MEMORIA EJECUTIVA DEL ESTUDIO CARACTERIZACION GENETICA DE CINCO ESPECIES ICTICAS DEL RIO SINU PROYECTO HIDROELCTRICO URRA

INVESTIGADOR PRINCIPAL: CONSUELO BURBANO MONTENEGRO COINVESTIGADOR: WILLIAN USAQUEN

1. IMPORTANCIA DEL ESTUDIO GENETICO La memoria ejecutiva de la Caracterizacin gentica de cinco especies cticas del ro Sin que a continuacin se presenta, tiene la intencin de oficializar sus principales resultados ante el INCODER como entidad encargada de orientar el manejo tcnico en las estaciones pisccolas del pas y de aplicar las medidas de manejo y conservacin para el recurso pesquero, de tal forma que las recomendaciones arrojadas sean de fcil comprensin y pronta aplicabilidad. El soporte tcnico y metodolgico se encuentra en el documento final del estudio presentado por la Universidad Nacional de Colombia en junio de 2003, el cual se encuentra disponible en las oficinas de URRA S.A.E.SP. para las entidades interesadas en profundizar en los resultados obtenidos. El estudio gentico contratado por URRA S.A. E.S.P. con la Universidad Nacional de Colombia es fundamental para orientar el manejo pesquero del ro Sin y ms concretamente las acciones de repoblamiento, operacin de los estanques nodriza, reglamentacin pesquera y fomento pisccola contenidas dentro del Plan de Ordenamiento Pesquero de la Cuenca del ro Sin. Para lograr mejores efectos y beneficio futuros es preciso acoger los resultados del estudio gentico de las principales especies cticas para las pesqueras del ro Sin. La gentica juega un papel cada vez ms importante en la conservacin de especies por ser una herramienta que permite obtener un conocimiento preciso de las poblaciones amenazadas y la toma de decisiones adecuadas para su manejo. La utilizacin de marcadores moleculares como los microsatlites en gentica de poblaciones es ventajosa, ya que se pueden responder preguntas que antes requeran muestreos y observaciones extensas (Murray, 1996). El objetivo general del estudio es la Caracterizacin gentica con marcadores moleculares de las poblaciones de cinco especies cticas del ro Sin Brycon moorei (Dorada), Prochilodus magdalenae (Bocachico), Caquetaia kraussi (Mojarra amarilla), Sorubim cuspicaudus (bagre blanco) y Pimelodus clarias (Barbul), especficamente se buscaba determinar la variabilidad gentica con DNA microsatlite entre y dentro de las poblaciones de las especies mencionadas y especificar estrategias de manejo de las poblaciones de estas especies, como punto de referencia para el manejo pesquero de la regin. 2. SITIOS EVALUADOS

Se evaluaron cuatro poblaciones de granjas pisccolas (CINPIC, CVS, PezSin, PezCol) y dos poblaciones silvestres (Cinaga Grande de Lorica y embalse) A continuacin se presenta una tabla con las localidades donde el muestreo fue exitoso para cada especie: Tabla No. 1. SITIOS EVALUADOS GRANJAS PISCICOLAS CINPIC EXITOSO CVS PEZSINU EXITOSO EXITOSO POBLACIONES SILVESTRES

DORADA BOCACHICO

MOJARRA AMARILLA BLANQUILLO BARBUL

PEZCOL EXITOSO Embalse, Cinaga Grande de Lorica EXITOSO EXITOSO EXITOSO EXITOSO 6 SILVESTRES EN EL ALTO Y BAJO SINU embalse, Tierralta, Lorica, Sicar, Betanc, Bao NO SE EXITOSO NO SE EXITOSO Embalse, Cinagas de MUESTRE MUESTREO Betanc, Bao y Lorica O EXITOSO EXITOSO EXITOSO Embalse, Tierralta, Betanc, Lorica, Cinaga de Bao, Sicar EXITOSO (no Embalse, Tierralta se reproduce, (Santana), Lorica. su presencia Betanc es accidental

3. BREVE EXPLICACION METODOLOGICA La extraccin de DNA se lleva a cabo con el kit comercial: Wizard Genomic DNA purification Kit (Promega) y se realizo una estandarizacin del protocolo desarrollado para el Kit teniendo en cuenta las recomendaciones del manual PROMEGA (1996) Protocols and applications Guide. Para la caracterizacin gentica de las especies cticas estudiadas se realizaron los siguientes anlisis: Anlisis Gentico de frecuencias: corresponde a la primera aproximacin para caracterizar genticamente una poblacin ya que los alelos y su frecuencia en la poblacin son los que la identifican como tal.

Las variables con las que se realiza el anlisis de la poblacin son las frecuencias de los alelos encontradas en cada localidad y para la poblacin total. Las diferencias entre los alelos se determinaron a partir de las diferencias de tamao entre ellos, que se originan por el nmero de repeticiones distintas en cada uno.

Desequilibrio de ligamiento: se evalan por pares los loci utilizando tablas de contigencia, las cuales ponen a prueba la independencia entre las distribuciones por pares de loci para cada localidad de muestreo (Tablas de contingencia, GENEPOP, Raymond & Rousset, 1995). Heterocigosidad y diversidad allica: es una medida sencilla de la variacin gentica en una poblacin que corresponde a la cantidad de heterocigotos observados. Sin embargo una medida ms apropiada la confiere la heterocigocidad media, mejor conocida como diversidad gnica, la cual se calcula a partir de la suma de cuadrados de la frecuencias alelicas. Equilibrio de Hardy-Weinberg: permite probar la hiptesis de que en la poblacin esta ocurriendo cruzamiento al azar, el mtodo utilizado es de Guo y Thompson (1992). Flujo gnico: mide el movimiento de genes dentro de una poblacin; incluye todos los movimientos de gametos, propgalos e individuos que sean efectivos en cambiar la distribucin espacial de los genes. Este parmetro complementa la informacin sobre el grado de aislamiento y homogeneidad de la poblacin. Cuellos de Botella: Luikart y colaboradores (1998), demostraron mediante simulaciones por computador y el uso de datos empricos que los cuellos de botella disminuyen ms la frecuencia de los alelos menos abundantes (menor 0.1) que la frecuencia de los intermedios. Esta distorsin es transitoria y por lo tanto slo puede detectar durante algunas generaciones. Los autores proponen un mtodo grfico para detectar los cuellos de botella.

Para cada una de las especies se recomienda un manejo de padrotes basado en los resultados de los anlisis mencionados anteriormente. 4. RESULTADOS POR ESPECIE 4.1. CARACTERISTICAS Y RECOMENDACIONES PARA EL MANEJO GENETICO DE DORADA (Brycon moorei) Para el estudio de esta especie se colectaron 295 muestras, de las cuales fue necesario descartar 23 por problemas de almacenamiento durante el transporte hasta el laboratorio, tomadas en poblaciones silvestres y las estaciones pisccolas sealadas anteriormente. A continuacin se presenta una sntesis de la situacin de los padrotes encontrados en las granjas pisccolas y en las reas silvestres mencionadas en la Tabla No 1. Tabla 2. Caractersticas de los padrotes y recomendaciones tcnicas para el manejo y conservacin de Dorada (Brycon moorei) PEZSINU CINPIC CVS PEZCOL

CARACTERISTICAS Posee un padrote procedente del medio natural y otro de la produccin de la granja. Los padrotes del medio natural provienen de Cinaga de Lorica y el otro se obtuvo en CVS desde hace ms de cinco aos.

DE LOS PADROTES Posee un lote de 70 El lote de dorada En esta granja individuos de Dorada del que se pisccola se realiza un durante 2 a 3 aos antes obtienen los recambio de padrotes de realizar el recambio padrotes para la de dorada cada ao de padrotes. Algunos de reproduccin los padrotes vienen del existe desde julio medio natural, pero no de 2000 y son se conoce con exactitud provenientes del la localidad de donde CINPIC. provienen. Se han presentado alevinos con malformaciones SUGERENCIAS PARA EL MANEJO EN GRANJAS PISCICOLAS En la pisccola La granja CINPIC exhibe La granja CVS En la granja Pezcol la Pezsin el nmero la menor variabilidad, tiene el mayor proporcin de de muestras es bajo, adems se han nmero de alelos heterocigotos es baja sin embargo la encontrado alevinos con privados, lo que a pesar de que se variabilidad es malformaciones que hace de este lote trata del nmero parecida a la indican que la estrategia un recurso valioso muestral ms grande encontrada en CVS, utilizada esta para la poblacin (n=64). Esto indica esto indica que la disminuyendo la de dorada del ro que la variabilidad es estrategia utilizada variabilidad de los Sin. Por lo tanto reducida y que la (con un padrote del individuos. se recomienda estrategia de medio natural) es la utilizar individuos reproduccin no es la adecuada y por lo Se sugiere que obtenga de esta pisccola adecuada. tanto debe ser padrotes directamente con el fin de adoptada por las del embalse o de las asegurar la El estudio sugiere otras granjas granjas pisccolas recuperacin de aumentar la pisccolas. Pezsin y CVS. dichos alelos. variabilidad Se sugiere obteniendo padrotes obtener padrotes directamente del directamente del medio natural medio natural (embalse y Lorica) para evitar y/o de las granjas disminuir la CVS y PezSin variabilidad existente, En todos los casos es recomendable renovar los individuos reproductores de las pisccolas con mayor frecuencia y no realizar retrocruces, es decir no renovar el lote a partir de alevinos producidos en la misma pisccola. Para todas es ideal tomar padrotes de embalse de Urra o de la Cinaga de Lorica, es adems importante llevar registros precisos de la proveniencia de los padrotes y los recambios. El estudio gentico de la poblacin de Dorada en el embalse en cuanto a equilibrio y variabilidad es mejor que lo encontrado en las granjas pisccolas, aunque hay deficiencia de heterocigotos, por esta razn es importante utilizar los individuos del

embalse o de las poblaciones aguas arriba de la presa como padrotes para la reproduccin en cautiverio y realizar repoblamiento con descendientes de esta localidad, esto se ratifica por los resultados de equilibrio de Hardy-Weinberg donde se muestran que tanto la poblacin total muestreada como las localidades de muestreo no se encuentran en equilibrio de por deficiencia de heterocigotos, la razn del desequilibrio es la endogamia. El estudio revela que el flujo gentico de la poblacin de Dorada en el ro Sin es alto y las localidades de muestreo no estn aisladas, que adems no se detecto cuello de botella reciente en la poblacin total muestreada de Dorada en el ro Sin ni en ninguna de las localidades de muestreo. 4.2. Bocachico (Prochilodus magdalenae): El periodo de muestreo fue de 1 ao, se colectaron 535 muestras de individuos de P.magdalenae, en diez localidades sealadas en la tabla No.1. El estudio reporta ms de 30 muestras por localidad, con excepcin de la Cinaga de Bao donde se colectaron 20 debido a la escasez de esta especie en la zona, paralelamente hubo algunas dificultades de muestreo en algunas pocas en las cinagas de Sicar y Betanci. En total se obtuvieron 314 muestras de individuos adultos provenientes de 6 localidades silvestres y 221 muestras de individuos provenientes de estaciones pisccolas (Pezsin, Unicor y CVS). La gran mayora de estas muestras fueron de alevinos pertenecientes a las cohortes de agosto de 2001 y marzo de 2002 El anlisis de frecuencias alelicas nos muestra que en realidad las poblaciones son caracterizadas por unos pocos alelos del total reportado para cada locus. Este hecho aunado a los hallazgos en la desviacin del equilibrio H-W debido a un dficit de heterocigotos indica que esta poblacin ha sufrido una perdida de variabilidad gentica, principalmente la poblacin de Cinaga de Bao, esto pudo ser causado por un cuello de botella reciente, por lo menos en la mayora de las poblaciones silvestres estudiadas. En el caso de Bao, la poblacin presenta nicamente 3 de los 17 alelos con una frecuencia alta, con relacin a las dems poblaciones, el alelo 1, 2 y 10, esto puede indicar que la poblacin este fijando estos alelos ya sea por un proceso de deriva gentica o cuello de botella. De manera similar Pezcol presenta una alta frecuencia en el alelo 3 destacndose un pico que la diferencia de otras poblaciones, esta situacin gentica donde pocos alelos tienen alta frecuencia y ausencia de muchos alelos indica que los alelos de estas poblaciones se pueden estar fijando debido a un proceso de endogamia donde es posible que se hayan realizado cruces entre familiares o individuos que tienen ancestros comunes muy cercanos (Hartl & Clark, 1997). En las poblaciones en cautiverio, Unicor se destaca por presentar un alelo de alta frecuencia que otras poblaciones no poseen, es el importante ya que pueden ser una fuente de variabilidad gentica y de aporte gentico a la poblacin, sin que esto

signifique la perdida de otros alelos, puesto que su comportamiento en general es similar a la de otras poblaciones, en cuento a la distribucin de frecuencias alelicas. Los valores moderados de diferenciacin gentica entre poblaciones pueden indicar que a pesar de las poblaciones son entidades genticamente diferenciables entre s, puede existir un flujo gentico flexible entre ellas. El Plan de manejo recomendado para la especie, seala lo siguiente: Los meses donde existe mayor diversidad gnica en las poblaciones silvestres es julio agosto y el periodo de subienda, por lo tanto es preciso adoptar medidas de manejo, tales como vedas. Dado que el Bocachico se encuentra en los lmites de sostenibilidad recomendados, y que muchas poblaciones dependen de los repoblamientos para la recuperacin y conservacin de su variabilidad gentica, como es el caso de embalse, Betanc y Bao, se hace necesario disear una estrategia de cruces adecuada que involucre las estaciones pisccolas de la regin y las poblaciones silvestres.

En primer lugar, es importante tener en cuenta que el criterio ms utilizado para evaluar el estado gentico de las poblaciones es la diversidad gentica, puesto que esta se relaciona con la viabilidad de los individuos en el medio. Entre ms variabilidad posea una poblacin, mayores sern sus posibilidades de supervivencia, sobre todo en respuesta a cambios ambientales. La diversidad gentica de una poblacin depende de la heterocigocidad inicial, del nmero efectivo de la poblacin y del nmero de generaciones que transcurran. De este modo por medio de una simulacin por computador, se realizan una serie de cruces entre individuos escogidos al azar de todas las poblaciones muestreadas en este estudio. El criterio para determinar cuales son los cruces ms favorables son tres estimadores: la diversidad gentica (que debe ser alta), la heterocigocidad observada (Ho), la cual debe aumentar con respecto alas poblaciones originales y el ndice de Endogamia (Fis) que debe disminuir acercndose a cero. De lo anterior los cruces favorables para el repoblamiento son los siguientes: Lorica X Betanc Lorica X Embalse Lorica X Pezsin Lorica X Tierralta Lorica X Sicar Betanc X Pezcol Tierralta X Unicor

Tierralta X Pezsin Unicor X Unicor

Betanc X embalse Betanc X Sicar Embalse X Pezsin Embalse X Sicar Los cruces que se deben evitar para el repoblamiento son los siguientes: CVS X CVS Lorica X Bao Pezcol X Pezcol Tierralta X Tierralta Tierralta X Bao Bao X Bao

El nico caso donde se puede continuar realizando cruces entre individuos de la misma pisccola es en Unicor; sin embargo, en esta y las otras pisccolas es necesaria una renovacin de padrotes por lo menos cada cinco generaciones y en lo posible evitar el cruce de familiares, como padres con hijos, o entre hermanos. Por su parte, en la pisccola de CVS es urgente una renovacin de padrotes y se recomienda que estos provengan del medio natural, por ejemplo Lorica y Sicar. 4.3. Caracterizacin gentica de Caquetaia kraussi (Mojarra Amarilla)

El muestreo se realiz a lo largo del ao, entre agosto 2001-julio-2002, se realizaron cuatro colecciones: la primera en agosto, posteriormente en octubre-noviembre, luego en febrero-marzo y la ltima en julio. Se tom un mnimo de 15 muestras y un mximo de 30 por cada localidad en cada muestreo, excepto para la Cinaga de Bao y las pisccolas donde se realizaron slo dos muestreos. Se trabajaron 276 individuos. La poblacin de Caquetaia presenta una baja heterocigosidad, con un valor promedio de 0,09. Hay una desviacin del equilibrio H_W por deficiencia de heterocigotos para toda la poblacin, en todos los sistemas microsatelitales y cada una de las localidades, lo cual esta relacionado con 3 fenmenos presencia de alelos nulos, endogamia y seleccin de pareja a favor de parientes cercanos.

A nivel de las poblaciones silvestres, el embalse es la localidad con mayor diversidad alelica, mientras que cinaga de Bao es de menor diversidad, entre tanto la Cinaga Grande de Lorica presenta la mayor heterocigosidad y es la localidad con el nivel mas bajo de endogamia. Las pisccolas presentan los niveles ms bajos de heterocigosidad y alta endogamia. La poblacin de Caquetaia kraussi se caracteriz por los estimados de equilibrio HardyWeinberg, subestructura poblacional y parentesco; con estos estimados se estableci la conformacin actual de la poblacin y se tienen los parmetros necesarios para dar sugerencias sobre la conservacin gentica de la especie. Caquetaia kraussi posee una buena variabilidad gentica en las zonas estudiadas, pero presenta un desequilibrio en las proporciones genotpicas, encontrndose un dficit de heterocigotos, producido por efecto de endogamia, seleccin de pareja a favor de parientes y presencia de alelos nulos. Los dos primeros factores, son caractersticos del comportamiento reproductivo de la especie, por lo que este desequilibrio no debe considerarse una condicin gentica que afecta a la Mojarra Amarilla. Por otra parte, la subestructura encontrada en la poblacin es baja y esta basada en la diferencia estimada de las proporciones genotpicas que tienen algunas localidades, como la cinaga de Bao y las pisccolas y en la presencia de alelos privados en localidades como Bao, Betanc y Lorica. Con esta consideracin debe implementarse un plan de manejo de la especie que considere estrategias que implementen la diversidad gentica de la poblacin de C. Kraussi del Sin, utilizando para ello individuos que aporten variabilidad gentica que actualmente es exclusiva de una localidad. Se sugiere entonces, capturar individuos de las localidades genticamente importantes (bao, Betanc y Lorica), genotipificarlos y aislar aquellos individuos que poseen los alelos de inters; con estos individuos se inicia el proceso de reproduccin dirigida, realizado en las piscicolas, buscando con ello incrementar el nmero de individuos que poseen los genotipos de interes. Una vez se tiene un grupo de individuos con tamao suficiente, se pueden introducir individuos en una localidad potencial receptora, como el embalse, que es la localidad de mayor tamao y que actualmente presenta las mejores condiciones de establecimiento para la especie, aunque deben ponerse a consideracin las otras localidades, de acuerdo con el seguimiento dado por el monitoreo pesquero y las posibilidades de establecimiento que tendrn los individuos introducidos. 4.4. Bagre Blanco (Sorubim cuspicaudus)

Se realizaron muestreos durante un ao (2001-2002), en los puntos estratgicos a lo largo de la Cuenca del Sin, en donde existan registros de pesca de esta especie:

embalse, Tierralta, Cinaga Betanc, Cinaga de Bao, Cinaga Grande de Lorica y Sicar. Dentro de los principales resultados se encontr lo siguiente: En las comparaciones de los haplotipos, se presentan dos tipos de estaciones; el zona media con la estacin de Tierralta y la baja con la estacin de Lorica. En la regin de Tierralta, se presenta un nmero de haplotipos de 48 loci polimorfitos de los 55 obtenidos en total. A pesar de que el nmero de ejemplares capturados es el menor (25 individuos) no se presentan haplotipos compartidos, lo que permite determinar que la zona de Tierralta an presenta una alta variabilidad haplotipica, siendo una estacin importante en los manejos de conservacin y repoblamiento basados en los datos genticos. En la estacin de Lorica, el nmero de loci polimorfitos es de 53 de los 55 loci obtenidos en total, aunque el nmero de los sitios polimorfitos es mayor que en Tierralta, en esta estacin se observa 4 individuos que compartan dos haplotipos diferentes, lo que sugiere que esta estacin pueden presentar un decrecimiento en la variabilidad haplotipica, adems de generar individuos genticamente similares, los cuales no pueden ser utilizados como padrotes para las estaciones pisccolas. Tomando las estaciones pertenecientes a la cuenca del ro, podemos concluir que a pesar que en la regin de Lorica se presentan haplotipos compartidos y que la regin de Tierralta genere menos loci polimorfitos pero ninguno compartido, la poblacin se mantiene como una sola sin evidenciar una posible subestructuracin entre las regiones baja y media del Sin. Con relacin a la heterocigosidad, el valor ms bajo se presenta en Lorica y la ms alta en la zona de Tierralta. En diversos estudios sobre heterocigosidad se ha revelado que el aumento de esta, depende del nmero de individuos en las especies naturales (Travis et al, 1996), en la zona de Tierralta la heterocigosidad observada nos indica que muchos de los peces que anteriormente migraban hacia los tributarios ms importantes del Sin, se estn concentrando en la llamada zona de veda para sus cruces y desoves, lo cual revela la importancia de la aplicacin de medidas de manejo y conservacin de esta rea (interpretacin de los argumentos de presentados en el estudio). Dentro de las estrategias de manejo propuestas por el estudio se plantea iniciar los cruces entre las regiones regiones de Tierralta y Lorica, que permitan aumentar el nmero de haplotipos diferentes en las dos regiones y disminuir algunos haplotipos compartidos que se presentan en la regin del Bajo Sin. Estos polimorfismos aumentaran las frecuencias haplotipicas entre las dos regiones y por tanto elevara los valores de heterocigosidad tanto en las regiones media como baja de la Cuenca, ya que el comportamiento migratorio del blanquillo mantiene como sitios de intercambio gentico las regiones de Tierralta y Lorica.

En conclusin, las estrategias de manejo se basaran en la utilizacin principalmente de la regiones silvestres, es decir, tomar individuos provenientes de Tierralta caracterizados por su alta variabilidad y heterocigosidad, trasladarlos hacia el Bajo

Sin que presenta la ms baja heterocigosidad y cruzar en esta zona, los individuos provenientes de las dos regiones lo que permitira generar mayor variabilidad en toda la cuenca del Sin. 4.5. Barbul (Pimelodus clarias)

Las muestras fueron tomadas de un total de 169 ejemplares de la Cuenca del ro Sin capturados entre los meses de agosto de 2001 a julio 2002. Los sitios de coleccin fueron: embalse, Tierralta, Santana, Betanc y Lorica, adems se consiguieron ejemplares en la pisccola PezSin, que aunque en esta ltima no se lleva un programa de reproduccin sistematizado, los ejemplares capturados a alevinos que llegan accidentalmente a los reservorios de la granja. Dentro de los principales resultados y anlisis se tiene lo siguiente: El DNA genmico del Barbul fue amplificado para cinco loci microsatelitales conocidos con la nomenclatura genrica Cga01, CgaO5, CgaO9 y Cga 10. El anlisis de los productos de amplificacin por la PCR revelan que estos loci son todos polimorficos con frecuencias de heterocigotos entre 0,28 para Cga 10 a o,67 encontrada en Cga O9, todos los loci utilizados resultaron ser heterocigoticos para todas las localidades. Las frecuencias de heterocigticos para estos marcadores difieren entre especies y localidad de muestreo en el ro, es as que se encontr mayor variabilidad de marcadores microsatelitales en la estacin de Lorica que la encontrada en la estacin de Tierralta y Santana. La disminucin del tamao de la poblacin en la estacin de Betanc podra estar afectando la variacin gentica representada en una disminucin de la frecuencia de heterocigotos y un aumento en la frecuencia de homocigotos, lo que podra inferir una condicin de endogamia en la zona sur del Sin.

La Empresa URRA S.A.E.S.P. hace un llamado al INCODER para que divulgue los resultados del estudio gentico a las estaciones pisccolas con sus correspondientes recomendaciones de manejo, a fin de mejorar la calidad de los alevinos utilizados en los programas de repoblamiento y fomento pisccola en inmediaciones de los principales cuerpos de agua del ro Sin.