7353.
d. Artculos en revisin
A combined sensitivity and metabolic flux analysis unravel the importance of amino
acid feeding strategies on Clavulanic acid biosynthesis in Streptomyces
clavuligerus. Biotechnology letters. Springer.

Streptomyces Clavuligerus

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medio Gly-Asn en lote. .............. 116

: Caudal msico que entra al reactor (g/L)

: Caudal msico que sale del reactor (g/L)

: Velocidad mxima especfica de crecimiento del microorganismo en el medio con

: Velocidad mxima especfica de crecimiento del microorganismo en el medio con

es el caudal msico que entra al reactor,

es el caudal msico que sale del reactor,

= , pero generalmente la corriente de alimentacin de un cultivo continuo es

= = , la formacin de biomasa se representa

= y el caudal msico de salida

= = , el sustrato se consume no se genera, por lo tanto 0 =

medio Gly-Asn en lote.

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