Tcnicas de confirmacin

Cristales de hemina o de Teichman

Fundamento qumico La hemoglobina, cuando es tratada con cido actico, se separa inmediatamente de las protenas y del grupo prosttico. Durante la hidrlisis la globulina se desnaturaliza. La oxidacin del fierro del grupo hem se efecta ms rpidamente en medio cido ue en medio alcalino. !i est presente un halgeno inorgnico como el cloro, se formarn cristales insolubles de cloruro de ferriprotoporfirina o hemina"

#reparacin del reacti$o a% &loruro de sodio '.( gr. b% )romuro de potasio '.( gr. c% *oduro de potasio '.( gr. d% +cido actico c.b.p. ('' ml.

#rocedimiento a% &olocar la muestra problema en el centro de una laminilla de $idrio y poner encima de ella un cubreob,etos. b% Deslizar entre lmina y lminilla por capilaridad, unas gotas del reacti$o de -eichman. c% &alentar lentamente y a ba,a temperatura la laminilla hasta e$aporacin. d% De,ar enfriar y obser$ar al microscopio.

.n caso positi$o se obser$arn cristales romboidales de color caf obscuro.

#rueba de -a/ayama 0hemocromgeno%

1undamento umico -anto la ferroprotoporfirina como la ferriprotoporfirina tienen la propiedad de combinarse con otros compuestos nitrogenados por medio de la globulina. -ales compuestos incluyen otras protenas, hidrxido de amonio, cianuro, nicotina y piridina y los productos resultados se llaman hemocromgenos. Los cristales pueden formarse tanto en medio cido como alcalino2 sin embargo, el reacti$o de -a/ayama es de naturaleza alcalina.

3ecanismo de reaccin" .l hidrxido de sodio efecta una hidrlisis alcalina, liberando el grupo prosttico de la globina2 el fierro del hem en este momento se encuentra como in frrico 045% debido a la formacin de la metahemoglobina en el proceso de desecacin de la mancha de sangre. La carga 045% del fierro se neutraliza por el in 67. &alentando la glucosa 0a azcar reducida%, se reduce el in frrico a ferroso 048% y la piridina se combina con ste para formar un producto cristalino insoluble" el hemocromgeno o piridinferroprotoporfirina. La prueba es ms sensible y sencilla ue la de los cristales de hemina y no se dan casos de falsas reacciones positi$as.

#reparacin del reacti$o de -a/ayama 3ezclar" a% 9na parte de solucin saturada de glucosa. b% 9na parte de solucin de hidrxido de sodio al (': c% 9na parte de piridina. 0#3" ;<.( D='>?%

d% Dos partes de agua destilada 9na $ez preparada la mezcla se guarda en un frasco mbar. La solucin deber ser preparada inmediatamente antes de utilizarse. #rocedimiento" a% &olocar una pe ue@a cantidad de muestra problema entre una laminilla portaob,etos y un cubreob,etos. b% Deslizar por capilaridad unas gotas del reacti$o entre lmina y laminilla. c% &alentar la laminilla a ba,a temperatura durante 5' seg. d% 6bser$ar al microscopio. .n caso positi$o se obser$arn cristales romboidales de color rosa alredor de la muestra.

-cnicas de determinacin del origen de la sangre La tcnica de eleccin para determinar si una mancha de sangre es de origen humano, es la reaccin de las precipitinas descubierta en (<'' por 9hlenhuth.

1undamento de la tcnica Las molculas del anticuerpo 0inminoglobulina% reacciona con el antgeno 0protena soluble% para formar un precipitado fcilmente $isible ba,o condiciones de luz apropiadas y a las concentraciones e ui$alentes de antgeno y de anticuerpo. .sta reaccin atgenoAanticuerpo est influida por $arias fuerzas, interactuando entre los factores reaccionantes como lo son" las fuerzas de Ban der Calls, puentes de hidrgeno, interaccin de dipolos, atraccin entre los antgenos no polares y la superficie del anticuerpo, y la atraccin electrosttica. La reaccin misma tiene lugar en $arias etapas. *nicialmente se forma un comple,o antgenoA anticuerpo soluble2 conforme la reaccin prosigue, ese comple,o empieza a unirse y forma una tupida red compuesta de molculas de anticuerpo bi$alente y molculas de antgeno poli$alente. .sta 1ormacin crece rpidamente formando partculas del tama@o suficiente como para ser insolubles y formar un precipitado $isible.

Debe tenerse en mente ue para ue la reaccin se lle$e a cabo se re uiere ue la concentracin del antgeno y del anticuerpo sean e ui$alentes2 9n exeso de alguno de los dos producir un resultado negati$o. La reaccin puede efectuarse obser$ando la interface en tre los dos li uidos en un tubo de enzayo o en un capilar2 tambin puede hacerse sobre gel por medio del fenmeno de difusin entre las partes reaccionantes, o bien por el mtodo de electroferesis. La tcnica de$era ser ele,ida por el in$estigador segn sus necesidades y posibilidades.

La tcnica de precipitinas en tubo o en capilar, tiene la $enta,a de ser rpida y sencilla pero es necesario tener una muestra clara. .n ella debe efectuarse una cuidadosa estratificacin en donde la capa de la solucin del antgeno se encuentra sobre la preparacin del anticuerpo. La precipitacin sobre gel tiene una $enta,a de poder realizarse con el extracto de una mancha de sangre aun ue ste sea turbio, y re uiere de muy pe ue@a cantidad de muestra, pero tiene como des$enta,a el emplear $arias horas para ue se efecte la difusin. La tcnica electrofortica, tiene la $enta,a de acelerar la difusin sobre el gel y por lo tanto disminuye el tiempo de reaccin adems de ser ms sensible ue las otras tcnicas, pero re uiere de un e uipo ms costoso. Factores que afectan la reaccin de las precipitinas. !on $arios" la edad de la muestra2 su exposicin al aire, a la luz solar, a la humedad y a las altas temperaturas2 el grado de putrefaccin y la contaminacin con compuestos umicos, tales como detergentes. Ddems la reaccin debe efectuarse en condiciones ptimas de temperatura, de p7, de solubilidad de la muestra y de dilucin del extracto obtenido de ella. .specialmente la edad y la putrefaccin causan degradacin de las protenas de la sangre2 la exposicin al aire, a la luz solar y a la humedad a menudo producen cambios por oxidacin. 9n efecto obser$ado a menudo en las manchas de sangre, es ue cuando han sido calentadas. se re uiere una gran cantidad de tiempo para disol$erlas. La precipitacin es escasa y el tiempo de reaccin se alarga2 ello es debido a lo $ulnerable ue son las precipitinas al calor, el cual las desnaturaliza.

.l la$ado de manchas de sangre con agua interfiere las reacciones positi$as.

ue contenga ,abn o detergente

Dlgunos in$estigadores han obser$ado falsas reacciones positi$as debidas a la presencia de sales de sodio o sulfonatos ue contienen los pol$os para la$ado. 6tra posible influencia umica ue permite obser$ar falsas reacciones positi$as es la presencia del cido tnico 0frecuentemente presente en la corteza de los rboles%, ue por su p7 cido puede precipitar las protenas del antisuero. .s importante se@alar ue las protenas sricas de una mancha de sangre seca son las responsables de las reacciones #ositi$as de la prueba de las precipitinas ue algunos otros productos biolgicos de origen humano tambin dan este resultado.

.l extracto de la mancha de sangre debe tener un p7 casi neutro y la prueba debe lle$arse a cabo a la temperatura del laboratorio 0aproximadamente 88 E&%. Los extractos deben prepararse en el menor $olumen posible, procedimiento ue para algunas muestras re uiere de 8> hrs. en refrigeracin. .l tiempo adecuado depender de las condiciones de la muestra y el ttulo de dilucin deber ser de ( a (,'''. -cnica de precipitinas en capilar Feacti$os a% Dntisuero humano precipitante b% !olucin salina fisiolgica #rocedimiento a% &ortar un pe ue@o fragmento de la mancha y extraer en un tubo de ensaye de (8 x ;G cm. con unas gotas de solucin salina fisiolgica2 el tiempo re uerido depender de la naturaleza de la mancha2 normalmente se re uieren de ( a 8 minutos. !i la solucin est turbia es con$eniente centrifugar y utilizar el sobrenadante. b% Dos gotas del extracto diluido se colocan en un tubo capilar 0de tal forma ue el l uido humedezca la pared del tubo por el cual es preferible hacer esto con el capilar inclinado%. 9na cantidad igual de antisuero se absorbe en el mismo capilar

de una manera ue uede aba,o del extracto de la muestra. .l tubo se fi,a perpendicularmente sobre un soporte. c% La obser$acin se hace con luz indirecta y sobre fondo oscuro, la aparicin de un anillo de precipitacin en la interfase de los dos l uidos indica reaccin positi$a. d% .l resultado es considerado positi$o si la precipitacin aparece antes de 8' minutos, despus de ese tiempo el resultado de,a de ser confiable.

Recomendaciones

.s con$eniente una $ez hecha la extraccin, determinar el p7 con papel indicador2 si la reaccin no es neutra, neutralizar" Ha67 al '.(: si la reaccin es cida hasta lograr un p7 neutro, o con cido clorhdrico al '.( : si es alcalina. !i existen partculas en suspensin o turbidez, la muestra deber centrifugarse hasta obtener un l uido transparente. La dilucin de la muestra problema deber tener una concentracin de ( a (''' misma ue se controlar con un testigo a la misma dilucin. Ho se recomienda hacer la extraccin en medio tibio o caliente. .n cuanto al antisuero precipitante aun cuando puede ser separado en el laboratorio, es preferible obtener productos comerciales y determinar su potencia, efectuando diluciones con muestras de sangre testigo.

D.-.F3*HD&*6H D. .HI*3D! J #F6-.*HD! .H 3DH&7DD. !DHKF. .n los eritrocitos de la sangre existen una serie de sustancias ue en criminalstica tiene gran importancia, debido a ue su determinacin incrementa el grado de probabilidad en la indi$idualizacin de las manchas de sangre. .stas sustancias son las enzimas, algunas de ellas con un gran polimorfismo interesante desde el punto de $ista forenseG , cunado son separadas en los componentes protenicos llamados isoenzimas, de las cuales son particularmente importantes" la 1osfoglucomutasa 0#K3%, adenilato/inasa 0DL%, fosfatasa cida eritroctica 0.D#%, etearasa 0D .sD%, y entre las protenas cobra particular inters la haptoglobina 07p%, fundamentalmente por ue sobre$i$e determinado tiempo 0no muy corto% en manchas de sangre seca.

La #K3 y la 7p son las ms usadas para fines de indi$idualizacin y ambas pueden separarse eficientemente por procedimientos de electroforesis. La importancia de su separacin reside en el hecho de ue no todas las personas tienen exactamente las mismas $ariantes. Las tres $ariedades ms comunes de la #K3 son" #K3 (A(, #K3 8A( y la #K3 8A8. las de haptoblobina corresponden tambin a la 7p (A (, 7p 8A( y 7p 8A8.

Dhora bien, uniendo los resultados inmunolgicos a la combinacin de stas protenas 0llamadas tambin marcadores genticos, se obtienen tablas de distribucin en la poblacin ue dan la pauta para aumentar la probabilidad de exclusin. .l pionero de la aplicacin de del mtodo de separacin de enzimas en hematologa forense fue &ulliford, del laboratorio de la #olica 3etropolitana de Londres, uien determin ue pueden ser satisfactoriamente detectadas en manchas de sangre mediante procedimientos electroforticos sobre capas de gel de almidn, siempre y cuando se cuente con cantidad suficiente de muestra problema en buen estado de conser$acin, ya ue la posibilidad de encontrarlas $a decreciendo con la desecacin en el siguiente orden" !istema D)6, Fh, 7p y #K3, esto es, ue los antgenos del primer sistema pueden durar a@os en

condiciones de se e$idenciadosM , los del sistema Fh algunos meses2 las 7p semanas, y por ltimo las #K3 tan slo despus de unos das. #osteriormente a los estudios de &ulliford; y sus colaboradores sobre el gel de almidn, es Krunbaum de la 9ni$ersidad de )er/eley en &alifornia, uien se preocupa por la in$estigacin de marcas genticas y a l se deben las tcnicas de electroforesis en 3icrozona y sobre tiras de acetato de celulosa, ue re uieren de un tiempo menor en su resolucin.