Alteracin del perfil de expresin gnica en la enfermedad de Niemann-Pick tipo C en ratones y su correlacin con el dao tisular y el estrs oxidativo.

Antecedentes: enfermedad de Niemann-Pick tipo C (CNP) es un trastorno de almacenamiento de lpidos neurovisceral caracterizado principalmente por la acumulacin de colesterol no esterificado en compartimientos endosomal lisosomales / tarde, aunque tambin existe un almacenamiento importante para varios otro tipo de lpidos. Los principales tejidos afectados por la enfermedad son el hgado y el cerebelo. El estrs oxidativo ha sido descrita en diversas clulas y tejidos NPC, tales como el hgado y el cerebelo. Aunque se producen alteraciones considerables en el hgado, los mecanismos patolgicos implicados en el dao y la muerte de hepatocitos no han sido claramente definido. Aqu, se evalu la integridad del tejido heptico, parmetros de estrs oxidativo bioqumicos y de tipo salvaje de control (NPC1 + / +; WT) y mutante homocigoto-(Npc12 / 2; APN) ratones. Adems, la abundancia de ARNm de genes que codifican protenas asociadas con el estrs oxidativo, el metabolismo del cobre, la fibrosis, la inflamacin y el metabolismo del colesterol se analizaron en los hgados y cerebelo de ratones WT y NPC. Metodologa / Principales hallazgos: Se analizaron diferentes parmetros de estrs oxidativo en el hgado y heptica y la expresin gnica cerebelo en 7 semanas de edad, los ratones deficientes en NPC1 en comparacin con los animales control. Encontramos signos de inflamacin y fibrosis en el hgado de NPC sobre el examen histolgico. Estos signos se correlacionaron con el aumento de los niveles de protenas carboniladas, el contenido total de glutatin disminuida y un aumento significativo de los niveles totales de cobre en el tejido heptico. Por ltimo, se analizaron los patrones de expresin gnica del hgado y el cerebelo mediante ensayos de qPCR y microarrays. Se encontr una correlacin entre el tejido fibrtico y la expresin diferencial de heptica, as como los genes del cerebelo asociadas con el estrs oxidativo, la fibrosis y la inflamacin en ratones NPC . Conclusiones / Importancia: En los ratones NPC, enfermedad heptica se caracteriza por un aumento en la fibrosis y en los marcadores asociados con el estrs oxidativo. NPC tambin se correlaciona con la expresin gnica alterada, principalmente de los genes implicados en el estrs oxidativo y la fibrosis. Estos hallazgos se correlacionan con parmetros similares en cerebelo, como se ha informado anteriormente en el modelo de ratones NPC.

Enfermedad de Niemann-Pick tipo C (NPC) es una enfermedad de almacenamiento de lpidos atpica neurovisceral interviene el colesterol endocytosed [1], as como otro tipo de lpidos. NPC es una enfermedad autosmica recesiva fatal causada por mutaciones en el gen NPC1 o NPC2. El gen NPC1 codifica una protena transmembrana lisosomal, y el gen NPC2 codifica una protena lisosmica soluble que se une el colesterol. Ambas protenas estn involucradas en el trfico de colesterol de los lisosomas [2]. Las mutaciones en el gen NPC1 aproximadamente el 95% de los casos de NPC [3] En la patologa, las deficiencias de estas protenas conducen a la acumulacin de colesterol libre y en segundo lugar glicoesfingolpidos, como lactosilceramide, glucosilceramida y GM2 y GM3 ganglisidos en el lisosoma [4,5,6,7]. NPC se caracteriza por una incapacidad para procesar colesterol celular de la va endoctica que conduce a finales de acumulacin endosomal-lisosomal de colesterol y glicoesfingolpidos y el trfico anormal tubulovesicular, progresiva neuropatologa y la neurodegeneracin.

La enfermedad a menudo se diagnostica en la primera infancia, y los pacientes por lo general presentan ataxia cerebelosa, dificultad para hablar y tragar, y la demencia progresiva [1,3]. Estos sntomas estn asociados con el dao al sistema nervioso central (SNC), especialmente en el cerebelo, donde se observa extensa y progresiva muerte neuronal El SNC es particularmente dependiente del metabolismo del colesterol y es especialmente sensible a dao por estrs oxidativo [ 9 ] . Esta sensibilidad se debe principalmente a varias caractersticas del sistema nervioso central : la alta concentracin de cidos grasos poliinsaturados que son susceptibles a la peroxidacin de los lpidos , las cantidades relativamente grandes de oxgeno consumido para la produccin de energa , y el menor nmero de defensas antioxidantes disponibles para el SNC en comparacin con otros rganos . Las neuronas son particularmente vulnerables al estrs oxidativo debido a que tienen niveles bajos de glutatin reducido [ 10 ] . El estrs oxidativo se ha demostrado en NPC cerebro de ratn [ 11 ] y en diferentes modelos celulares NPC [ 12 ], sin embargo , su importancia funcional para el proceso de la enfermedad an no ha sido establecida . Los datos previos de nuestro laboratorio sugieren un aumento de marcadores de estrs oxidativo en modelos NPC vitroin e in vivo en el cerebelo de Npc12 / 2 ratones [ 13 ] . Tambin hemos encontrado que en un modelo neuronal de la enfermedad , el tratamiento con un compuesto antioxidante previene la muerte celular y la apoptosis [ 13 ] . En resumen , nuestros datos estn de acuerdo con los hallazgos previos que sugieren que el estrs oxidativo es central en la patologa neuronal NPC. Un factor de riesgo para el estrs oxidativo relevante al tejido nervioso es el nivel de iones de metales, tales como cobre. El cobre es un oligoelemento importante que juega un papel esencial en la fisiologa humana [14]. Los niveles adecuados de cobre son esenciales para evitar el dao celular por el estrs oxidativo debido a la rpida oxidacin del cobre, que causa dao a las biomolculas mencionadas anteriormente y genera ROS, lo que lleva a la muerte celular. Cobre de la dieta se almacena principalmente en el hgado, el rgano que regula la distribucin de cobre a travs de la liberacin en el plasma o la excrecin a travs de la bilis. Por otra parte, la expresin de genes implicados en la homeostasis de metal y el transporte, incluyendo el hierro, se inform de cobre y zinc para ser alterado en NPC estudios de microarrays de fibroblastos [15,16] que sugieren alteraciones en los niveles de metal en la enfermedad de NPC Aunque el dao neuronal es una caracterstica importante de la NCP, la mayora de los pacientes presentan daos considerables en el hgado [4]. De hecho, en la actualidad, la enfermedad de Niemann-Pick C es reconocida como una causa relativamente comn de la enfermedad heptica en la vida temprana [17]. El dao heptico es particularmente relevante en la enfermedad de NPC, ya que juega un papel central en el mantenimiento de metabolismo del colesterol en todo el cuerpo. Aproximadamente un y medio de pacientes NPC sufren de enfermedad heptica, y NPC puede ser el trastorno metablico ms comn responsable de colestasis neonatal [3]. Ya en el perodo neonatal, NPC pacientes pueden presentarse con ictericia neonatal, hepatoesplenomegalia, retraso del crecimiento y la muerte entre los 3 y 9 meses (en la forma ms grave de la enfermedad), o entre 1 y 3 aos (el ms comn) [1, 3]. La histopatologa del hgado parece a la hepatitis neonatal, y como la enfermedad progresa, el hgado se acumula ms material de almacenamiento, tales como lpidos y colesterol no esterificado. La fisiopatologa asociada con enfermedad heptica APN y aspectos del metabolismo de las lipoprotenas se han investigado utilizando el modelo de ratn NPC. Un aumento en el colesterol en el hgado mediante los resultados de la administracin en la dieta dao heptico y la muerte celular [18]. Un aumento en los productos de oxidacin de colesterol celulares se ha descrito en NPC tejidos de ratn, plasmticas y macrfagos de los ratones NPC [19,20], mientras que una disminucin en la capacidad antioxidante se ha demostrado en los hepatocitos de los pacientes

NPC humanos [21]. Tambin se ha sugerido recientemente que los productos de oxidacin de colesterol podran servir como marcadores biolgicos basados en la sangre para la enfermedad de NPC [22] Un enfoque para determinar las vas fisiolgicas alteradas en la enfermedad es para analizar los perfiles de expresin gnica. Varios informes han demostrado alteraciones en la expresin de genes en fibroblastos de pacientes NPC humanos y en el cerebelo de los ratones NPC [15,16,23]. En esto, se realiz un anlisis histopatolgico del hgado de Npc12 / 2 (NPC) ratones para evaluar el dao heptico. Tambin se realiz un anlisis bioqumico de marcadores de estrs oxidativo y se midi el contenido total de cobre en el tejido heptico. Por ltimo, se evalu la expresin gnica del hgado y cerebelo utilizando tcnicas de qPCR y microarrays, centrndose en los genes relacionados con los procesos biolgicos que son alterados en la enfermedad. Hemos encontrado que en los hgados de ratones NPC, hubo un incremento en la reaccin inflamacin y el dao inducido por el estrs oxidativo en comparacin con los animales de control, como se muestra por el anlisis histolgico, el aumento de marcadores de estrs oxidativo bioqumicos, tales como la protena carbonilos, y la disminucin de las especies antioxidantes, tales como glutatin reducido. Estas observaciones correlacionadas con la expresin diferencial de los genes hepticos en relacin con el estrs oxidativo en ratones NPC segn lo verificado por anlisis de qPCR. Tambin se analizaron los patrones de expresin gnica cerebelo por qPCR y anlisis de microarrays y encontramos la expresin diferencial de genes asociados con el metabolismo del cerebelo, la inflamacin y la fibrosis procesos de colesterol en ratones NPC. Por ltimo, se realiz una intervencin preliminar aguda con N-acetil cistena (NAC), un antioxidante ampliamente utilizado. Despus de esto, se observ una disminucin de la inflamacin en los hgados de los ratones NPC.

Materiales y mtodos
Animales y dieta
BALB / c ratones portadores de una mutacin heterocigota en el gen NPC1 [24] se utilizaron para generar el control de tipo salvaje (+ / + npc1; WT) y mutante homocigoto-(Npc12 / 2; NPC) animales. Los genotipos fueron identificados como se describe anteriormente [25]. Todos los animales tuvieron libre acceso a agua y comida dieta (0,02% de colesterol; Prolab RMH 3000, PMI Feeds Inc., St. Louis, MO) hasta que se utilizaron para los estudios. Para los experimentos, 7 - y 8-semanas de edad, NPC y ratones machos WT se mantuvieron en ayunas durante 2 horas antes de la toma de muestras de hgado. Protocolos se realizaron de acuerdo con la Poltica de Servicio de Salud Pblica de Atencin Humanitaria y Uso de Animales de Laboratorio en el Instituto de Investigacin de Animales de Laboratorio Gua para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y aprobado por la junta de revisin de los estudios con animales en nuestra institucin (Comite tica Bienestar Animal, CEBA-MEDUC; ID Aprobacin # 3-2009)

Hgado y el cerebelo de muestreo

Los ratones fueron anestesiados mediante inyeccin intraperitoneal de ketamina (80-100 mg / kg) y xilazina (mg / kg 5-10). El hgado se seccion en tres partes, una parte se utiliz para el anlisis histolgico (1-1,5 cm de largo) y se almacena en solucin de formalina al 10%, se utiliz una segunda parte (aproximadamente 500 mg) para la medicin de cobre y se almacen a 280uC, y el tejido restante se utiliz para la extraccin de ARN y tambin se almacena a 280uC. Cerebella fueron

disecados y se almacen a 280uC. Para los propsitos de extraccin de ARN, los tejidos se almacenaron en solucin RNAlater (Ambion, EE.UU.).

Ensayos bioqumicos de marcadores de estrs oxidativo

Carbonilos de protenas. Cien miligramos de tejido fresco se interrumpi en 3 ml de tampn de homogeneizacin (0,1% de digitonina y EDTA 1 mM en 50 mM de tampn de fosfato de sodio, pH 7,4), adems de inhibidores de proteasas (5 mg / ml de leupeptina, 5 mg / ml de pepstatina y 50 mg / ml de PMSF). Despus de 15 min a temperatura ambiente, los homogeneizados se centrifugaron a 5,0006 g durante 20 min. Alcuotas de 1 ml de cada muestra se incubaron ya sea con 4 ml de cualquiera de dinitrofenilhidrazina (DNPH, 10 mM en HCl 2,5 M) o HCl 2,5 M para la determinacin en blanco. Los tubos se incubaron a continuacin durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad con agitacin cada 15 min. Las protenas se precipitaron a continuacin con cido tricloroactico (TCA, 10% de concentracin final), y los sedimentos se lavaron con una mezcla de etanol: acetato de etilo (1:1). el sedimento final se resuspendi en 2 ml de urea 6 M y se incub durante 10 min a temperatura ambiente. La cantidad de carbonilos proteicos se midi la absorbancia en el rango de 350-390 nm Glutatin total. El contenido total de glutatin en las muestras de hgado se llev a cabo como se describe anteriormente [26]. Brevemente, 200 mg de tejido congelado se homogeneiz mecnicamente en 2 ml de 5% (w / v) de cido sulfosaliclico. El homogeneizado se centrifug, y el sobrenadante resultante se diluy 1:25 en 5% (w / v) de cido sulfosalisylic. A continuacin, una parte alcuota de 25 ml se incub con las soluciones de NADPH y DTNB en 37uC durante 10 min antes de la adicin de glutatin reductasa (1,8 unidades por cubeta). El producto liberado se midi a una absorbancia de 412 nm. Se realiz una curva de calibracin de glutatin reducido que van de 20 a 80 mM

La extraccin de RNA
El ARN total se extrajo a partir de hgado homogeneizado o el cerebelo con reactivo TRI (Ambion) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La calidad y la cantidad de ARN se evaluaron antes y despus de la digestin DNasa mediante la desnaturalizacin de electroforesis en gel y anlisis fotomtrico (relacin A260/280), respectivamente

sntesis de ARNm y Marcaje fluorescente

Un microgramo de RNA total se utiliz para sintetizar ARNm utilizando el kit de amplificacin de ARNm II MessageAmp (Ambion). Cinco microgramos de ARNm a partir de ratones WT y NPC se acopl con tintes Cy3 y Cy5, respectivamente, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cantidad de sonda y la incorporacin de tinte se evaluaron con un espectrofotmetro de barrido.

Microarray hibridacin
Dos y cinco microgramos de cada sonda marcada se utiliz para la hibridacin de las muestras de hgado y el cerebelo, respectivamente. Las dos sondas de colorante se mezclaron y se concentraron hasta un volumen de 30 y 50 ml para las muestras de hgado y el cerebelo, respectivamente, en una solucin que contiene 20% de formamida, 56SSC y 0,1% de SDS, y la hibridacin se llev a cabo esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante de microarrays. Los portaobjetos se

incubaron for16 horas en 42uC como se describe anteriormente [27], y la hibridacin se llev a cabo de forma automtica mediante el sistema de hibridacin de ADN 12TM HybArray (PerkinElmer). Para la deteccin de los derivados fluorescentes, se utiliz un lector de lser ScanArray GX

Anlisis de Datos
La expresin global de genes se realiz utilizando una matriz Listo ratn de Microarrays , Inc. ( Nashville , TN ) . Cada matriz contiene 35302 70 -mer oligonucletidos , que representa , 25.000 genes. La identificacin y la cuantificacin del punto se realizaron con el software GenePix 5.1 ( Molecular Devices ) . Serie de datos fueron analizados utilizando el lenguaje estadstico R y el medio ambiente ( http://www.r-project.org ) , especficamente de las herramientas de anlisis de microarrays en el Proyecto de Bioconductor ( http://www.bioconductor.org ) . Las manchas que mostraban QCOM , 0,5 [ 28 ] fueron considerados lugares LowQuality y se retiraron . Datos fondo se restaron y normalizado utilizando el paquete Bioconductor LIMMA [ 29 ] . Los datos obtenidos a partir de rplicas biolgicas se promediaron , y luego se aplicaron modelos lineales . Genes expresados diferencialmente se determinaron utilizando mtodos bayesianos empricos , y p, 0,01 se consider estadsticamente significativa [ 29 ] . El anlisis de genes ontologa categoras enriquecido ( GO) de genes expresados diferencialmente se realiz utilizando el Gene Ontology Tree Machine ( GOTM ) [ 30 ] . Los parmetros utilizados fueron el mtodo estadstico hipergeomtrica y un ajuste de pruebas mltiples de Bonferroni , y p , 0,05 se consider estadsticamente significativa . Todos los datos son compatibles MIAME y los genes descritos en este documento han sido depositadas en el NCBI Gene Expression Omnibus (GEO , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ ) y son accesibles a travs de GEO serie GSE24013 .

PCR en tiempo real (qPCR)

El ARN total (2 mg) se utiliz como plantilla para reacciones de transcripcin inversa para sintetizar ADNc monocatenario usando MMLV-RT de la transcriptasa inversa (Promega) y un (dT) cebador de oligo acuerdo con procedimientos estndar. Conjuntos de cebadores especficos del gen (que se detallan en la Tabla S1) fueron diseados por Primer3Plus para amplificar productos de ADN de 70 y 150 pb. Reacciones en tiempo real de RT-PCR (qPCR) se realizaron en un LightCycler (Roche) utilizando SYBR Green para controlar la amplificacin de ADNc. Una dilucin 1:25 de cDNA se utiliz en cada reaccin junto con 1 ml de ADN Rpido Maestro SYBR Green I (Roche), 0,8 ml de MgCl2 (25 mM) y 2,5 pmol de cebadores directo e inverso en un volumen total de 10 ml. Se us el siguiente perfil trmico estndar: 10 min a 95uC, 40 repeticiones de 10 s en 95uC y 15 s en 60uC, con una etapa de 10-s final en 72uC. Los datos fueron analizados mediante el software LightCycler (v.3, Roche). La eficiencia se determin para cada muestra y el gen por LinRegPCR v.7.5 utilizando los datos obtenidos a partir de la fase exponencial de cada grfico de amplificacin [31]. Dos repeticiones tcnica se hace para cada combinacin de par de ADNc y el cebador, y la calidad de las reacciones de PCR se determin mediante anlisis de la disociacin y curvas de amplificacin. Los productos se resolvieron por electroforesis en gel de agarosa al 3% para confirmar los fragmentos de ADN del tamao esperado. Los niveles de transcripcin de genes se normalizaron a los valores de la expresin del gen PPIA [32], que fue validado en nuestras condiciones experimentales por NormFinder [33]. qPCR se realiz en muestras de al menos tres ratones, y las diferencias en los niveles de expresin gnica entre WT y muestras de hgado de ratn NPC se analizaron por MannWhitney U-test. p, 0,05 fue considerado estadsticamente significativo.

Cuantificacin de Cu
El contenido metlico se cuantific usando 20 mg de tejido heptico que fue interrumpido en 65% cido ntrico concentrado suprapure (Merck, Chemical Co., Darmstadt, Alemania) durante 24 horas a 60uC y despus se diluy a una concentracin final de 5%. Cu determinacin es hecho usando un espectrofotmetro de absorcin atmica horno de grafito (Perkin Elmer, SIMMA 6100). Calibracin estaba en contra de una curva estndar de Cu (JT Baker), y los valores de las muestras se normalizaron a los valores de peso fresco (FW). El anlisis estadstico para el contenido celular de Cu se llev a cabo por Mann-Whitney uTest, y p, 0,05 fue considerado estadsticamente significativo.

histologa heptica
El tejido heptico se fij en paraformaldehdo al 4% durante 48 h y luego embebidos en parafina, se seccionaron, y se coloca en portaobjetos de vidrio. Hematoxilina y eosina y Van Gieson se realizaron de acuerdo con los procedimientos estndar y se analizaron a ciegas por un patlogo.

Resultados
Dao tisular heptica en ratones NPC La histologa heptica, de 7 semanas de edad APN y WT ratones fue evaluada por microscopa de luz (Figura 1). Hemos observado varios focos inflamatorios en los hgados de los ratones NPC (Panel B, flechas finas) que estaban ausentes en los hgados de ratones WT (panel A). Adems, se observaron varias clulas con un citoplasma espumoso, en los hgados NPC, lo que indica la acumulacin de lpidos (panel d, flechas en negrita), pero no en los hgados de ratones WT (panel c). Van Gieson para el colgeno fue negativo en 7 semanas de edad ratones WT y NPC (paneles E y F), sin embargo, de 8 semanas de edad, los ratones NPC mostraron una fuerte marca positiva a travs del lbulo (panel de h, puntas de flecha), lo que indica que el proceso fibrtico fue en realidad mayor. En contraste, 8 semanas de edad ratones WT no tenan pruebas de la fibrosis heptica (panel de g).

Figura 1. Dao del tejido heptico se incrementa en ratones NPC. Hematoxilina y eosina (a-d) para evaluar la integridad del tejido y Van Gieson para el colgeno (e-h) en WT (panel superior) y los ratones NPC (panel inferior) se muestran. Se indican los macrfagos cargados de lpidos focos inflamatorios (flechas finas), (flechas en negrita) y lobular fibrosis (puntas de flecha).

Marcadores de estrs oxidativo y los niveles de cobre en el hgado de los NPC y ratones WT
A modo de bsqueda inicial de marcadores de estrs oxidativo en ratones NPC, que mide hepticas carbonilos proteicos y disminucin de la concentracin de glutatin en los animales 7 semanas de edad. Como se muestra en la Figura 2, la protena carbonilos se incrementaron significativamente (Figura 2A), mientras que el glutatin mostr una tendencia a disminuir (Figura 2B) en los hgados de ratones NPC en comparacin con los ratones WT. Estos resultados sugieren que los cambios histolgicos observados en ratones NPC se correlacionan con el estrs oxidativo. A continuacin analizaron el contenido de cobre del tejido como un posible indicador de un desequilibrio en el metabolismo oxidativo en el hgado NPC. Curiosamente, nuestros datos indican un aumento significativo en el contenido de cobre en el hgado de ratones NPC (Figura 2C).

La expresin de genes en el hgado y el cerebelo de la APN y ratones WT

Antes de qPCR anlisis de la expresin gnica en el hgado y el cerebelo de los ratones NPC, se analizaron tres posibles genes de limpieza a utilizar para la normalizacin de los datos. Estos genes son los que codifican protenas ribosomal L4 (RPL4), la protena de unin a TATA (TBP) y peptidilprolil isomerasa A (Ppia). Basado en criterios de valor de estabilidad [34], hemos elegido Ppia (Tabla S2 y Figura S1)

Se analizaron por qPCR varios genes (Tabla S1) que se esperaban para ser alterado en su perfil de expresin debido a su funcin en los procesos relacionados con la NPC en el hgado. La Figura 3 muestra los resultados de qPCR de los genes analizados. Se observaron aumentos significativos en la expresin de la mayora de estos genes, y los genes que clasifican en cuatro grupos funcionales: el estrs oxidativo (Figura 3A), el metabolismo del cobre (Figura 3B), la fibrosis y la inflamacin (Figura 3C), y el metabolismo del colesterol (Figura 3D). Se ha observado una regulacin positiva significativa (p, 0,05, Mann-Whitney U-test) de varios genes, incluyendo el factor de neutrfilos citoslica 2 (NCF2), GPX3, la protena quinasa C delta (Prkcd), hemo oxigenasa 1 (HMOX1) y el citocromo b-(Figura 3 A) 245, beta polipptido (CYBB), vimentina (Vim) tejido inhibidor de la metaloproteinasa 1 (TIMP1), el colgeno tipo I alfa 2 (COL1A2) y anexina A2 (ANXA2) (Figura 3C), protenas y cidos grasos vinculante 4 (FABP4), CD36 antgeno (Cd36), la lipoprotena lipasa (LPL) y la protena de Niemann-Pick de tipo C2 (NPC2) (Figura 3D). Tambin observamos los genes que fueron significativamente downregulated (p, 0,05, MannWhitney U-test), como el glutamato cistena ligasa (GCS) y hidroxiesteroide deshidrogenasa 3-alfa (Dhrs9) (Figura 3), y cobre gen metabolismo dominio MURR1 (COMMD1), chaperona de cobre para la superxido dismutasa (Ccs) y superxido dismutasa (Sod1) (Figura 3B) Hemos informado anteriormente [13] una regulacin de varios genes implicados en la respuesta strtess oxidativo en el cerebelo de los ratones NPC. Por lo tanto, aqu se analizaron los niveles de expresin de los genes de las otras tres categoras. En este sentido, tambin encontramos una regulacin de varios genes relacionados con el metabolismo del colesterol (Cd36, Lpl, FABP4 y Ncp2; barras naranjas), pero en un solo involucramos con inflamacin y fibrosis (Vim; barra roja). En la ltima categora, el metabolismo del cobre, encontramos en cambio una regulacin de COMMD1 y tambin Metalothioneine 1 (Mt1; barras verdes) (Figura 4). Por ltimo, para obtener una visin general del perfil de expresin gnica heptica en ratones NPC, se realiz microarrays de ADN para analizar los niveles de expresin de 25.000 genes de los ratones NPC. Se compararon tres muestras de hgado o cuatro muestras de cerebelo de 7 semanas de edad, los ratones NPC a una muestra de referencia comn generada a partir de ARNm agrupado de tres ratones WT de la misma edad, para las muestras de hgado y cuatro ratones WT para muestras de cerebelo. Para filtrar los datos de microarrays, inicialmente seleccionado genes que son regulados a la baja, o por lo menos 2 veces (en la escala log2) y tena un valor de p, 0.01. Tambin los genes que estaban involucrados en las vas que afectan NPC patologa especficamente seleccionados. Los datos indican que se refiere con la expresin del hgado 473 genes fueron expresados diferencialmente entre APN y ratones WT, correspondiente a, 2% de los genes presentes en el microarray. Entre estos genes, 282 fueron hasta reguladas y 191 se redujeron reguladas en ratones NPC en comparacin con los ratones WT (Tabla S3). De acuerdo con los resultados qPCR, se encontr un aumento en la abundancia relativa de Vim, Ncsf2, Lpl, FABP4 y Cd36. Mientras tanto, sobre la expresin cerebelo, 1325 genes fueron expresados diferencialmente entre APN y ratones WT, correspondiente a, 5,6% de los genes presentes en el microarray. Entre estos genes, 328 fueron hasta reguladas y 997 eran regulados en ratones NPC en comparacin con los ratones WT (Tabla S4) Tambin de acuerdo con los resultados qPCR, se encontr un aumento en la abundancia relativa de Vim, Lpl, FABP4 y Cd36. Adicionalmente, se realiz un anlisis GO y encontramos que los genes en categoras relacionadas con la adhesin celular, la unin de hidratos de carbono, parte de membrana y la actividad oxidorreductasa eran enriquecido (p, 0,05) en el tejido heptico de los ratones NPC (Tabla 1 y en ms detalles cuadro S5) y en el tejido del cerebelo encontramos un enriquecimiento de la categora homeostasis de linfocitos de los genes hasta reguladas y un

enriquecimiento de las categoras relacionadas con la actividad axnico y sinptica de genes regulados hacia abajo (Tabla 2 y en ms detalles Tabla S6).

El tratamiento agudo con N-acetilcistena de APN y ratones WT

Adems, se realiz una intervencin preliminar aguda en ratones WT y NPC con el antioxidante Nacetilcistena (NAC) (Texto S1). En consecuencia para el anlisis histolgico (Figura S2), se encontr que el aumento de los niveles de antioxidantes conduce a una disminucin parcial del proceso de la inflamacin, como se evidencia por menos clulas espumosas (flechas en negrita) en los ratones tratados con NAC NPC. La fibrosis, como lo demuestra la deposicin de colgeno (cabezas de flecha), todava est presente en ratones NPC despus de dos semanas de tratamiento NAC. Esta evidencia refuerza la idea de que el estrs oxidativo puede mediar, en alguna extensin, el dao en los tejidos heptico observ en este modelo murino de ratones NPC. Paralelamente, tambin se analiz el posible efecto en el dao del cerebelo (Texto S1). Se realiz inmunofluorescencia para inflamatorio (CD68) y el estrs oxidativo (NITT y HNE) marcadores en secciones de tejido fijadas de WT, APN y NPC NAC ratones tratados (Figura S3). Se ha observado una ligera tendencia a la disminucin de CD68 seal positiva en NPC NAC tratados en comparacin con los ratones NPC (b-c). No se encontr una proteccin despus del tratamiento NAC sobre el estrs oxidativo, ya que las seales positivas para NITT y HNE no se redujeron. Tomados en conjunto estos resultados despus del tratamiento agudo de NAC, se infiere que el dao estrs oxidativo est presente en ambos tejidos, pero en el cerebelo puede comenzar antes o ms rpido que en el hgado. En ese escenario, anterior, ms largo o ms fuerte (dosis ms altas) tratamientos NAC podran seria necesario para conseguir un efecto de proteccin a nivel del cerebelo.

Discusin
NPC es una enfermedad lisosomal fatal donde varios lpidos, pero sobre todo libre de colesterol se acumula en el interior de los lisosomas. NPC pacientes mueren como consecuencia de la rpida neurodegeneracin. Hay varios informes que indican que entre el 45% y el 65% de los pacientes NPC tambin desarrollan alteraciones hepticas, incluyendo colestasis, ictericia y hepatoesplenomegalia [35]. la forma infantil de esta enfermedad, el dao hepatico se representa como una hepatitis neonatal pero sin presencia de celulas de kupffer, en el trabjo expuesto se muestran celulas citoplasmaticas espumosas en el higado de ratones con npc,estas celulas no estan presentes en higados de wt, en formas menos graves de la enfermedad el progreso del dao hepatico e obsera en conjunto con alteraciones en la estrutura de todas las celulas hepaticas, sin embargo este mecanimos patogenico por el cual se genera este dao todavia es controversial, es importante destacar el hallazgo de la intervencion con NAC en ratones NPC, la disminucion de la inflamacion de suministralo, esto sugiere que stress oxidativo genera dao a nivel hepatico, aun mas no detectamos cambios significativos en inflamacion o estress oxidativo aen los marcadores a nivel cereblo, esto sugiere que el dao hepatico es reversible de manera mas facil, o que quizas el dao en el cerebelo ocurre mas tempranamente que el dao hepatico. en casos mas severos se presenta fibrosis este fenomeno es en repsuesta aun dao hepatico cronico y es caracteristico por un aumento de la produccion de colageno tipo I y IIIlas moleculas relacionadas con el estres oxidativo modulan los eventos celulares que generan la fibrosis, entre estas moleculas hay aldehidos reactivos formados de la peroxidacion de lipidos son especialmente importantes por que modulan la transduccion de seal que incentiva la proliferacion

de acuerdo a lo anterior, aqui mostramos evidencia de moderada acumulacion de colageno es raton NPC, sin fibrosis avanzada en el raton NPC, esto se da probablemente por la muerte de los ratones en estadios tempranos de la enfermedad, previo a un dao hepatico severo la presencia aumentada de restos de colageno y celulas de kupffer se explica por el aumento de expression de cierta moleculas como ANXA2, VIM, COLIA2, TIMP1 la evidencia actual indica que el procesos de fibrosis es dirigido primariamente por una reaccion inflamotoria en repuesta al dao del parenquima, en acuerdo con esta hipotesis la delecion de ciertos componentes de la repuesta inflamatoria disminuiria la fibrosis el analisis de la expresion global del gen NPC, los ratones NPC mostraron que los genes que codificando proteinas envueltas en la adhesion celular estab alteradas en el cerebelo de animales de 3 semanas de antiguedad, sugiriendo que la ausencia de npc 1 induce mecanimos compesatorios para mantener la funcion y estructura del higado la baja de la GSH y el aumento de los carbonilos en los ratones NPC sugiere una disminucion de las defensas antioxidantes y la precencia de dao por estress oxidatico, un aumento del ROS podria explicar este decenso en la GSH lo cual aumenta el dao por estress oxidatico que se evidencia en el aumento de carbonilos. ROS activa vias pro inflamtorias y apoptoticas los cmabios en la moleculas resposables de las defensas antioxidantes van de la mano con el decenso de GSH, esto se explica con el incremnto de HO-1, GPX3 y NCF2 y baja de GSC y 3aHSD. tambn encontramos upregulation de genes estimulados por el estress oxidativo, como Prked y Cybb (Nox 2, una NADPH oxidasa de los fagocitos ) Cybb genera ROS bajo circuntancias muy acotadas, pero en la enfermedas, hay un desregulacion de su produccion como sumario. la informacion presentada en el trabajo anterior apoya la idea de que el estress oxidatico podria ser la causa del dao hepatico en el NPC, los hepatocitos de ratones NPC hay cumulos de colesterol mitocondrial y baja de GSH mitocondrial y inflamcion y apotosis mediada por deficiencia de NPC1 y baja TNF alfa en raton KO, y disminucion de capacidad antioxidante en hepatocitos de pacientes con NPC con respecto al metabolismo del cobre, aumenta el cobre en lo hepatocitos de ratones NPC, aumenta junto con la downregulation de SOD1, CCS y COMMD1, esto prodria genera la hepatotoxixcidad expuesta en el modelo aumentando el dao por el estress oxidativo. la reduccion de CCS la principal chaperon de SOD1 es marcador de un aumento de cobre en el experimento , ratas con dieta baja en cobre aumentaban la expression de CCS y en humanos el mRNA de CCS y SOD1 aumentba depues de una dieta baja en cobre, en acuerdo con lo anterior se encuentra una baja expression de COMMD1 que modula la localizacion de ATP7B ( involucrado en la secrecion biliar del cobre y su malfuncionamiento causa la enfermedad de wilson) lo que conlleva a una desregulacion de la homeostasis del cobre, incrementando el dao inducido por cobre estas observaciones sobre el colesterol y el cobre son relevantes en la patologia NPC a nivel hepatico, informacion recinente dice que celulas hepaticas tratadas con u18666a que imitan el fenotipo de NPC eran deficiente en el problema del trafico de colesterol y secrecion de cobre ( por lo mecionado antes de ATP7B traportador de cobre atpasa en hepatocitos , en estos sujetos, todas estas proteinas se encontraba correctamente localizadas)

la informacion expuesta sugiere que el acumulo de oclesterol intracel por causa de NPC causa alteracio de tranduccion intra celular, esto lleva aun incmento del dao oxidatico, por el aumento del funcionamiento de ROS o por disminucion de antioxidantes tambien dao induciod por el estress oxidativo, mediado principalmente por el cobre ( muy alto ) puede ser almenos uno de los mecanimos envueltos en la toxicidad celular en la enfermedad de NPC eta alteracion celulares no solo son relevantes en la hepatotoxicidad sino tambien enla neuronal ( cerebelo ). el exacto mecanimos mediante el cual el colesterol influye en el estress oxidativo sigue siendo poco claro, especualmos que la disminucion de defensas antioxidantes junto con acumulacion intracelular de cobre y las alteraciones mitocondriales ydel peroxisoma por los cumulos de colesterol contribuyen al dao por estres oxidativo en el higado de los NPC asi como en el cereblo, evidencia reciente y de nuetro trabajo expone vitamina E acumulada en los lisosomas NPC , dimnuyendo la bioviabilidad de este, aumentando el dao oxidativo por otro lado analismos la alteracion geneticas en el cerebelo, los genes relativos a la fibrosis casi no estaban afectados, mientras que los del metabolismo del colesteros estaba sobreesitmulado como en el higado, se detectaro nvariciones con respecto a als sinapsis y al axon, que se reportaron anteriomente en LIAO et al ( 39 ), que analiso a animales de 3 semanas de vida que aun no tenian sintomas neurologicos, en vez de 7 semanas que los sintomas son evidentes, estos 2 escenarios en la expresion genica reflejan la diferencia observadas en los distintos estdios de la enfermedad en progresion y podria ser una explicacion posible para un diferente manifestacion clinica segun la edad. podemos concluir que los ratone y humanos NPC, presetan fibrosis hepatica caracterizada por acumulacion de colageno y celulas espumosas que detonan estress oxidativo ( bajja de GSH y aumento carbonilos ) podria eplicar los cambios en la expresion genica, especialmente en ellos que teine q ver con el estres oxidativo, trafico colesteron y metabolismo cobre