Efecto de la aloysia triphylla (cidrn) sobre la progresin de la aterosclerosis en un modelo animal Est. Preg. Manuel Fernando Garca.

Grupo Farmacologa, Universidad del Valle. INTRODUCCIN La aterosclerosis, un trastorno inflamatorio crnico que ocasiona una progresiva obstruccin arterial, es una de las principales causas de enfermedad cardiovascular. Actualmente existe un marcado inters por los posibles agentes teraputicos que tienen un efecto directo sobre la lesin endotelial y los factores que inducen su progresin. En este sentido, algunos de los agentes fitoteraputicos ms promisorios son los flavonoides. Diferentes investigaciones han descrito su efecto protector contra los mecanismos de inflamacin relacionados con la aterognesis. Entre otros, se ha hallado una reduccin en el metabolismo de cido araquidnico y en la expresin de distintas molculas de adhesin intercelular en el endotelio. Asimismo, se ha reseado una accin reguladora sobre factores genticos asociados a la produccin de IL-1, IL-6, y TNF. Por otra parte, algunos poseen un efecto antioxidante capaz de disminuir la oxidacin de LDL y retrasar el proceso de apoptosis celular. JUSTIFICACION La Aloysia triphylla, vulgarmente conocida como Cidrn, es utilizada en diversas regiones de Colombia contra las enfermedades cardacas y la aterosclerosis, sin embargo, no hay estudios que confirmen su efectividad en la inhibicin de este proceso; sta es una planta rica en flavonoides, lo cual permite atribuirle varias propiedades, entre otras, una capacidad antioxidante sobre el colesterol y compuestos superxidos, un efecto antibitico contra H. pylori y C. albicans, y una accin protectora contra el dao gentico. Se defini como objetivo general evaluar el efecto de la A. triphylla sobre la progresin de la placa aterosclertica en un modelo animal. MATERIALES Y MTODOS Para inducir el proceso aterosclertico, 20 conejos machos raza Nueva Zelanda de 18 semanas y 2.3Kg de peso promedio recibieron durante 84 das una dieta hipercolesterolmica de 100g elaborada mediante adicin de cerebro bovino y aceite de coco a un concentrado estndar (contenido neto de 0.20% peso/peso de colesterol y 5% p/p de cidos grasos saturados). Los animales fueron distribuidos en 4 grupos as: (I) dieta con concentrado estndar, (II) dieta hipercolesterolmica + lovastatina (6mg/Kg/da en el agua de consumo), (III) dieta hipercolesterolmica + infusin de A. Triphylla (200 mg/Kg/da en el agua de consumo), y (IV) dieta hipercolesterolmica. Se tomaron niveles de colesterol total (CT), colesterol HDL (C-HDL), colesterol LDL (C-LDL), colesterol VLDL (C-VLDL) y triglicridos (TG) al principio, mitad y final del tratamiento mediante mtodo espectofomtrico. Los especimenes fueron sacrificados mediante perfusin intracardiaca, antecededida por la administracin intraperitoneal de xilazina (5mg/Kg) y ketamina (50mg/Kg). A cada conejo se le extrajo la aorta desde el cayado hasta la bifurcacin ilaca, seccionada longitudinalmente y teida con SUDAN III, previa fijacin en formaldehdo al 10% por 48 horas. El extendido aterosclertico fue calculado mediante fotografas digitales a las tnicas ntimas y anlisis por el software ImageJ, que seleccion los pxeles con caractersticas colorimtricas semejantes para transformarlos en centmetros cuadrados; se evaluaron los 10cm iniciales de cada arteria, contados desde el punto ms elevado del arco artico. Tres evaluadores enmascarados al diseo del estudio determinaron el rea de cada arteria y la extensin de la tnica ntima cubierta con placa aterosclertica. Adicionalmente, se elaboraron muestras histolgicas con HematoxilinaEosina (HE) y solucin Tricrmica de Masson para evaluar por microscopa ptica factores asociados a la progresin de la lesin aterosclertica (presencia de histiocitos, proliferacin de msculo liso y desarrollo de tejido fibroso). La severidad de la lesin y las anormalidades morfolgicas fueron determinadas por un observador enmascarado. Segmentos de corazn, rin e hgado teidos con HE fueron examinados en busca de alteraciones morfolgicas secundarias al tratamiento. Para el establecimiento de la dosis se realiz un bioensayo de citotoxicidad en Artemia Salina. Se determin la DL50 en ratones empleando la prueba lmite del procedimiento arriba abajo (Up-and-Down Procedure for Acute Oral Toxicity). Los datos fueron analizados con el programa AOT425. El material vegetal fue clasificado taxonmicamente en el Herbario Botnico la Universidad del Valle (Registro 38453). Se utilizaron hojas sin daos, que fueron secadas en un horno de flujo laminar durante 24 horas a 40C y pulverizadas mecnicamente para preparar un extracto acuoso al 10% (peso/volumen) mediante la tcnica de infusin, a 60C durante 15 minutos. Luego fue depurado utilizando un filtro de tela y

almacenado en envases plsticos cerrados a una temperatura de 0 a 4C. Para todas las pruebas se utiliz la infusin a temperatura ambiente. La informacin fue procesada en el programa estadstico GraphPad Prism (versin 4.03). Los datos de colesterol total y rea de la placa se sometieron a un ANOVA de dos vas y de una va, respectivamente. Para el diseo se consideraron los lineamientos establecidos en la Resolucin 8430 de 1993 y la Ley 84 de 1989. Este proyecto fue aprobado por el Comit de tica en Experimentacin Animal de la Facultad de Salud de la Universidad del Valle (acta 39 del 20 de abril de 2006). RESULTADOS Se encontr una CL50 crnica a las 24 horas de 0.359% peso/volumen (I.C.95%: 0.207%, 0.622%). Por otra parte, en la prueba de toxicidad oral aguda, todos los animales que recibieron una dosis nica de 4000 mg/Kg. sobrevivieron despus de 14 das con patrones fisiolgicos normales. De los 20 conejos que iniciaron el tratamiento, 2 pertenecientes a los grupos III y IV, fallecieron por causas desconocidas. Los especimenes finalizaron con un peso promedio de 2,8Kg y 30 semanas. En cuanto a los niveles de lpidos plasmticos, al final del tratamiento todos los animales con dieta hipercolesterolmica (grupos II, III y IV) tuvieron aumentos estadsticamente significativos respecto a los valores iniciales: 17.82 veces en el nivel de CT (P<0.001), 2.114 veces el C-HDL (P<0.01), 72.56 veces el CLDL (P<0.001) y 8.376 veces la relacin CT/C-HDL (P<0.001), mientras que los conejos que continuaron con dieta estndar no presentaron variaciones importantes. Al comparar los grupos se encuentra que el III (A. triphylla) sufri una variacin relativa de 8.77% frente al IV, mientras que los del grupo II (lovastatina) obtuvieron un descenso relativo de 17.60%. Estas disminuciones no son estadsticamente significativas al igual que las diferencias en los niveles de C-HDL, C-LDL, C-VLDL, TG o en la relacin CT/C-HDL. El porcentaje de lesin aterosclertica (rea lesionada/rea total de la ntima) en el grupo IV fue superior al encontrado en los grupos II y III, presentndose una diferencia de 36.98% (I.C.95%: 14.08%, 59.87%), con p<0.01, y 26.11% (I.C.95%: 1.982%, 50.25%) con p<0.05, respectivamente. Por el contrario, se apreci una diferencia de 10.86% (I.C.95%: -12.03%, 33.76%) entre los grupos III y II. Ningn animal del grupo I present placa. Microscpicamente, los grupos III y IV presentaron lesiones arteriales constituidas por abundantes histiocitos espumosos e infiltracin linfocitaria; dos de los cuatro animales del grupo IV mostraron calcificacin de la placa. Asimismo, se observa presencia de polimorfonucleares neutrfilos en la ntima de tres de ellos. A pesar de que ambos grupos desarrollaron fibrosis moderada, en dos conejos del IV sta alcanza la superficie de la placa, fenmeno que slo se encuentra en uno del grupo III. El grupo II present lesiones arteriales de poca profundidad y extensin, constituidas principalmente por histiocitos espumosos, algunos linfocitos y neutrfilos, adems de fibrosis leve, ms evidente en la tnica media. No se apreci ninguna alteracin en las arterias del grupo I. Con relacin al anlisis histolgico de rganos, se aprecia esteatosis heptica mixta en los grupos II y IV (tres animales por grupo), mientras en I y III (tres de cinco y dos de cuatro, respectivamente) prevaleci una esteatosis heptica de gota fina. Referente al rin, tres individuos del grupo II exhiben infiltracin linfocitaria de la corteza renal acompaada de epitelio tubular necrosado mientras el resto de los animales no sufri alteraciones renales o daos en el tejido cardaco. DISCUSIN La CL50 y DL50 evidencian un bajo nivel de toxicidad de la infusin de A triphylla. Se pudo comprobar que la dieta hipercolesterolmica promovi el proceso aterosclertico, ya que los especimenes de los grupos II, III y IV presentaron alteraciones propias de la enfermedad, tanto macroscpica (presencia de placa aterosclertica), como microscpicamente (clulas espumosas, proliferacin de msculo liso vascular y tejido fibroso). Lo anterior, aunado al marcado incremento de los niveles originales de colesterol, permite validar la induccin de aterosclerosis a partir de un suplemento rico en cerebro bovino. El hecho de que los niveles de colesterol del grupo II no hayan sido estadsticamente diferentes frente al control positivo (IV) podra explicarse por una posible inhibicin de la funcin de la HMGCoA reductasa secundaria a hiperlipidemia exgena, situacin que normalmente ocurre en los modelos con dietas enriquecidas con colesterol a niveles superiores al 1% peso/peso, a pesar de que para el estudio se utiliz una relacin de 0.20% p/p. Esta baja eficiencia de la lovastatina como hipolipemiante impide hacer una aseveracin referente al comportamiento de la Aloysia triphylla sobre el metabolismo lipdico, ya que el grupo III tambin present una disminucin de los niveles sricos de colesterol respecto al grupo IV.

Con relacin a la extensin de las lesiones aterosclerticas, puede observarse cmo el grupo III (A. triphylla) exhibe un dao menor que el control positivo, pero mayor a el II (lovastatina). Cuando se asocian los valores a los niveles de colesterol en una correlacin lineal, se encuentra una relacin directamente proporcional (r=0.973, p=0.149). A pesar de la falta de significancia (explicada en gran medida por los pequeos tamaos de muestra propios de un estudio exploratorio). El anlisis histolgico no mostr una disminucin en la severidad de las lesiones: la existencia de linfocitos y polimorfonucleares neutrfilos junto al endotelio, as como la fibrosis entre el msculo liso vascular, manifiestan un estado intermedio (placa de ateroma) en la progresin de la lesin en el grupo III que no dista mucho del presentado por el grupo IV (placa fibrosa). Una de las caractersticas ms documentadas de la A Triphylla es su capacidad antioxidante, por lo que el efecto protector sobre la extensin de la placa puede deberse a esta propiedad ms que por una accin especfica sobre la aterognesis. Se puede afirmar que existi una disminucin de la extensin de la placa aterosclertica asociada al consumo de A Triphylla. No obstante, otros indicadores de la severidad de la patologa aterosclertica, como son el nmero de histiocitos, la proliferacin de msculo liso y el desarrollo de tejido fibroso, no arrojan diferencias importantes como resultado de este tratamiento, por lo que se hacen necesarios estudios donde se incluya una mayor cantidad de animales y diferentes modelos para evaluar la capacidad hipolipemiante y antioxidante de la planta.