UNIVERSIDAD AUTNOMA DE YUCATN FACULTAD DE QUMICA

TOXICOLOGIA 1

TRABAJO TECNICAS INSTRUMENTALES EMPLEADAS EN EL ANALISIS TOXICOLOGICO Equip Adn Emmanuel Salazar Salazar Carlos Alberto Pech Dominguez Erica Espadas Ordoez Susana Gomez

Mrida !ucatn a "# de marzo de $#"%

&a to'icolog(a tiene por ob)eto el estudio de los e*ectos de las sustancias +u(micas con los seres ,i,os en sus circunstancias particulares- De sus di*erentes ramas la +ue resulta de inters es la to'icolog(a ambiental o eco to'icolog(a cu.o mbito de aplicaci/n son los contaminantes ambientales . su in*luencia sobre los ecosistemas- Para abordar este estudio se puede partir de dos en*o+ues relacionados con di*erentes ni,eles de organizaci/n biol/gica0 "- El ni,el de los organismos indi,iduales1 en cu.o caso se e,al2an los e*ectos sobre indi,iduos aislados similares caracter(sticas$- El ni,el de los ecosistemas1 en d/nde se pretende e,aluar el impacto de los t/'icos sobre las biocenosis a partir de los di*erentes ni,eles tr/*icos3O45CO&OG6A A7A&635CA &a to'icolog(a anal(tica es uno de los campos *undamentales de la to'icolog(a pues en cual+uiera de las ramas de sta se deben utilizar los mtodos de anlisis +u(micos entre otros- Podemos de*inir la 3o'icolog(a Anal(tica como la aplicaci/n de los instrumentos de la 8u(mica Anal(tica a la estimaci/n cualitati,a o cuantitati,a de sustancias +u(micas +ue pueden e)ercer e*ectos ad,ersos sobre organismos ,i,os- En general la sustancia +u(mica +ue se determina 9analito: es un 'enobi/tico +ue puede haber +uedado alterado o trans*ormado por acciones metab/licas del organismo- Con *recuencia la muestra +ue ,a a analizarse tiene una matriz +ue consta de l(+uidos corporales o te)idos s/lidos del organismo . por lo tanto la identidad del analito as( como la matriz en la +ue se encuentra representa un autntico reto para el +u(mico anal(tico 8;5M5CA A7A&535CA Es la ciencia +ue desarrolla . me)ora mtodos e instrumentos para obtener in*ormaci/n de los componentes +u(micos de la naturaleza . estudia las di,ersas oportunidades de desarrollo en el anlisis instrumental2

e'trapolndose los e*ectos a especies de

A7A&5S5S 57S3<;ME73A& Es el anlisis +u(mico lle,ado a cabo mediante e+uipos +ue miden alguna propiedad de los compuestos- Como por e)emplo intensidad de radiaci/n absorbida o emitida numero de iones etc-

ESPEC3<OSCOP5A DE A=SO<C5>7 A3OM5CA&a espectroscopia de absorci/n at/mica 9EAA: es una tcnica instrumental de determinaci/n indirecta aplicada en el anlisis to'icol/gico en la actualidad )unto con la espectroscopia de emisi/n de plasma 95EP: es la me)or solo superada por la acti,aci/n neutr/nica- Cuando los elementos inorgnicos se encuentran en soluci/n . coe'iste con a materia orgnica sta se elimina con accesorios como el corrector de deuterio la cmara de gra*ito etc- Si la concentraci/n del elemento es mu. pe+uea ha. +ue recurrir a operaciones de enri+uecimiento mediante la *ormaci/n de comple)os- Algunos elementos de inters to'icol/gico como el As . Sb presentan di*icultades en su determinaci/n por EAA pero se ha resuelto mediante la *ormaci/n de hidruro del elemento . su determinaci/n espectro*otomtrica en estado de ,apor sin el curso de llama- &a misma tcnica es aplicable al ?g con el nombre de espectro*otometr(a de ,apor *r(oESPEC3<OSCOP6A DE EM5S5>7 DE P&ASMA 3cnica de absorci/n +ue utiliza el plasma para e'citar los tomos de los elementos a determinar ambos sistemas e'istentes 5CP 9Plasma acoplado inducti,amente: . DCP 9Plasma acoplado por corriente directa: emplean un ordenador +ue controla el barrido de las longitudes de onda permitiendo el anlisis de ,arios elementos de *orma secuencial suponiendo ma.or rapidez anal(tica pero menos sensible +ue EAAE&EC3<O@O<ES5S Se han utilizado las cromatogra*(as en papel capa *ina . capa *ina de alta resoluci/n para in,estigar elementos o compuestos inorgnicos pero en realidad estas tcnicas no son aplicables en la actualidad- &a cromatogra*(a de gases
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re+uiere +ue la sustancia sea ,olatilizada presentando poca utilidad en los anlisis inorgnicos su ma.or aplicaci/n es la determinaci/n de elementos organometlicos como el metilmercurio- Por lo contrario la cromatogra*(a de l(+uidos posee muchas aplicaciones para el anlisis de metales . especialmente para la determinaci/n de aniones- Altimamente se est proponiendo la determinaci/n de cationes . aniones por electro*oresis capilar pero con poca ,enta)a para desplazar a las tcnicas anteriormente citadasPara detectar drogas de abuso de manera rutinaria la Cromatogra*(a en Capa @ina 9CC@: . la Espectro*otometr(a en &uz ;ltra,ioleta 9;B: pueden ser una buena alternati,a- 7os proponemos comparar la ,alidez actual . la ,iabilidad en cuanto a sensibilidad . especi*icidad de la CC@ . la ;B con el Ensa.o 5nmunoenzimtico ?eterogneo 9E&5SA: con el ob)eto de o*recer determinaciones peri/dicas de coca(na a pacientes en proceso de rehabilitaci/n los resultados nos indican +ue estas metodolog(as no se pueden emplear para determinaciones de screening en muestras de orina pro,enientes de pacientes *armacodependientes en las cuales la droga se encuentra en concentraciones relati,amente ba)as3CC75CAS 57M;7O8;6M5CAS E 57M;7O?5S3O8;6M5CAS Gran parte de los progresos alcanzados por la biolog(a moderna se deben al per*eccionamiento de los mtodos anal(ticos de medida- &a introducci/n de los procedimientos basados en las reacciones inmunol/gicas ha representado un importante a,ance en el anlisis de sustancias de inters en biolog(a animal . ,egetal di*(ciles de medir empleando los mtodos bio+u(micos habitualesDentro de los procedimientos inmunol/gicos los ms 2tiles . prcticos son a+uellos +ue se basan en la especi*icidad de la uni/n AgDAc- &a propiedad +ue tienen las 5gs de unirse a un Ag la especi*icidad de esta uni/n . el hecho de +ue pueda ser ,isualizable por los *en/menos de precipitaci/n aglutinaci/n . otros mecanismos indirectos 9marca)e con *luoresce(na con radiois/topos o con enzimas: hace +ue estos mtodos se empleen ampliamente-

&as tcnicas inmunol/gicas permiten la detecci/n espec(*ica de prote(nas concretas- 3odas ellas se basan en la capacidad de reconocimiento de una prote(na por parte de un anticuerpo espec(*ico contra ellas- E'isten una gran ,ariedad de tcnicas +ue apro,echan este principio0 <adioinmunoanlisis 9<5A: . sus deri,ados enzimoinmunoanlisis 9E&5SA: . sus deri,ados Eestern blot inmunohisto+u(mica inmunoprecipitaci/n cromatogra*(a de a*inidad con anticuerpos inmunodi*usi/n . sus deri,ados etcPor e)emplo la tcnica de Eestern blot o inmunoblot es la combinaci/n de la tcnica electro*ortica . procesos inmuno+u(micos- Permite la detecci/n espec(*ica . semicuantitati,a de las prote(nas pre,iamente separadas por una tcnica electro*ortica- Para poder realizar la detecci/n inmuno+u(mica las prote(nas separadas en el gel de acrilamida deben ser trans*eridas a un soporte ms estable generalmente una membrana de nitrocelulosa o PBD@- Esto se consigue en*rentando el gel con las prote(nas de la membrana . aplicando un campo elctrico perpendicular +ue ,a a trans*erir las prote(nas del gel a la membrana donde +uedarn inmo,ilizadas al unirse de un modo inespec(*ico- ;na ,ez *i)adas las prote(nas pueden manipularse . someterse a todo tipo de reacciones sin peligro de perderlas- El primer paso del inmunoblot consiste en blo+uear los sitios de uni/n inespec(*icos +ue han +uedado en la super*icie de la membrana para e,itar +ue los anticuerpos +ue se utilizarn posteriormente se unan inespec(*icamente- Esto se consigue saturando la membrana con una prote(na +ue no inter*iera en el ensa.o particular generalmente alb2mina bo,ina o leche descremada- Esta etapa se conoce como blo+ueo de la membrana- ;na ,ez blo+ueada se incuba la membrana con el anticuerpo contra la prote(na de inters3ras producirse la uni/n se elimina el e'ceso de anticuerpo primario . se incuba con un segundo anticuerpo contra el anticuerpo primario- El anticuerpo secundario est unido con alg2n tipo de marcadores +ue permita re,elar su presencia- Puede ser una enzima capaz de trans*ormar un sustrato incoloro en otro coloreado o de producir sustancias luminiscentes directamente o bien el anticuerpo secundario puede estar unido directamente a un tomo reacti,o +ue emita radiaci/n detectable5

En to'icolog(a esto nos puede a.udar por e)emplo para el anlisis de algunos ,enenos si el cuerpo genera o no anticuerpos para la detecci/n de alg2n tipo de droga etcMC3ODO GE7E<A& DE SC<EE757G 3ambin denominado cribado o tamiza)e de anlisis rpido no espec(*ico para poner de mani*iesto la presencia o ausencia de un grupo de analitos- Son orientati,as por lo +ue ha. +ue con*irmar el resultado con tcnicas anal(ticas con*irmatorias +ue o*recen un principio *isico+u(mico di*erenteSe utilizan la absorci/n at/mica para metales ?P&C . cromatogra*(a de gases acoplada a detectores espec(*icos- En to'icolog(a generalmente se utiliza para buscar drogas en concentraciones su*icientemente altas como para causar into'icaci/n o muertePruebas colorimtricas &as pruebas colorimtricas o pruebas rpidas se utilizan en el anlisis *orense de drogas para obtener una indicaci/n presunti,a rpida de la posible presencia o ausencia de una determinada droga o clase de drogas en la muestra en cuesti/nEl color obtenido en cada prueba particular puede ,ariar en *unci/n de las condiciones del ensa.o la cantidad de sustancia presente . los materiales e'traos +ue contenga la muestra- Para e*ectuar una prueba colorimtrica se coloca una pe+uea cantidad de la muestra en la ca,idad de una placa de gotas se aade una pe+uea cantidad del reacti,o de +ue se trate . se obser,a si se produce alg2n cambio de color- &os reacti,os de las pruebas colorimtricas deben ponerse a prueba con sustancias conocidas cuando se preparan . al e*ectuar la prueba de la muestra debe e)ecutarse tambin un ensa.o en blanco para e'cluir los *alsos positi,osMuchas de las pruebas colorimtricas son inespec(*icas . sir,en para comprobar 9o e'cluir: la presencia de una amplia ,ariedad de compuestos- Sin embargo otras reacciones colorimtricas pueden ser ms espec(*icas . demostrar la presencia o ausencia de ciertos grupos *uncionales- Aplicando una serie de pruebas colorimtricas di*erentes a la muestra de una sustancia desconocida el analista
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puede descartar posibilidades . apro'imarse as( a la posible identidad del compuesto o los compuestos presentes- El analista debe necesariamente con*irmar esos resultados mediante otras tcnicasE)emplos0 Reactivo de Marquis

Reactivo A: Solucin de formaldehdo al 40 % Reactivo B: cido sulfrico conc!" M#todo M#$clese % &ota de solucin de formaldehdo con % ml de 'cido sulfrico concentrado! (olquese la muestra en la de)resin de una )laca de &otas * a+'danse , &otas de los reactivos me$clados! Este reacti,o produce cambios de color en un gran n2mero de compuestos heterociclicosSin embargo como el componente de cido sul*2rico de este reacti,o produce cambios de color tambin por si solo es esencial incluir en el ensa.o una muestra de control con cido sul*2rico 9F gotas:Con los compuestos del tipo de la =GP el reacti,o de Mar+uis da resultados negati,os o una coloraci/n dbil- En la ma.or(a de los compuestos los resultados son mu. parecidos a los de la muestra de control con cido sul*2rico- A e*ectos de comparaci/n el reacti,o produce un intenso color ro)o anaran)ado con las an*etaminas mientras +ue los compuestos del tipo de la MDMA dan un color negro azulado Reactivo de Simn

Reactivo A: Solucin acuosa de car-onato sdico al .0 % Reactivo B: Solucin de acetaldehdo etanlico al /0 % Reactivo (: Solucin acuosa de nitro)rusiato sdico al % % M#todo
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0os reactivos )re)arados de-en almacenarse )or se)arado en reci)ientes refri&erados! (olquese la muestra en la de)resin de una )laca de &otas * a+'dase % &ota del reactivo A1 se&uida de cantidades equivalentes del reactivo B * lue&o del reactivo (! El color azul indica la presencia de una amina secundaria . en algunas piperazinas el color cambia gradualmente de azul a amarillo- El reacti,o de Sim/n es menos sensible a los compuestos del tipo de la =GP +ue a drogas tales como la metan*etamina o la MDMA por lo +ue el resultado +uedara oculto si estn presentes tambin estas sustanciasEl uso del reacti,o de Sim/n por si solo no permite di*erenciar la metan*etamina o la MDMA de las piperazinas pero la combinaci/n del reacti,o de Mar+uis con el de Sim/n puede ser e*icaz para distinguir algunas piperazinas de la metan*etamina o la MDMA sobre el terreno Reactivo de 2ra&endorff

<eacti,o A0 Subnitrato de bismuto 9" g: <eacti,o =0 Hcido clorh(drico 9conc-: <eacti,o C0 Amon(aco 9$I J a+: <eacti,o D0 !oduro potsico 9F g: <eacti,o E0 Hcido actico 9K# J a+: Mtodo Disul,ase " g de subnitrato de bismuto en una pe+uea cantidad de ?Cl concentrado- Adanse gotas de soluci/n acuosa de amon(aco al $I J hasta +ue cese la *ormaci/n de precipitado- @(ltrese . consr,ese el precipitado l,ese con agua . luego disul,ase en " ml de ?Cl concentrado- Preprese una soluci/n de F g de .oduro potsico en " ml de agua . adase a la soluci/n del precipitado- A la soluci/n resultante adanse %L ml de una soluci/n acuosa de cido actico al K# J- Col/+uese la muestra en la depresi/n de una placa de gotas . adanse F gotas del reacti,o;n precipitado de color naran)a ro)o anaran)ado o marr/n anaran)ado indica la
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presencia de una base alcaloide . las aminas terciarias suelen arro)ar un resultado *uertemente positi,o- &os resultados con las piperazinas aun+ue positi,os no son tan marcados como el +ue se obtiene con la dimetilan*etamina-

<E@E<E7C5AS "- Mi)n A1 3ecnicas . mtodos de in,estigaci/n en nutrici/n humana- Glosa =arcelona Espaa- $##$ $- Calder/n Banessa1 5nstituto de =iotecnolog(a- ;ni,ersidad Aut/noma de M'ico Cuerna,aca Morelos- $##K F- <epetto G1 <epetto M- 3o'icolog(a *undamental- %M ed- Diaz de santosEspaa $##N%- Mtodos recomendados para la identi*icaci/n . el anlisis de las piperazinas en los materiales incautados Manual para uso de los laboratorios nacionales de anlisis de drogas- Secci/n de &aboratorio . Asuntos Cient(*icos o*icina de las naciones unidas contra la droga . el delito Biena- Pp "ID"O 7AC5O7ES ;75DAS 7ue,a !orP $#"F I- <epetto Manuel1 3o'icolog(a @undamental1 Ediciones D(az de Santos1 %Q Edici/n1 $##N1 pp I$L I$NO- <e,ista de 3o'icolog(a1 Cromatogra*(a en Capa @ina . Espectro*otometr(a en &uz ;ltra,ioleta como ensa.os de rutina para detectar coca(na en orina de pacientes drogodependientes es proceso de rehabilitaci/n1 Espaa1 $##K1 Bol- $%1 Consultado en Marzo $#"%