Laboratorio N 3: Cuantificacin de protenas

INTRODUCCIN La determinacin colorimtrica cuantitativa de una sustancia se basa en la capacidad de sta para absorber selectivamente ciertas longitudes de onda de la luz incidente. La cantidad de luz absorbida es directamente proporcional al espesor del medio y a la concentracin de la sustancia presente. De esta manera, si se mantiene constante el espesor del medio, la absorcin de luz por una sustancia disuelta en un medio transparente (Ej agua) ser proporcional a su concentracin molar. Estos principios estn contenidos en las leyes de Lambert Beer y estn expresadas en la siguiente ecuacin: A = E c l, donde A es la Absorbancia o Densidad ptica (DO) de la sustancia, E es el coeficiente de extincin molar, c es la concentracin y l es el espesor, siendo ste ltimo igual a 1cm. El coeficiente E se expresa en litros/M cm y es numricamente igual a la DO de una solucin 1M (1 Molar) de concentracin. Las sustancias que siguen la ley de Lambert-Beer presentan una relacin lineal entre la Absorbancia y concentracin de la solucin. Por otro lado si la relacin entre A y concentracin es lineal para dos soluciones de la misma sustancia a igual espesor y longitud de onda, entonces se puede usar una de ellas de concentracin conocida (estndar) para determinar la concentracin de la otra solucin. En la prctica para determinar espectrofotomtricamente la concentracin de una sustancia se requiere: a) una serie de soluciones estndar de concentracin conocida, en un rango de concentracin que muestre absorcin lineal y que permita expresar la concentracin en A por unidad de masa o concentracin. b) un blanco que contiene todos los componentes del ensayo con excepcin de la sustancia a medir y c) la muestra con la sustancia problema a una dilucin tal que su lectura de A este en el rango lineal de la curva de calibracin OBJETIVOS Desarrollo de un mtodo o procedimiento para determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica. ACTIVIDADES Determinacin de la concentracin total de protenas en una muestra problema por el mtodo de Biuret utilizando como estndar una solucin de seroalbmina de bovino (BSA, PM = 66.500) concentracin 10 mg/ml. Procedimiento Preparacin curva estndar. Atencin: realice en forma paralela a la curva estndar el ensayo de la muestra problema.

1.- Disponga de seis tubos de ensayo y rotlelos apropiadamente segn la tabla. Coloque en ellos los volmenes de solucin de BSA 10 mg/ml y luego complete a 2ml con agua destilada como indica la tabla. El sexto tubo ser utilizado como blanco y solo contendr agua. Calcule la concentracin de la solucin obtenida. Tubos BSA 10 mg/ml (ml) Agua destilada (ml) Muestra problema (ml) Reactivo de Biuret (ml) Conc. de protenas (mg/ml) Absorbancia a 540nm 1 0,4 1,6 ---4,0 2 0,8 1,2 ---4,0 3 1,2 0,8 ---4,0 4 1,6 0,4 ---4,0 5 2,0 ------4,0 Blanco ---2,0 ---4,0 MP --------2,0 4,0

2.- Agregue a cada tubo 4ml de reactivo de Biuret. 3.- Mezcle cada tubo en agitador suavemente. Deje desarrollar color por 30 minutos, luego dirjase a un espectrofotmetro y mida absorbancia a 540nm utilizando cubetas de vidrio a cada uno de los tubos de ensayo. Nota: Se puede calentar en bao a 50C por 5 minutos y leer despus de enfriar en agua corriente. 4.- Grafique para obtener la curva estndar de la siguiente forma: en papel milimetrado grafique la concentracin de protenas v/s la absorbancia de las soluciones estndar medida a 540nm. Luego, utilice el mtodo de regresin lineal para obtener los parmetros de la recta (pendiente e intercepto en el eje Y) que mejor se ajustan a los datos obtenidos. 5.- Calcule la concentracin de protenas (mg/ml) de la muestra problema (MP) a partir de los datos obtenidos. 6.- Un mtodo alternativo a la regresin lineal para obtener la concentracin de protenas de una muestra problema es el mtodo grafico directo que ser explicado en el laboratorio. Compare ambos mtodos y discuta sus resultados. Reactivos y Soluciones 1. Reactivo de Biuret 2. Solucin estndar de seroalbmina de Bovino (BSA) 10 mg/ml. Equipo y materiales 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Espectrofotmetro UV- Visible Cubetas de vidrio Tubos de ensayo de 10 ml y gradillas Matraces erlermeyer de 100 ml Pipetas de 1, 5 y 10 ml Bao de agua a 50C Balanza analtica Papel parafilm Peras de gomas y bombas para pipetas, cinta para rotular.