Lineamiento EDA Bacteriana Laboratorio

LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA POR LABORATORIO DE ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA BACTERIANA
DGE-InDRERNLSP 2013
EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versin No.01
Pgina 1 de 52 Julio 2013
PRIMERA EDICIN, 2013 EDA BACTERIANARNLSP
Este documento fue avalado por los representantes de las instituciones que conforman el Grupo Tcnico Interinstitucional del Comit Nacional de Vigilancia Epidemiolgica (CoNaVE).
TODOS LOS DERECHOS RESERVADOS CONFORME A LA LEY, INDRE-DGE-SECRETARA DE SALUD SE PERMITE LA REPRODUCCIN TOTAL O PARCIAL SI SE CITA LA FUENTE: LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA POR LABORATORIO DE ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA BACTERIANA VERSIN NO. 01. INDRE, 2013.
COLECCIN PUBLICACIONES TCNICAS DEL INDRE: ISBN: EN PROCESO
INSTITUTO DE DIAGNSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLGICO. PROLONGACIN DE CARPIO 470, COL. SANTO TOMS DEL. MIGUEL HIDALGO, C. P. 11340, MXICO, D. F. TEL. (55)53-42-75-50 WWW.INDRE.SALUD.GOB.MX
LA EDICIN ESTUVO A CARGO DE: EL DISEO ESTUVO A CARGO DE:
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SECRETARA DE SALUD DRA. MERCEDES JUAN LPEZ SECRETARIA DE SALUD DR. PABLO KURI MORALES SUBSECRETARIO DE PREVENCIN Y PROMOCIN DE LA SALUD DR. CUITLHUAC RUZ MATUS DIRECTOR GENERAL DE EPIDEMIOLOGA DR. JOS ALBERTO DAZ QUIONEZ DIRECTOR GENERAL ADJUNTO DEL INDRE
INSTITUTO DE DIAGNSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLGICOS DR. JOS ALBERTO DAZ QUIONEZ DIRECTOR GENERAL ADJUNTO DRA. MA. DEL CARMEN GUZMN BRACHO DIRECTORA DE DIAGNSTICO Y REFERENCIA QFB. LUCA HERNNDEZ RIVAS DIRECTORA DE SERVICIOS Y APOYO TCNICO LIC. DIANA ALEX FLORES ROMERO SUBDIRECTORA DE OPERACIN M EN C IRMA LPEZ MARTNEZ JEFA DEL DEPARTAMENTO DE VIROLOGA QFB. ROBERTO VZQUEZ CAMPUZANO JEFE DEL DEPARTAMENTO DE ENFERMEDADES EMERGENTES Y URGENCIAS M EN C MAYRA GISELA MELNDEZ HERNNDEZ JEFA DEL DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGA DRA. CLARA GORODEZKY LAUFERMAN JEFA DEL DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGA M EN C JUDITH ESTVEZ RAMREZ JEFA DEL DEPARTAMENTO DE CONTROL DE MUESTRAS Y SERVICIOS DR. ERNESTO RAMREZ GONZLEZ JEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGA MOLECULAR Y VALIDACIN DE TCNICAS QBP. IRMA HERNNDEZ MONROY JEFA DEL DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGA Q.F.B. MARA ASUNCIN MORENO PREZ JEFA DEL LABORATORIO DE CLERA Y ENTEROBACTERIAS COORDINADORA DE LA RED DE CLERA Y ENTEROBACTERIAS
LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA POR LABORATORIO DE ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA BACTERIANA
DGE-InDRERNLSP 2013
NDICE INTRODUCCIN ........................................................................................................................ 7 ANTECEDENTES DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PBLICA (RNLSP) PARA EL DIAGNSTICO DE LA ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA BACTERIANA ............................................................................................................................. 7 RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA DE LA ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA BACTERIANA ...................................................................................... 9 MARCO LEGAL DEL LABORATORIO ................................................................................. 10 OBJETIVOS ............................................................................................................................... 10 ORGANIZACIN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA (EDA) BACTERIANA......................................................................... 11 FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED DE EDA BACTERIANA................... 12 DEFINICINES OPERATIVAS ............................................................................................... 14 TOMA, MANEJO Y ENVO DE MUESTRA ........................................................................... 16 ALGORITMO DIAGNSTICO ................................................................................................ 17 ESTNDARES DE CALIDAD ................................................................................................. 18 CAPTURA DE DATOS Y RESULTADOS .............................................................................. 19 PROGRAMA DE EVALUACIN EXTERNA DEL DESEMPEO (PEED) ......................... 19 CRITERIOS PARA LA LIBERACIN DEL DIAGNSTICO ............................................... 20 CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES ..................................................................................... 20 BIBLIOGRAFA ........................................................................................................................ 21 ANEXO 1. TCNICAS DIAGNSTICAS ............................................................................... 23 ANEXO 2. INTERPRETACIN Y RESULTADOS DE PRUEBAS BIOQUMICAS ........... 44 ANEXO 3. RESULTADO DE PRUEBAS DE AGLUTINACIN........................................... 51 Grupo somtico ................................................................................................................... 51 Antisuero flagelar ............................................................................................................... 51
INTRODUCCIN Las enfermedades diarreicas constituyen un problema de salud pblica. Son una de las principales causas de mortalidad y morbilidad de la niez en el mundo y generalmente son consecuencia de la exposicin a alimentos y agua contaminados. En pases industrializados, los nios menores de tres aos presentan en promedio tres episodios de diarrea al ao. Esta alta incidencia hace necesario que la poblacin, est sujeta a vigilancia epidemiolgica para identificar de forma oportuna eventos que signifiquen un riesgo de salud para la poblacin y con base en los hallazgos, tomar decisiones para las acciones de planeacin, control y prevencin de las enfermedades sujetas a vigilancia. En Mxico, las acciones de vigilancia se apoyan en el Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiolgica (SINAVE), el cual cuenta con el subsistema de laboratorio para llevar a cabo las actividades de vigilancia de manera oportuna y uniforme para el diagnstico de clera, salmonelosis, shigelosis y otras enfermedades bacterianas transmitidas por alimentos. El presente documento establece los lineamientos de operacin para la vigilancia basada en los hallazgos de laboratorio de la enfermedad diarreica aguda bacteriana incluyendo las funciones por niveles; la toma, manejo y envo de muestras; la metodologa para el anlisis de muestras (mtodos tradicionales y mtodos moleculares); la evaluacin del desempeo as como los estndares de calidad. ANTECEDENTES DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PBLICA (RNLSP) PARA EL DIAGNSTICO DE LA ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA BACTERIANA El Laboratorio de Clera y Enterobacterias, de forma conjunta con la Direccin General Adjunta de Epidemiologa (DGAE) y el Programa de Clera y Urgencias, son responsables de la vigilancia epidemiolgica del clera en Mxico. A nivel internacional, la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) ha desarrollado una estrategia creando una red de vigilancia de las Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA). El objetivo primario de esta red es apoyar la vigilancia de los patgenos transmitidos por alimentos, con base en el orden de prioridades y de acuerdo al impacto y severidad de enfermedad que ocasiona cada uno de los patgenos asociados. Este proyecto es coordinado por la (Organizacin Panamericana de Salud y la Organizacin Mundial de la Salud) OPS-OMS, la Administracin Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud (ANLIS) Dr. Carlos G. Malbran de Argentina a travs del Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas y los Centros de Control de Enfermedad y Prevencin [Centers for Disease Control and Prevention (CDC), por sus siglas en ingles]. En 1939 fue creado en Mxico el Instituto de Salubridad y Enfermedades Tropicales (ISET) y al interior de ste el Centro de Salmonelas. Aos ms tarde, en 1971, se incorporan nuevos diagnsticos para dar origen al Laboratorio de Bacteriologa Entrica como una necesidad para tener un sitio destinado al estudio de patgenos entricos con fines de apoyo a la vigilancia epidemiolgica. Este nuevo laboratorio inici su trabajo analtico con el aislamiento e identificacin de Shigella dysenteriae tipo 1 y en 1972 tuvo una participacin muy importante en el estudio de los brotes de tifoidea.
Debido a la inminente llegada al Continente Americano de la sptima pandemia de clera que inici en 1961 en Indonesia, en 1990 se fund en el Instituto Nacional de Diagnstico y Referencia Epidemiolgicos (InDRE) el Laboratorio de Clera para identificar al agente etiolgico en los casos compatibles con este padecimiento. A partir de junio de 1991, cuando se report el primer caso de clera en Mxico, se cre paulatinamente la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pblica en apoyo a la vigilancia epidemiolgica y desde entonces, el InDRE coordina a los laboratorios que realizan la bsqueda de patgenos entricos como Vibrio cholerae, Salmonella spp y Shigella spp. En 1992 se cre el Laboratorio de Bacteriologa Entrica II y se dio inicio a la realizacin de estudios moleculares para Escherichia coli y posteriormente para Vibrio cholerae. En la actualidad, el InDRE es el Laboratorio Nacional de Referencia (LNR) para Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Salmonella spp y Shigella spp. Realiza pruebas serolgicas, pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos y pruebas moleculares para la bsqueda de genes de toxigenicidad, determinacin de patotipos o el anlisis de clonas. Proporciona los reactivos para la caracterizacin de Vibrio cholerae y la identificacin de grupo de Salmonella spp y Shigella spp, imparte cursos de capacitacin y capacitaciones en servicio al personal del sector salud y lleva a cabo el aseguramiento de la calidad de la red a travs de programas de evaluacin del desempeo.
RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA BACTERIANA
VIGILANCIA
DE
LA
PRUEBA Autosuficiencia Aislamiento e en el identificacin. diagnstico Pruebas moleculares (PCR)
2009 31 LESP 0
2010 31 LESP 0
2011 31 LESP 0
2012 META 31 31 y D.F. LESP 0 31 y D.F.
Estados de la Repblica Mexicana que realizan el aislamiento y la identificacin de agentes causantes de Enfermedad Diarreica Aguda Bacteriana (Salmonella spp, Shigella spp, Vibrio cholerae y Vibrio parahaemolyticus). Fig. 1. Conformacin de la red para el diagnstico de EDA Bacteriana.
MARCO LEGAL DEL LABORATORIO 1. Constitucin Poltica de los Estados Unidos Mexicanos. Artculo 4. DOF 05/02/1917, ltima Reforma D.O.F. 15/02/2012. 2. Ley General de Salud. Artculo 3, XV; 59; 64, III; 133; 134, I; 136, 138, 139 y 141. DOF 7/02/1984, ltima Reforma DOF 07/06/2012. 3. NORMA Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-2012, Para la vigilancia epidemiolgica. DOF: 19/02/2013 4. Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002. Proteccin ambiental-salud ambiental-residuos peligrosos biolgico-infecciosos-clasificacin y especificaciones de manejo. 5. NORMA Oficial Mexicana NOM-052-SEMARNAT-2005, Que establece las caractersticas, el procedimiento de identificacin, clasificacin y los listados de los residuos peligrosos. DOF: 23/06/2006. 6. PROYECTO de Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-016-SSA2-2009. Para la vigilancia, prevencin, control, manejo y tratamiento de clera. DOF 21/02/2012. 7. Reglamento Interior de la Secretara de Salud, publicado en el Diario Oficial de la Federacin el 19 de enero de 2004. OBJETIVOS Objetivo general Instaurar los procedimientos para la aplicacin del algoritmo de diagnstico de clera y enterobacterias y establecer el manejo adecuado de la informacin generada por laboratorio, a travs de la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pblica (RNLSP), en apoyo a la Vigilancia Epidemiolgica de la enfermedad diarreica aguda bacteriana. Objetivos especficos

Detectar la circulacin de los principales agentes bacterianos causantes de enfermedad diarreica aguda. Realizar la caracterizacin de los aislamientos de Salmonella spp, Shigella spp, Vibrio cholerae y Vibrio parahaemolyticus. Mantener la vigilancia de la circulacin de Vibrio cholerae O1 y Vibrio cholerae O139. En situaciones de brote, realizar estudios de electroforesis de campos pulsados (PFGE) del agente bacteriano relacionado. Proporcionar datos relevantes sobre estos patgenos en la Enfermedad Diarreica Aguda, que sean tiles para estudios epidemiolgicos de vigilancia bacteriolgica.
ORGANIZACIN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA (EDA) BACTERIANA
DE
La Red Nacional de Laboratorios de Diagnstico de Enfermedad Diarreica Aguda Bacteriana la encabeza el Laboratorio de Clera y Enterobacterias, adscrito al Departamento de Bacteriologa del InDRE, integrada por los Laboratorios Estatales de Salud Pblica (LESP) a travs de los componentes de clera y enterobacterias y los laboratorios locales, aunado a los laboratorios pblicos y privados que realicen el diagnstico de EDA bacteriana.
LABORATORIO DE CLERA Y ENTEROBACTERIAS InDRE [(Laboratorio Nacional de Referencia (LNR)] Muestras Resultados
Laboratorios de Diagnstico de EDA Bacteriana (LESP) (Redes Estatales de Diagnstico) Laboratorios Locales de Diagnstico de EDA Bacteriana (Redes Locales de Diagnstico)
Redes de Apoyo Jurisdiccionales
Laboratorios Locales de Diagnstico pblicos y privados que realicen el diagnstico de EDA Bacteriana Fig. 2. Flujo de trabajo de la Red Nacional de Laboratorios para el diagnstico de Enfermedad Diarreica Aguda Bacteriana
FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED DE EDA BACTERIANA FUNCIONES DEL LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA El laboratorio de clera y enterobacterias del InDRE, es el Laboratorio Nacional de Referencia y la pieza normativa para el diagnstico. Se considera que entre sus funciones que competen al rea de la Red de Laboratorios, se encuentran: Realizar el anlisis de muestras y confirmacin inmediata de las cepas que por su naturaleza se consideren urgentes. Mantener algoritmos de referencia y criterios de interpretacin de resultados preestablecidos. Realizar el control de calidad de la red mediante el programa de evaluacin del desempeo a los LESP a travs de: o Monitorear el desempeo de la Red de Laboratorios de Diagnstico de EDA Bacteriana. o Aplicar el programa de evaluacin externa del desempeo (PEED). Proveer capacitacin en servicio para la formacin de recursos humanos con base a las necesidades detectadas. Supervisar a los laboratorios estatales. Proporcionar apoyo tcnico a los laboratorios que lo requieran y lo soliciten. Realizar investigacin operativa en apoyo a la vigilancia epidemiolgica. Generar informacin de orden nacional en materia de diagnstico, control de calidad, formacin de recursos humanos e investigacin en la vigilancia epidemiolgica que coadyuve a la toma de decisiones en el control y prevencin de la enfermedad en el marco del programa nacional de salud. FUNCIONES DE LOS LABORATORIOS ESTATALES DE SALUD PBLICA Para el diagnstico Realizar los estudios analticos bsicos para el diagnstico de enfermedad diarreica aguda bacteriana de importancia en salud pblica: aislamiento e identificacin de Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Salmonella spp y Shigella spp. Realizar la bsqueda de Escherichia coli slo en situacin de brote o cuando se trate de menores de cinco aos que presenten evacuaciones con sangre y moco. Enviar de 3 a 5 aislamientos en cualquier caso, de cada paciente al InDRE. Asegurar la calidad del diagnstico en el laboratorio de clera y enterobacterias. o Enviar al InDRE el 100% de los aislamientos de Vibrio cholerae O1, Vibrio parahaemolyticus, Salmonella spp y Shigella spp. o Enviar al InDRE del 100% de los aislamientos de Vibrio cholerae no O1 aislados de seres humanos. o Enviar al InDRE del 30% de los aislamientos de Vibrio cholerae no O1 aislados de muestras ambientales y de alimentos. Emitir en tiempo y forma los resultados de los exmenes de laboratorio.
Generar evidencia y notificar al rgano normativo estatal correspondiente los casos confirmados. Participar como mecanismo de apoyo tcnico, proporcionando la informacin relacionada y requerida por el Programa de Clera y Urgencias de su entidad federativa. Determinar la resistencia a los antimicrobianos ajustndose a los lineamientos vigentes del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).
Para el monitoreo del desempeo Coordinar a los laboratorios locales que realicen el anlisis de muestras para la vigilancia epidemiolgica de EDA Bacteriana. Asegurar que se lleven a cabo los procedimientos, mtodos y tcnicas estandarizadas. Seleccionar las muestras para referencia del rea de influencia del LESP. Compilar las muestras de los laboratorios locales o jurisdiccionales y realizar el control de calidad indirecto de los mismos. Reportar inmediatamente las incongruencias encontradas. Realizar el anlisis de la informacin generada. Recabar y analizar la informacin sobre la prestacin de servicios de diagnstico de los laboratorios locales para el aseguramiento de la calidad de la red. Para el Programa de Evaluacin Externa del Desempeo Participar en la evaluacin del desempeo del InDRE, a travs de los programas oficiales correspondientes. Realizar la evaluacin del desempeo en los componentes de clera y enterobacterias a los laboratorios locales. Generar la evidencia de la evaluacin para la red y enviar copia de resultados al laboratorio evaluado y al InDRE. Organizar la informacin de estas actividades y proporcionarla cuando sea requerida por las instancias evaluadoras. Para capacitacin Capacitar en el rea de EDA Bacteriana al personal de los laboratorios locales y dems instituciones del Sector Salud que lo requieran en su entidad de acuerdo con las necesidades detectadas para la participacin en estrategias especiales de vigilancia como son los Ncleos Trazadores de Vigilancia Epidemiolgica. Apoyo tcnico Participar en las urgencias epidemiolgicas en el rea de su competencia. Podrn colaborar y/o elaborar trabajos de investigacin operativa que proporcione informacin prioritaria estatal, una vez que los protocolos sean aceptados por los comits de investigacin. Apoyar con la preparacin y/o evaluacin de los reactivos que utilizan los integrantes de la red.
Apoyar en la seleccin para la adquisicin y en el suministro de materiales y reactivos requeridos por los laboratorios de la red estatal de acuerdo a la evaluacin proporcionada por el InDRE. Participar en la elaboracin y actualizacin de los manuales tcnicos referentes a diagnstico y temas especializados (bioseguridad, manejo de residuos peligrosos biolgicoinfecciosos, etc.) para uso en el mbito estatal y local.
FUNCIONES DE LOS LABORATORIOS A NIVEL LOCAL Recepcin e identificacin de las muestras recibidas. Realizar los estudios analticos para el diagnstico de enfermedad diarreica aguda bacteriana de importancia en salud pblica de acuerdo con los lineamientos preestablecidos: Aislamiento e identificacin de Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Salmonella spp y Shigella spp. Realizar la bsqueda de Escherichia coli slo en situacin de brote o cuando se trate de menores de cinco aos que presenten evacuaciones con sangre y moco. Enviar de 3 a 5 aislamientos de cada paciente al InDRE. Participar como mecanismo de apoyo tcnico, proporcionando la informacin relacionada y requerida por el Programa de Clera y urgencias de su jurisdiccin sanitaria. Reportar los casos encontrados diariamente a la instancia correspondiente. Aplicar las recomendaciones del nivel estatal. Cumplir con el programa de control de calidad indirecto que establece el nivel estatal. Participar en la evaluacin del desempeo que organice el nivel estatal. Recibir capacitacin y asesora del nivel estatal.
DEFINICINES OPERATIVAS (Salud, 2012) Caso de EDA: Todo paciente de cualquier edad que demande atencin mdica por presentar cinco o ms evacuaciones diarreicas en 24 horas durante no ms de cinco das con o sin signos de deshidratacin. Definicin de caso EDA sin deshidratacin: Paciente que presenta menos de cuatro evacuaciones lquidas en 24 horas, con o sin presencia de vmito, sin prdida de peso y sin signos clnicos de deshidratacin. Caso de EDA moderada: Paciente de cualquier edad que demande atencin mdica por presentar cuadro diarreico con cinco o ms evacuaciones en 24 horas, cuya evolucin sea menor a cinco das y que presente datos de deshidratacin moderada: Inquietud o irritabilidad, ojos hundidos (llanto sin lgrimas), mucosas secas, sed aumentada, polipnea o taquipnea, taquicardia, llenado capilar mayor a tres segundos y menor de cinco, oliguria. Caso de EDA grave: Paciente de cualquier edad que demande atencin mdica por presentar cuadro diarreico con cinco o ms evacuaciones en 24 horas, cuya evolucin sea menor a cinco das y que tenga dos o ms de los siguientes signos o sntomas: Vmito de ms de cinco en 24 horas, cuadro disentrico, temperatura mayor a 38 C, datos de deshidratacin moderada a grave; letargo o inconsciencia, incapacidad para beber, pulso dbil o no perceptible, llenado capilar igual o mayor de cinco segundos.
Caso sospechoso de clera, a todo enfermo de diarrea que presente las siguientes caractersticas: Que en su lugar de residencia no se haya demostrado o se desconozca la circulacin de Vibrio cholerae O1 y/o O139 toxignicos, a todo enfermo de diarrea que tenga cinco aos de edad o ms, que presente cinco evacuaciones o ms en 24 horas y cuyo cuadro diarreico tenga una evolucin menor a cinco das. Que en su lugar de residencia donde se ha demostrado la circulacin de Vibrio cholerae O1 y/o O139 toxignicos en los ltimos 90 das o en las comunidades ubicadas dentro del rea de los cercos epidemiolgicos, se considerar como sospechosa a toda persona con diarrea no mayor a cinco das de evolucin, independientemente de su edad y en situacin de desastres.
Brote de clera, a la presencia de dos o ms casos confirmados relacionados epidemiolgicamente entre s o la presencia de un caso en un rea donde no se ha demostrado la existencia previa del padecimiento. Caso confirmado de clera, a todo enfermo en el que se asle, mediante cultivo bacteriolgico, en materia fecal o contenido gastrointestinal, Vibrio cholerae O1 y/o O139 toxignicos, as como los que por asociacin epidemiolgica se determinen. Caso hospitalizado por clera, a toda persona a la que se brinde atencin mdica en un establecimiento de salud, fijo o mvil y que permanezca en el mismo 24 horas y en quien se asle o demuestre Vibrio cholerae O1 y/o O139 toxignicos, mediante cultivo bacteriolgico. Contacto, a toda persona que en el hogar, lugar de trabajo o sitio de reunin haya compartido, preparado o manipulado alimentos, agua o hielo o que haya realizado cambio de paal de los casos sospechosos o confirmados en los cinco das previos al inicio de la enfermedad. Defuncin por clera, al fallecimiento de un caso confirmado que ocurra hasta dos semanas posteriores al inicio de las manifestaciones clnicas y en cuyo certificado de defuncin aparezcan como causa bsica o asociada los siguientes trminos: Gastroenteritis o diarrea ms deshidratacin; gastroenteritis; diarrea ms desequilibrio hidroelectroltico. Enfermedad del clera, la infeccin intestinal aguda causada por el Vibrio cholerae O1 y O139 toxignicos que se transmite al hombre por la ingesta de agua y alimentos contaminados por este microorganismo. Fuente de infeccin de clera, a todo alimento, agua, bebida, hielo, heces o vmito donde se asle Vibrio cholerae O1 y/o Vibrio cholerae O139 toxignicos. Portador, a la persona que alberga al agente infeccioso en ausencia de enfermedad clnica aparente y en quien se asle Vibrio cholerae O1 y/o O139 toxignicos en materia fecal o contenido gastrointestinal.
TOMA, MANEJO Y ENVO DE MUESTRA Las muestras de materia fecal se deben obtener en los primeros estadios de cualquier enfermedad entrica, cuando los agentes patgenos estn en mayor nmero y antes de que se haya iniciado el tratamiento antibitico. Una excepcin a esta regla es el caso de las heces obtenidas de pacientes con enfermedad febril y se sospeche de fiebre tifoidea ya que el agente etiolgico, Salmonella ser. typhi, puede estar presente en las heces en mayor cantidad, entre la segunda y la tercera semana de la enfermedad por lo que si se sospecha de este padecimiento se debe tomar muestra para hemocultivo durante la primera semana de evolucin. El nmero de hisopos fecales o rectales que se tomen por paciente debe ser igual al nmero de anlisis que se realizarn. Para la bsqueda de Vibrio spp y enterobacterias se deben tomar dos hisopados fecales o rectales y deben ser enviados al laboratorio en medio de transporte de Cary-Blair. La toma de materia fecal se realiza con un hisopo estril con punta de algodn, pudiendo ser hisopo fecal (obtenido a partir de una muestra directa de materia fecal), o bien mediante hisopo rectal, el cual se obtiene introduciendo el hisopo en el esfnter anal ms de un centmetro y girando el hisopo, el cual debe salir manchado con materia fecal. Cuando se trata de un cuadro caracterstico de clera, la muestra se toma de las heces en forma de agua de arroz. El hisopo se introduce en el tubo de Cary-Blair, tapando bien el tubo e identificndolo al menos con el nombre del paciente y la fecha de la toma de la muestra. El transporte de las muestras diagnsticas y de agentes patgenos (cepas) se debe hacer en sistema de triple bsico de triple embalaje [1] para reducir al mnimo el riesgo para los seres humanos, para el medio ambiente y para proteger la viabilidad de los microorganismos. Las cepas deben ser enviadas en tubos hermticamente cerrados, preferentemente con medio de cultivo Base de Agar Sangre (BAB) o algn otro medio apropiado que no contenga azcares.
El sistema bsico de triple embalaje consiste en la utilizacin de un recipiente primario, en el cual est contenida la muestra biolgica (exudado farngeo, exudado nasofarngeo, lavado bronquio alveolar, biopsia, suero, etc.), el recipiente primario (p. ej. criotubos, tubos o frascos con tapa de rosca) debe ser hermtico para evitar que la muestra se derrame y tiene que estar perfectamente etiquetado con el nombre o nmero de muestra del paciente. El recipiente primario deber rodearse de material absorbente como gasa o papel absorbente y colocarse en un recipiente secundario hermtico a prueba de derrames y golpes. Si se colocan varios recipientes primarios dentro de un recipiente secundario se deber usar una gradilla y material absorbente para evitar algn derrame. Es importante mencionar que dentro del recipiente secundario (hielera) tiene que haber suficientes refrigerantes para mantener una temperatura de 4 a 8 C. Los recipientes secundarios debern llevar las etiquetas de riesgo biolgico y seal de orientacin del recipiente, a su vez el recipiente secundario deber ir contenido en un paquete externo de envo (caja de cartn o hielera) que proteja el contenido de elementos externos del ambiente y debe estar etiquetado con los datos del remitente, destinatario y seal de orientacin. La documentacin que se integre al triple embalaje deber colocarse en la parte interior del paquete.
ALGORITMO DIAGNSTICO
Materia fecal
*Medio de baja selectividad
Enriquecimiento para Salmonella spp Aislamiento en 2 medios de alta selectividad
Enriquecimiento (APA)
Aislamiento en TCBS
**Identificacin Bioqumica **Identificacin Bioqumica
Aglutinacin para grupo y serotipo
Aglutinacin para grupo
Aglutinacin para serotipo
Prueba de susceptibilidad antimicrobiana
Identificacin de genes de toxigenicidad
Prueba de susceptibilidad antimicrobiana
Pruebas moleculares PFGE (Solo en caso de brote)
Pruebas moleculares PFGE (Solo en caso de urgencia)
* En caso de brote y se sospeche de Escherichia coli picar cinco colonias e identificar.
** Se pueden emplear mtodos automatizados o semi automatizados para la identificacin.
Fig. 2. Algoritmo para el diagnstico de EDA Bacteriana Clave de Tabulador: 1B2547012, 1B2542002
ESTNDARES DE CALIDAD Con la finalidad de verificar el cumplimiento de los objetivos de la vigilancia por laboratorio de las diarreas agudas bacterianas se definen los siguientes estndares.
ESTNDARES DE EVALUACIN DE LA CALIDAD Indicador Estndar 90% de las muestras cumplen con los criterios de aceptacin 90% de las muestras aceptadas se recibieron hasta 5 das posteriores a su fecha de toma 90% de concordancia de las cepas enviadas al InDRE Al menos 80% de cumplimiento en cada uno de los componentes (clera y enterobacterias) Envo de los aislamientos de Vibrio cholerae O1, Vibrio parahaemolyticus, Salmonella spp y Shigella spp. Accin La define el laboratorio local o (Muestras estatal. Puede ser aceptadas/muestras capacitacin dirigida recibidas) X 100 u oficio de notificacin (Muestras La define el aceptadas hasta 5 laboratorio local o das posteriores a estatal. Puede ser su fecha de capacitacin dirigida toma/total de u oficio de muestras notificacin aceptadas) X 100 (Cepas concordantes/Total de cepas aceptadas en el InDRE) X 100 Se realiza con base en los criterios que se especifican en el informe del anlisis de resultados (Cepas aceptadas en el InDRE/cepas informadas en el Sistema de Informacin en Salud) X 100 La define el laboratorio con base en el anlisis de causas que deber enviar al InDRE El laboratorio realizar un anlisis de causas y enviar su plan de acciones al InDRE Clculo Evaluacin
Calidad de las muestras
Mensual
Oportunidad en el envo de la muestra
Mensual
Concordancia analtica
Trimestral
Evaluacin del desempeo
Semestral
Cumplimiento del envo de cepas
El laboratorio de referencia nacional enviar oficio de notificacin
Trimestral
CAPTURA DE DATOS Y RESULTADOS Las actividades de captura de datos y resultados la realizar cada Laboratorio Estatal de Salud Pblica con sus recursos disponibles. Para el informe de resultados se deber cumplir con lo siguiente: El laboratorio es responsable de la realizacin del formato de informe. Este formato (ya sea electrnico o en papel) y la manera en que va a ser comunicado por el laboratorio, deben ser determinados en acuerdo con los usuarios de los servicios del laboratorio. El laboratorio comparte la responsabilidad con el solicitante para asegurar que los informes son recibidos por las personas apropiadas dentro del intervalo de tiempo acordado. Los resultados deben ser legibles, sin errores de trascripcin e informados a las personas autorizadas para recibir y utilizar la informacin mdica. El informe tambin debe incluir, sin estar limitado a la siguiente informacin: Identificacin clara y sin ambigedad del examen. Identificacin del laboratorio que emite el informe. Identificacin nica, ubicacin del paciente cuando sea posible y destino del informe. Nombre u otra identificacin nica del solicitante y la direccin del mismo. Fecha y hora de la toma de la muestra primaria, cuando est disponible y sea pertinente para el cuidado del paciente, as como la hora de recepcin en el laboratorio. Fecha y hora de la liberacin del informe, las cuales si no estn en el informe, deben estar fcilmente accesibles cuando sea necesario. Tipo de muestra primaria. Resultados de los exmenes. Otros comentarios (calidad de la muestra primaria condiciones que puedan haber comprometido el resultado). Identificacin de la persona que autoriza la liberacin del informe. Si es pertinente, los resultados originales y los corregidos. Firma o autorizacin de la persona que verifica o libera el informe, cuando sea posible. PROGRAMA DE EVALUACIN EXTERNA DEL DESEMPEO (PEED) El InDRE enviar a los Laboratorios Estatales de Salud Pblica un panel de cepas o muestras cada seis meses, el cual deber ser procesado con la metodologa establecida en el laboratorio y remitir los resultados obtenidos al InDRE. El InDRE analizar los resultados de la red de laboratorios y elaborar un informe con el resultado global y particular de los participantes de la red. Con base en los resultados obtenidos, se evaluar el desempeo de cada participante y se definirn las acciones a seguir. Estas pueden ser desde reconocer el esfuerzo realizado hasta de ser necesario, establecer un plan de acciones correctivas y/o preventivas, evaluar si se requiere capacitacin o si amerita una visita de supervisin. Los laboratorios locales sern evaluados por el Laboratorio Estatal de Salud Pblica que le corresponda bajo los lineamientos anteriormente descritos.
EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Versin No.01 Envo de plan

de Acciones (<80)
Anlisis de la informa
Actividades a realizar durante el ciclo anual del Programa de Evaluacin Externa del Desempeo Fig. 4. Ciclo PEED en los componentes de Clera y Enterobacterias
Evaluacin Externa de la Calidad
CRITERIOS PARA LA LIBERACIN DEL DIAGNSTICO La liberacin del diagnstico de enfermedad diarreica aguda bacteriana se realiza nicamente cuando el LESP obtiene ms del 90% en los indicadores: "Concordancia analtica" y "Evaluacin del desempeo" sin embargo, deben seguir enviando las cepas al InDRE para realizar la vigilancia de susceptibilidad a los antimicrobianos, la vigilancia de circulacin de cepas de Vibrio cholerae O139 y la realizacin de pruebas moleculares de alta complejidad para el estudio de brotes y atencin de urgencias nacionales e internacionales. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES MAR MAY NOV AGO OCT ABR ENE JUN FEB SEP DIC JUL
ACTIVIDAD
Capacitacin en A programar, previa solicitud a travs del Departamento de Control servicio de Muestras y Servicios del InDRE Envo del primer panel a los Laboratorios x Estatales de la Red de EFES Recepcin de resultados del Panel en x el InDRE Envo de resultados a la x RNLSP Envo del segundo panel a los x Laboratorios Estatales de la Red de EFES Recepcin de resultados del Panel en x el InDRE Envo de resultados a la x RNLSP
BIBLIOGRAFA 1. Organizacin Panamericana de la Salud. Organizacin Mundial de la Salud. Manual de procedimientos para la serotipificacin de V. cholerae. Washington, D. C. 2004. 2. Centros para el Control y la Prevencin de Enfermedades: Centro Nacional para las Enfermedades Infecciosas y Organizacin Mundial de la Salud, Enfermedades Transmisibles: Vigilancia y Respuesta. Manual de Laboratorio para la Identificacin y Prueba de Susceptibilidad a los antimicrobianos de Patgenos Bacterianos de Importancia para la Salud Pblica en el Mundo en Desarrollo. Atlanta, Georgia: CDC; 2004. 3. Organizacin Panamericana de la Salud. Organizacin Mundial de la Salud. Manual de procedimientos para la serotipificacin de Salmonella y Shigella. Washington, D. C. 2004. 4. Antigenic Formulae Of The Salmonella Serovars, 2007, 9th edition WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella Patrick A.D. Grimont, Franois-Xavier Weill, Institute Pasteur, 28 rue du Dr. Roux, 75724 Paris Cedex 15, France. 5. Ewing, W.H, Edwards and Ewing's Identification of Enterobacteriaceae, 4th Edition. Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York 1986:135-172. 6. Aidara A. Koblavi S, Boye CS, Raphenon G, Gassama A, Girmoni E, Grimont PAD. Phenotypic and genotypic characterization of Vibrio cholerae isolates from a recent outbreak in Senegel: Comparison with isolates from Guinea-Bissau. Am J Trop Med Hyg 1988; 58: 163-7.
7. Fields PI, Popovic T, Wachsmuth K, Olsvik O, 1992. Use of Polymerase Chain Reaction for Detection of Toxigenic Vibrio cholerae O1 strains from the Latin American cholera epidemic. J Clin Microbiol 30: 2118-2121. 8. Albert M, Islam D, Nahar S, Qadri F, Falklind S, Weintraub A, 1997. Rapid Detection of Vibrio cholerae O139 Bengal from Stool Specimens by PCR. J Clin Microbiol 35: 16331635. 9. Raja N, Nor-Shamsudin M, Somarny W, Rosli R, Rahim RA, Radu S, 2001. Detection and molecular characterization of the zot gene in Vibrio cholerae and V. alginolyticus isolates. Southeast Asian J Trop Med Public Health 32: 100-104. 10. Sarkar A, Nandy RN, Nair BG, Ghose AC, 2002. Vibrio Pathogenicity Island and Cholera Toxin Genetic Element-Associated Virulence Genes and Their Expression in Non-O1 NonO139 Strain of Vibrio cholera. American Society for Microbiology 70: 4735-4742. 11. Cabrera-Garca ME, Vzquez-Salinas C, Quiones-Ramrez EI, Serologic and Molecular Characterization of Vibrio parahaemolyticus Strains Isolated from Seawater and Fish Products of the Gulf of Mexico, 2004. American Society for Microbiology 70: 6401-6406. 12. Tadaa J, Ohashia T, Nishimuraa N, Shirasakia Y, Ozakia H, Fukushima S, Takanoa J, Nishibuchib M, Takedab Y. Detection of the thermostable direct hemolysin gene (tdh) and the thermostable direct hemolysin-related hemolysin gene (trh) of Vibrio parahaemolyticus by polymerase chain reaction. Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Kyoto University. 1992. 13. Vibrio cholerae and Cholera molecular to global perspectives, Edited by I. Kaye Wachsmuth, Paula Blake and Orjan Olsvik. ASM PRESS, Washington D.C. American Society for Microbiology, 1994. 14. Miller MJ, et al. Guidelines for safe work practices in human and animal medical diagnostic laboratories. MMWR Surveill Summ. 6; 61:1-102; 2012. 15. Guidelines for Biosafety Laboratory Competency. MMWR. Supplement / Vol. 60; 2011. 16. World Health Organization. Guidance on regulations for the Transport of Infectious Substances 2013-2014; Geneva: WHO Press; 2012. 17. Chosewood C & Wilson DE. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 5th ed. CDC-NIH; 2009. 18. European Committee for Standardization. CWA 15793:2011 Laboratory biorisk management standard. Brussels: CEN; 2011. 19. World Health Organization. Laboratory Biosafety Manual 3rd ed. Geneva: WHO Press; 2004.
ANEXO 1. TCNICAS DIAGNSTICAS 1. Aislamiento e identificacin de Vibrio cholerae y Vibrio parahaemolyticus 1.1. Principio del mtodo
El mtodo se fundamenta en la capacidad de Vibrio spp para crecer en medios alcalinos y de sus diferentes capacidades metablicas para descarboxilar aminocidos como la lisina, ornitina y arginina; fermentar azcares como sacarosa, lactosa y glucosa; producir indol a partir del triptfano; de ser mvil y poseer la enzima citocromo oxidasa. La serotipificacin de Vibrio cholerae se fundamenta en la deteccin de antgenos especficos del lipopolisacrido bacteriano a travs de una reaccin antgeno-anticuerpo. 1.2. Sistema de muestra primaria
Muestra de materia fecal o cepas de Vibrio spp. 1.3. Tipo de contenedor y aditivos
La muestra de materia fecal deber recolectarse con hisopo de algodn (hisopo rectal o hisopo fecal) e introducirse en un tubo con medio de transporte de Cary Blair; las cepas de Vibrio spp debern estar sembradas en un medio de cultivo de soporte (base de agar sangre). 1.4.

Equipos Incubadora a 36 +1 C Refrigerador de 4 a 8 C Lmpara de luz blanca Termmetro de -5 a 15 C Termmetro de 20 a 50 C
1.5.

Materiales Mechero Bunsen, cuadro bsico nmero 533.604.0042 Manguera de ltex para la conexin del gas al mechero, cuadro bsico nmero 080.909.5383 Asas de nicromel con punta recta, cuadro bsico nmero 537.085.0018 Placa Petri de 100 x 15 mm cuadro bsico nmero 080.148.0120 Tubo de 16 x150 mm con tapn de rosca de baquelita Tubo de 13 x 100 mm con tapn de rosca de baquelita Gradillas para 72 tubos, cuadro bsico nmero 533.461.0507 Pipetas graduadas de vidrio de 5 mL, cuadro bsico nmero 080.709.2606 Portaobjetos 12 x 75 x 0.8 mm, cuadro bsico nmero 080.729.0010 Aplicadores de madera sin algodn, cuadro bsico nmero 060.082.0054
Jeringa desechable para tuberculina de 1 mL, cuadro bsico nmero 060.550.0636 Bulbo de seguridad de tres vas Gasa simple, cuadro bsico nmero 060.436.0669 Pinzas de diseccin de acero inoxidable, de 12.7 cm. cuadro bsico nmero 535.701.0056 Pizeta con solucin desinfectante de hipoclorito de sodio dilucin 1:100 (1%) Frasco con solucin salina formalinizada 0.6%
1.6.

Reactivos y material biolgico Agar tiosulfato citrato bilis sacarosa (TCBS), cuadro bsico nmero 080.610.2448, 30 mL en placa Petri. Base de agar sangre (BAB), cuadro bsico nmero 080.610.1200, 4.0 mL de medio inclinado en tubo de 13 x 100 mm con tapn de hule. Base de agar sangre (BAB), cuadro bsico nmero 080.610.1200, 30 mL de medio en placa Petri. Medio de movilidad indol ornitina (MIO), cuadro bsico nmero 080.610.1770, 4.0 mL de medio sin inclinar en tubo de 13 x 100 mm con tapn de rosca. Agar de hierro y triple azcar (TSI), cuadro bsico nmero 080.610.2364, 4.0 mL de medio inclinado en tubo de 13 x 100 mm con tapn de rosca. Agar de hierro y lisina (LIA), cuadro bsico nmero 080.610.0269, 4.0 mL de medio inclinado en tubo de 13 x 100 mm con tapn de rosca. Peptona de casena, cuadro bsico nmero 080.610.1879, cloruro de sodio, cuadro bsico nmero 080.830.0677, para preparar agua peptonada alcalina pH 9 (APA) 10 mL en tubo de 16x150 mm con tapn de rosca. Peptona de casena, cuadro bsico nmero 080.610.1879, cloruro de sodio, cuadro bsico nmero 080.830.0677, para preparar caldo peptonado (CP), 4 mL.0 en tubo de 13x100 mm con tapn de rosca. Base descarboxilasa de Meller, cuadro bsico nmero 080.610.2455, L-arginina, cuadro bsico nmero 080.832.4107, para preparar caldo arginina 4.0 mL en tubo de 13x100 mm con tapn de rosca. Reactivo de Kovac, cuadro bsico nmero 080.783.1557. Reactivo de oxidasa, cuadro bsico nmero 080.889.0172. Vaselina lquida. Cloruro de sodio, cuadro bsico nmero 080.830.0677. Formaldehido, cuadro bsico nmero 080.830.1311. Hipoclorito de sodio. Agua destilada. Todos los medios de cultivo se deben preparar siguiendo las especificaciones del fabricante. Suero polivalente Vibrio cholerae O1. Suero monovalente Vibrio cholerae Inaba. Suero monovalente Vibrio cholerae Ogawa. Pasos del mtodo
1.7.
Aislamiento La muestra de materia fecal debe ser fresca y estar en medio de transporte de Cary-Blair y deber ser procesada lo antes posible una vez que llega al laboratorio. Depositar el hisopo del Cary-Blair en tubo de Agua Peptonada Alcalina (APA), incubar a 36 +1 C durante 6-8 h. Con una asa redonda previamente quemada y enfriada en el agar depositar 3 asadas de la superficie del APA en una placa de agar TCBS, sembrar por estra cruzada sin quemar el asa entre cuadrantes. Incubar a 36+1 C durante 18 a 24 h. Las cepas de origen clnico, alimentos o ambientales para referencia o control de calidad se siembran directo en agar TCBS por estra cruzada quemando el asa entre el primer o segundo cuadrante. Incubar a 36+1 C durante 18 a 24 h. Identificacin Seleccionar del agar TCBS colonias, sacarosa positivas (colonias amarillas, planas de 2 mm, generalmente pegajosas) y/o sacarosas negativas (colonias verdes, de 2 mm, generalmente pegajosas). Quemar una asa en punta y enfriar en un extremo de la placa donde no haya crecimiento, tomar la colonia sin extender en el agar (con esta nica colonia se siembran todas las pruebas bioqumicas), inocular en tubo de caldo arginina (CA) y caldo peptonado (CP), depositando el inculo, MIO picadura hasta el fondo, TSI, LIA y tubo de BAB, picadura hasta el fondo y estra en la superficie (las bioqumicas que se utilicen para identificar las colonias verdes se deben adicionar con 1% de cloruro de sodio; adicionalmente se deben sembrar caldos nutritivos con 0%, 1%, 3%, 6%, 8% y 10% de cloruro de sodio. Sellar con vaselina lquida estril el caldo arginina; sembrar tambin una placa de BAB por estra cerrada. Incubar a 36+1 C durante 18 a 24 h. De la placa de BAB hacer la prueba de oxidasa, depositar un inculo con asa desechable o aplicador de madera en la zona reactiva de la tira o en el papel impregnado con el reactivo, leer el resultado en un tiempo mximo de 10 segundos. Antes de leer las pruebas bioqumicas agregar 0.5 mL de reactivo de Ehrlich o Kovac en el caldo peptonado, interpretar los resultados de las pruebas bioqumicas utilizando la tabla 1, e identificar el patrn bioqumico de V. cholerae o V. parahaemolyticus con la tabla 2. Serotipificacin Si bioqumicamente se identific Vibrio cholerae, realizar la serotipificacin a partir de la placa de BAB. En un portaobjetos limpio y desengrasado depositar 5 gotas de solucin salina formalinizada en el extremo superior del portaobjetos, separadas lo suficiente para evitar que se mezclen. En el extremo inferior colocar una gota de solucin salina (testigo negativo), una gota de suero polivalente Vibrio cholerae O1, una gota de suero monovalente Vibrio cholerae O1 Ogawa, una gota de suero monovalente Vibrio cholerae O1 Inaba y una gota de suero monovalente Vibrio cholerae O: 139. Con un asa estril o aplicador de madera tomar crecimiento de la placa de BAB y depositar en cada una de las gotas de solucin salina formalinizada, mezclar las gotas de suspensin con cada antisuero, agitar por 1 minuto e interpretar. Registrar los resultados.
1.8.
Interpretacin por laboratorio
Para emitir un resultado positivo a Vibrio cholerae O1 (Ogawa o Inaba), N O1 u O139 de una muestra procesada, se considera la identificacin bioqumica que debe corresponder al patrn bioqumico de dicha especie, as como los resultados de serotipificacin del antgeno somtico. Para emitir un resultado positivo a Vibrio parahaemolyticus de una muestra procesada, se considera la identificacin bioqumica que debe corresponder al patrn bioqumico de dicha especie. Un resultado negativo corresponde a la ausencia de Vibrio cholerae y Vibrio parahaemolyticus en la muestra fecal o cepa recibida. Realizar pruebas moleculares a las cepas identificadas como Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae O1 y Vibrio cholerae O139. 1.9. Medidas de bioseguridad
El nivel de bioseguridad requerido es nivel 2 por lo que se recomienda: Usar bata de laboratorio blanca, limpia y abotonada, esta vestimenta no debe ser usada fuera de las reas de trabajo. Limpiar y desinfectar la mesa de trabajo antes y despus de procesar muestras. Mantener cerrada la puerta del laboratorio. Lavarse las manos antes y despus de trabajar. No hablar, estornudar ni toser durante el sembrado de la muestra. No pipetear directamente con la boca. 2. PCR punto final para la deteccin de cepas toxignicas de Vibrio cholerae 2.1. Principio del mtodo
La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es una tcnica mediante la cual se replican de forma exponencial miles de copias de un gen o segmento de ADN especfico. Esta tcnica molecular utiliza dos iniciadores (oligonucletidos) especficos y complementarios a la secuencia buscada en la bacteria y consiste en separar con calor ambas cadenas de ADN, posteriormente cada iniciador se hibrida complementariamente a una cadena de DNA, interviniendo en ese momento la ADN polimerasa que utiliza los desoxioligonucleotidos (dNTPs) presentes para sintetizar a su vez dos cadenas complementarias a las del molde. Este proceso se repite varias veces, hasta obtener cantidades detectables y visibles del ADN presente originalmente en las muestras. 2.2. Sistema de muestra primaria
Cultivo puro de Vibrio cholerae O1 o Vibrio cholerae O139. 2.3. Tipo de contenedor y aditivos
Las cepas deben estar sembradas por aislamiento en medio de Agar Base Sangre sin aditivos.
2.4.

Equipo Termociclador-PCR Gabinete de bioseguridad tipo II clase 2A Cabina para PCR Cmara de electroforesis horizontal Fotodocumentador Fuente de poder Congelador vertical Refrigerador vertical Termoagitador Sistema de purificacin de agua Balanza analtica Aire acondicionado Materiales Micropipetas de: 1-10, 2-20, 20-200 y 100-1000 L Micropipeta Guantes de nitrilo Tubos tipo eppendorf de: 0.2, 0.5 y 1.5 mL Puntas para micropipeta de: 10, 200 y 1000 L Tubos para centrifuga de: 50 mL Pipetas desechables de 5.0 y 10 mL Marcadores indelebles Gradillas para tubos eppendorf Bolsas de polipropileno Contenedores para desecho de puntas Gasas
2.5.

2.6.
Reactivos y material biolgico Fabricante Roche Roche Applied biosystems Applied biosystems Applied biosystems Applied biosystems Applied biosystems Applied biosystems Applied biosystems Applied biosystems Applied biosystems
Reactivos y materiales biolgicos dNTPs (A, T, C, G) 100M Taq polimerasa 5U/L CTX2 5 CGG GCA GAT TCT AGA CCT CCT G 3 (1,2) CTX3 5 CGA TGA TCT TGG AGC ATT CCC AC 3 (1,2) CTX7 5 GGT TGC TTC TCA TCA TCG AAC CAC 3' (5) CTX9 5 GAT ACA CAT AAT AGA ATT AAG GAT 3' (5) ACE1 5-TAA GGA TGT GCT TAT GAT GGA CAC CC 3 (1) ACE2 5-CGT GAT GAA TAA AGA TAC TCA TAG-3 (1) ZOT1 5 TGG CTT CGT CTG CTG CCG GCG ATT 3' (1,4) ZOT2 5 CAC TTC TAC CGA CAG CGC TTG CG 3' (1,4) 1-39Vc 5 GCG TTA TAG GTA TCA TCA AGA GA 3 (3)
2-39Vc 5 GTC ATT ATT AAA ACT GCT CCA TT 3 (3) MgCl2, 25mM Regulador 10 X Solucin amortiguadora TBE Agarosa Bromuro de etidio Agua destilada y desionizada Marcador de peso molecular Naranja de acridina Alcohol etlico al 70%
Applied biosystems Applied biosystems Applied biosystems Sigma MILLIPORE
2.7.
Pasos del mtodo
Re-suspender una colonia de una cepa aislada y caracterizada como Vibrio cholerae en 200 L de agua destilada para obtener el ADN molde. Hervir la suspensin durante 15 minutos e inmediatamente colocar en bao de hielo. Consideraciones antes de iniciar la PCR Antes de empezar a trabajar descontaminar el gabinete de bioseguridad. Usar el equipo de seguridad. Mantener las suspensiones de las muestras en hielo listas para PCR. Descongelar previamente los reactivos para PCR. Rotular los tubos de acuerdo al nmero y tipo de muestra a trabajar. Preparacin de la mezcla de reaccin. La mezcla de reaccin se prepara en el REA BLANCA del laboratorio. El volumen de los reactivos se calcular de acuerdo al nmero de muestras a analizar, siguiendo el formato de trabajo para PCR. Una vez preparada la mezcla de reaccin, homogenizar suavemente con pipeta aproximadamente 30 veces (aspirando y expulsando con ayuda de la pipeta), finalmente adicionar 22 L de esta mezcla en el fondo de cada tubo. En el REA DE TEMPLADOS, adicionar 3.0 L del ADN extrado de cada muestra en el tubo correspondiente.
Formato de trabajo para PCR REACTIVOS H2O Reg 10X MgCl2 25mM dNTPs 1M Iniciador 1 (ctx 2, ctx 7, ace 1, zot 1, 1-39Vc) Iniciador 2(ctx 3, ctx 9, ace 2, zot 2, 2-39Vc) VOLUMEN (L) 9.35 2.5 4.0 4.0 1.0 1.0
Taq 5U/L ROCHE ADN Programa 94oC1 min 94oC30 s 55oC30 s 72oC1 min 72oC2 min
0.15 3.0
1 ciclo 35 ciclos 1 ciclo
Controles En el REA DE CONTROLES adicionar 3.0 L de control positivo y negativo respectivamente. Control negativo: Colocar una muestra de ADN confirmada como negativa a V. cholerae. Control positivo: Colocar ADN extrado de una cepa caracterizada como V. cholerae O139 toxignica bajo el resguardo del InDRE. Control de reactivos: utilizar 3.0 L de agua inyectable o calidad Milli-Q. NOTA: Asegurarse de que todos los tubos queden bien tapados para evitar que el contenido se evapore. Colocar los tubos en el termociclador, seleccionar el programa para Vibrio cholerae y dar inicio a la corrida. Los productos de ADN obtenidos se someten a 120 V por 30 minutos a electroforesis en un gel de agarosa al 2% en regulador Tris-EDTA-cido actico. Finalizada la electroforesis evidenciar la presencia de las bandas (productos) con luz UV. 2.8. Interpretacin por laboratorio
Presencia de una banda de aproximadamente 564 pb indica la presencia del gen de la subunidad A de la toxina colrica. Presencia de una banda de aproximadamente 460 pb indica la presencia del gen de la subunidad B de la toxina colrica. Presencia de una banda de aproximadamente 314 pb indica la presencia del gen de la toxina accesoria ace. Presencia de una banda de aproximadamente 1083 pb indica la presencia del gen de la toxina accesoria zot. 2.9.
Medidas de bioseguridad Todas las muestras y controles deben manejarse como potencialmente infecciosos y analizarse en un laboratorio de bioseguridad Nivel 2 (BSL-2) dentro de un gabinete de bioseguridad tipo II 2A. El analista debe usar equipo de proteccin personal, bata (una para cada rea del proceso), guantes desechables (un par para cada proceso) y lentes de seguridad. Disponer de los contenedores y bolsas correspondientes para los desechos de Residuos Peligrosos Biolgico-Infecciosos (RPBI) en cada rea.
Descontaminar las micropipetas, gabinetes y cabinas antes y despus de trabajar con etanol al 70% o benzal-metanol 1:1 v/v. Todo el material a utilizar deber ser estril. El personal que realice la electroforesis no podr hacer mezcla para PCR en la misma jornada. El rea limpia o REA BLANCA est libre de toda contaminacin por ADN por lo que solo podrn manejarse reactivos. El REA DE TEMPLADOS ser la nica en donde se podrn abrir los tubos que contienen el DNA de las muestras. El REA DE CONTROLES ser la nica permitida para la colocacin del ADN control. Solo en el REA SUCIA o de electroforesis se podrn abrir los tubos con cADN y cargarse en los geles. Cada rea deber estar separada fsicamente para evitar contaminaciones. Es muy importante que cada rea cuente con su propio material (puntas, guantes, agua, etc.), y ste no deber compartirse entre reas. Los equipos debern descontaminarse antes de una reparacin, mantenimiento o antes de ser removidos del laboratorio. El analista debe lavar sus manos antes y despus de trabajar. La prueba se realizar en un laboratorio entre 18-25 C. Las diferentes reas debern estar separadas y selladas para evitar el paso de aire con polvo y evitar as la contaminacin.
3. PCR punto final para la deteccin de genes de patogenicidad en cepas de Vibrio parahaemolyticus 3.1. Principio del mtodo
Como ya se mencion, la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es una tcnica mediante la cual se replican de forma exponencial miles de copias de un gen o segmento de ADN especfico. Esta tcnica molecular utiliza dos iniciadores (oligonucletidos) especficos y complementarios a la secuencia buscada en la bacteria y consiste en separar con calor ambas cadenas de ADN, posteriormente cada iniciador se hibrida complementariamente a una cadena de ADN, interviniendo en ese momento la ADN polimerasa que utiliza los desoxioligonucleotidos (dNTPs) presentes para sintetizar a su vez dos cadenas complementarias a las del molde. Este proceso se repite varias veces, hasta obtener cantidades detectables y visibles del ADN presente originalmente en las muestras. 3.2. Sistema de muestra primaria
Cultivo puro de Vibrio parahaemolyticus 3.3. Tipo de contenedor y aditivos
Las cepas deben estar sembradas por aislamiento en medio de Agar Base Sangre sin aditivos.
3.4.

Equipo Termociclador Gabinete de bioseguridad tipo II clase 2A Cabina para PCR Cmara de electroforesis horizontal Fotodocumentador Fuente de poder Congelador vertical Refrigerador vertical Sistema de purificacin de agua Balanza analtica Aire acondicionado Horno de microondas Materiales Micropipetas de: 1-10, 2-20, 20-200 y 100-1000 L Guantes desechables Tubos tipo eppendorf de: 0.2, 0.5 y 1.5 mL Puntas para micropipeta de: 10, 200 y 1000 L Tubos para centrifuga de 50 mL Pipetas desechables de 5 y 10 mL Marcadores indelebles Gradillas para tubos eppendorf Bolsas de polipropileno Contenedores para desecho de puntas Gasas Reactivos y material biolgico Marca Roche Roche Applied biosystems Applied biosystems Applied biosystems Applied biosystems Applied biosystems Applied biosystems Sigma MILLIPORE
3.5.

3.6.
Reactivos y Materiales biolgicos dNTPs (A, T, C, G) 100M Taq polimerasa 5U/L Tdh1 5'-GGT ACT AAA TGG CTG ACA TC-3' (1,2) Tdh2 5'-CCA CTA CCA CTC TCA TAT GC-3' (1,2) Trh1 5'-GGC TCA AAA TGG TTA AGC G-3' (1,2) Trh2 5'-CAT TTC CGC TCT CAT ATG C-3' (1,2) MgCl2, 25mM Regulador 10 X Solucin amortiguadora TBE Agarosa Bromuro de etidio Agua destilada y desionizada Marcador de peso molecular
Naranja G Alcohol etlico al 70%
3.7.
Pasos del mtodo
Resuspender una colonia de la cepa aislada y caracterizada como Vibrio parahaemolyticus en 200 L de agua destilada. Hervir 15 minutos la suspensin e inmediatamente colocar en bao de hielo. Consideraciones antes de iniciar la PCR

Antes de empezar a trabajar descontaminar el gabinete de bioseguridad utilizando el sanitizante asignado. Colocarse el equipo de seguridad. Mantener las suspensiones de las muestras en hielo listas para la PCR. Descongelar previamente los reactivos para la PCR. Rotular los tubos de acuerdo al nmero y tipo de muestra a trabajar.
Preparacin de la mezcla de reaccin

Esta se har en el REA BLANCA del laboratorio. El volumen de los reactivos se calcular de acuerdo al nmero de muestras a diagnosticar, siguiendo el formato de trabajo para PCR. Una vez preparada la mezcla de reaccin homogenizar suavemente con la pipeta (aspirando y expulsando con ayuda de la pipeta) aproximadamente 30 veces, finalmente adicionar 22 L de esta mezcla en el fondo de cada tubo. En el REA DE TEMPLADOS, adicionar 3.0 L del DNA extrado de cada muestra en el tubo correspondiente.
Formato de trabajo para PCR de Vibrio parahaemolyticus Reactivos H2O Reg 10X MgCl2 25mM dNTPs 1M tdh 1 1:80 tdh 2 1:80 Taq 5U/L DNA Volumen (L) 4.35 2.5 10 3 1 1 0.15 3 Reactivos H2O Reg 10X MgCl2 25mM dNTPs 1M trh 1 1:80 trh 2 1:80 Taq 5U/L DNA Volumen (L) 12.35 2.5 2 3 1 1 0.15 L 3
Programa 1 ciclo 94o C1 min 94o C20 s 25 ciclos 55o C20 s 72o C30 s 1 ciclo 72o C-2 min Controles En el REA DE CONTROLES, adicionar 3.0 L de control positivo y negativo respectivamente en el tubo que corresponda. Control negativo para tdh: Colocar una muestra de ADN confirmada como V. parahaemolyticus trh positivo. Control negativo para trh: Colocar una muestra de ADN confirmada como V. parahaemolyticus tdh positivo. Control positivo para tdh: Colocar una muestra de ADN confirmada como V. parahaemolyticus tdh positivo. Control positivo para trh: Colocar una muestra de ADN confirmada como V. parahaemolyticus trh positivo. Control de reactivos: utilizar 3.0 L de agua inyectable o agua calidad Milli-Q. NOTA: Asegurarse de que todos los tubos queden bien tapados, para evitar que el contenido se evapore. Colocar los tubos en el termociclador, seleccionar el programa para Vibrio parahaemolyticus y dar inicio a la corrida. Los productos de ADN obtenidos se someten a 120 V por 30 minutos a electroforesis en un gel de agarosa al 2% en regulador Tris-EDTA-cido actico. Finalizada la electroforesis evidenciar la presencia de las bandas (productos) con luz UV. 3.8. Interpretacin por laboratorio Positivo:
Presencia de una banda de aproximadamente 251 pb indica la presencia del gen tdh que codifica para la hemolisina termoestable directa. Presencia de una banda de aproximadamente 250 pb indica la presencia del gen trh que codifica para la termolisina relacionada a la directa. Negativo: Ausencia de los genes que codifican para las termolisinas, ausencia de bandas tdh (251 pb) y trh (250 pb). 3.9. Medidas de bioseguridad
Todas las muestras y controles deben manejarse como potencialmente infecciosos y trabajarse en un Laboratorio de Bioseguridad Nivel 2 (BSL-2) dentro de un gabinete de bioseguridad tipo II 2A. El analista debe usar su equipo de proteccin personal, bata (una para cada rea del proceso), guantes desechables (un par para cada proceso) y lentes de seguridad. Disponer de los contenedores y bolsas correspondientes para los desechos RPBI en cada rea. Descontaminar las micropipetas, gabinetes y cabinas antes y despus de trabajar con etanol al 70% o benzal-metanol 1:1 v/v. Todo el material a utilizar deber estar estril. El personal que realice la electroforesis no podr hacer mezcla para PCR en la misma jornada. El rea limpia o REA BLANCA est libre de toda contaminacin por ADN por lo que solo podrn manejarse reactivos. El REA DE TEMPLADOS ser la nica en donde se podrn abrir los tubos que contienen el DNA de las muestras. El REA DE CONTROLES ser la nica permitida para la colocacin del ADN control. Solo en el REA SUCIA o de electroforesis se podrn abrir los tubos con cADN y cargarse en los geles. Cada rea deber estar separada fsicamente para evitar contaminaciones. Es muy importante que cada rea cuente con su propio material (puntas, guantes, agua, etc.) y ste no deber compartirse entre reas. Los equipos debern descontaminarse antes de una reparacin, mantenimiento o antes de ser removidos del laboratorio. El analista debe lavar sus manos antes y despus de trabajar. La prueba se realizar en un laboratorio entre 18-25 C. Las diferentes reas debern estar separadas y selladas para evitar el paso de aire con polvo y evitar as la contaminacin. 4. Produccin de toxina colrica En toda cepa aislada de Vibrio cholerae O1 se determina su capacidad para producir toxina colrica a travs de la tcnica de ELISA descrita en el Manual de Tcnicas de Laboratorio Vol. I, 1995 del InDRE.
Se preparan placas sensibilizadas con el receptor GM1 y se agrega el sobrenadante del cultivo donde podra estar la toxina. La presencia de interaccin receptor-toxina se determina agregando un anticuerpo de conejo antitoxina. La reaccin se pone en evidencia al adicionar anticuerpos contra las inmunoglobulinas de conejo conjugados a una enzima. Al agregar el sustrato especfico el desarrollo de color significa que el cultivo de prueba es productor de toxina colrica.
5. Diferenciacin de Vibrio cholerae O1 en biotipos Clsico o el Tor Despus de identificar el grupo y el serotipo, se procede a la caracterizacin del biotipo (Clsico o El Tor). Se siembra la cepa en BAB y se incuba 24 h a 36 + 1 C. Se realizan las pruebas siguientes que se interpretan de acuerdo con lo que se indica. Reaccin Biotipo Classical El tor Vp (modificado con 1% NaCl) N P Inhibicin de crecimiento polimixina b (50 u) P N Hemlisis N P Aglutinacin de eritrocitos de pollo o carnero N P
6. Aislamiento, identificacin y serotipificacin de Salmonella spp y Shigella spp. 6.1. Principio del mtodo
El mtodo se fundamenta en el uso de tcnicas bacteriolgicas de aislamiento e identificacin de las propiedades fenotpicas de Salmonella y Shigella, as como en la tcnica inmunolgica de aglutinacin en placa para ambos gneros y aglutinacin en tubo para Salmonella. 6.2. Sistema de muestra primaria Muestra de materia fecal o cepas de Salmonella spp y Shigella spp. 6.3. Tipo de contenedor y aditivos La muestra de materia fecal deber recolectarse con hisopo de algodn (hisopo rectal o hisopo fecal) e introducirse en un tubo con medio de transporte de Cary Blair. Las cepas de Salmonella spp y Shigella spp deben sembrarse en un medio de cultivo de soporte.
6.4.

Equipo Incubadora a 36 + 1 C Refrigerador a 4 a 8 C Agitador vortex Lmpara de luz blanca
Bao Mara a 50 + 1 C Termmetro de -10 a 100 C Termmetro de -5 a 15 C Termmetro de 15 a 50 C Materiales Mechero Bunsen, cuadro bsico nmero 533.604.0042 Manguera de ltex para la conexin del gas al mechero, cuadro bsico nmero 080.909.5383 Asas de nicromel con punta redonda, cuadro bsico nmero 537.085.0018 Asas de nicromel con punta recta, cuadro bsico nmero 537.085.0018 Placa Petri de 100 x 15 mm, cuadro bsico nmero 080.148.0120 Tubo de 16 x150 mm, con tapn de rosca de baquelita Tubo de 13 x 100 mm, con tapn de rosca de baquelita Gradillas para 72 tubos cuadro, bsico nmero 533.461.0507 Pipetas graduadas de vidrio de 5.0 mL, cuadro bsico nmero 080.709.2606 Pipetas graduadas desechables de 1.0 o 2.0 mL, cuadro bsico nmero 080.709.0311 o 080.709.0329 Tubo de vidrio de 12x75 mm, cuadro bsico nmero 080.909.0525 Portaobjetos de 25 x75 x0.8 mm, cuadro bsico nmero 080.729.0010 Aplicadores de madera cuadro bsico nmero 060.082.0054 Vaso de precipitados de vidrio de 500 mL, cuadro bsico nmero 080.951.0639 Tubo cnico de polipropileno para centrfuga de 50 mL, cuadro bsico nmero 080.909.1648 Placa Petri de 60x15 mm, cuadro bsico nmero 080.148.0195 Jeringa desechable para tuberculina de 1.0 mL, cuadro bsico nmero 060.550.0636 Unidad de filtracin tipo pirinola para jeringa desechable con membrana de acetato de celulosa de 0.22 micras, cuadro bsico nmero 080.421.0714 Contenedor para RPBI punzocortantes de 3.70 a 4.75 L, cuadro bsico nmero 060.218.0093 Bulbo de seguridad de tres vas Gasa simple, cuadro bsico nmero 060.436.0669 para limpieza de mesas Tripie de acero fundido, cuadro bsico nmero 533.898.0021 Pinzas de diseccin de acero inoxidable de 12.7 cm, cuadro bsico nmero 535.701.0056 Contenedor plstico con solucin desinfectante de hipoclorito de sodio dilucin 1:10 (10%) Pizeta con solucin desinfectante de hipoclorito de sodio dilucin 1:100 (1%) Frasco con solucin salina formalinizada 0.6%
6.5.

6.6.
Reactivos y material biolgico
Reactivos
Base de agar sangre (BAB), cuadro bsico nmero 080.610.1200, 4.0 mL de medio inclinado en tubo de 13 x 100 mm con tapn de hule. Base de agar sangre (BAB), cuadro bsico nmero 080.610.1200, 30 mL de medio en placa Petri. Agar Mac Conkey, cuadro bsico nmero 080.610.1531, 30 mL de medio en placa Petri. Agar verde brillante, cuadro bsico nmero 080.610.2497, 30 mL de medio en placa Petri. Agar sulfito de bismuto, cuadro bsico nmero 080.610.0574, 30 mL de medio en placa Petri. Medio de movilidad indol ornitina (MIO), cuadro bsico nmero 080.610.1770, 4.0 mL de medio sin inclinar en tubo de 13 x 100 mm con tapn de rosca. Agar de hierro y triple azcar (TSI), cuadro bsico nmero 080.610.2364, 4.0 mL de medio inclinado en tubo de 13 x 100 mm con tapn de rosca. Agar de hierro y lisina (LIA), cuadro bsico nmero 080.610.0269, 4.0 mL de medio inclinado en tubo de 13 x 100 mm con tapn de rosca. cido msico, peptona de casena cuadro bsico nmero 080.610.1879 y azul de bromotimol, cuadro bsico nmero 080.830.4893, para preparar caldo mucato 4.0 mL de medio en tubo de 13 x 100 mm con tapn de rosca. L-sorbitol, peptona de casena, cuadro bsico nmero 080.610.1879, 4.0 mL de medio en tubo de 13 x 100 mm con tapn de rosca. Rojo de fenol, cuadro bsico nmero 080.830.3408. Cloruro de sodio, cuadro bsico nmero 080.830.0677, 4.0 mL de medio en tubo de 13 x 100 mm con tapn de rosca. Caldo malonato, cuadro bsico nmero 080.610.9559, 4.0 mL de medio en tubo de 13 x 100 mm con tapn de rosca. Base agar urea de Christensen, cuadro bsico nmero 080.610.1432, agar, cuadro bsico nmero 080.610.8254 para preparar 4.0 mL de medio inclinado en tubo de 13 x 100 mm con tapn de rosca. Agar citrato de Simmons, cuadro bsico nmero 080.610.7454, 4.0 mL de medio inclinado en tubo de 13 x 100 mm con tapn de rosca. Base caldo tetrationato, cuadro bsico nmero 080.610.2265, 5.0 mL de medio en tubo de 16 x 150 mm con tapn de rosca. Caldo soya tripticasa (TSB), 10 mL de medio en tubo de 16 x 150 mm con tapn de rosca. Caldo infusin cerebro corazn, cuadro bsico nmero 080.610.1317, agar, cuadro bsico nmero 080.610.8254. Reactivo de Kovac, cuadro bsico nmero 080.783.1557. Cloruro de sodio, cuadro bsico nmero 080.830.0677. Formaldehido, cuadro bsico nmero 080.830.1311. Yodo metlico, cuadro bsico nmero 080.830.5304. Yoduro de potasio, cuadro bsico nmero 080.830.5312. Hipoclorito de sodio. Agua destilada.
Todos los medios de cultivo se deben preparar siguiendo las indicaciones del fabricante.
Material biolgico: Antisueros somticos para Salmonella (B, C1, O:6, O:8, O:20, D1, E polivalente [Epol], E1, E2, E3, E4, F, G1, G2, H, I, J, K, L, M, N, O, P, Q, R, S, T, U, W, X, Y, Z, 51 al 67). Antisueros flagelares para Salmonella (f, g, s, h, r, i, 2, v, m, t, 7, z4, z23, b, 5, d, enx, x, z15, z10, k, q, z28, 6, w, z6, y, z13, z24, a, c, p, z29, z32, z51, z41). Antisuero somtico polivalente Shigella dysenteriae (A1-7). Antisuero somtico polivalente Shigella flexneri (B1-6). Antisuero somtico polivalente Shigella boydii (A1-7). Antisuero somtico monovalente Shigella sonnei I. Antisuero somtico monovalente Shigella sonnei II. Antisueros somticos monovalentes para Shigella A (1-15), B (1-6), C (1-18). Todos los antisueros son hidratados y diluidos como se indica en los marbetes de los viales y se conservan a temperatura de refrigeracin de 4 a 8 C. 6.7. Pasos del mtodo
Aislamiento La muestra de materia fecal deber ser procesada lo antes posible una vez recibida en el laboratorio. Si la muestra de materia fecal viene en envase estril, tomar un poco de heces con un hisopo de algodn estril y hacer una impronta en un cuadrante de agar Mac Conkey, si la muestra est en medio de transporte de Cary-Blair, extraer el hisopo y hacer una impronta en un cuadrante de agar Mac Conkey. Sembrar por estra cruzada, quemar y enfriar el asa entre el segundo y el tercer cuadrante. El hisopo con el que se inculo la placa de Mac Conkey se introduce en un tubo con base caldo tetrationato adicionado con 0.2 mL de solucin de yodo. Incubar la placa y el tubo a 36 + 1 C de 18 a 24 h. Las cepas de Salmonella y Shigella para referencia o control de calidad se siembran en agar Mac Conkey por estra cruzada. Incubar las placas a 36 + 1 C de 18 a 24 h. Tomar el hisopo del caldo tetrationato y hacer una descarga en un extremo de una placa de agar verde brillante y en una placa de sulfito de bismuto. La placa de verde brillante se siembra con asa redonda por estra cruzada, quemar y enfriar el asa entre el segundo y el tercer cuadrante. La placa de sulfito de bismuto se siembra con una asa redonda por estra cruzada sin quemar el asa entre cuadrantes. El agar verde brillante se incuba de 18 a 24 h y el agar sulfito de bismuto se incuba durante 48 h, ambos a 36 + 1 C. Identificacin bioqumica
De la placa de agar Mac Conkey, seleccionar colonias lactosa negativas (colonias incoloras, probables Salmonella o Shigella), quemar una asa en punta y enfriar en un extremo de la placa donde no haya crecimiento, tomar una colonia sin extender en el agar y sembrar los siguientes medios: Caldo sorbitol y caldo mucato, depositar inculo; medio MIO, introducir el asa hasta el fondo en posicin vertical; TSI y LIA, picadura hasta el fondo y estriar la superficie; citrato y urea, estriar en la superficie; BAB, picadura hasta el fondo y estriar la superficie del agar.
Incubar los tubos a 36 + 1 C de 18 a 24 h. Antes de leer las pruebas bioqumicas adicionar al medio MIO 0.5 mL de reactivo de Ehrlich o Kovac, interpretar los resultados de las pruebas bioqumicas utilizando la Tabla 1 e identificar los patrones bioqumicos de Salmonella y Shigella con las Tablas 3-5, registrar los resultados. Del agar verde brillante seleccionar colonias lactosa negativas (colonias rojas). Quemar un asa en punta y enfriar en un extremo de la placa donde no haya crecimiento, tomar una colonia sin extender en el agar y sembrar las pruebas bioqumicas como se indic previamente. De la placa de agar de sulfito de bismuto hacer una seleccin de colonias caractersticas a Salmonella, las cuales se observan negras con halo y brillo metlico, tomar una colonia sin extender en el agar y sembrar las pruebas bioqumicas como se indic previamente.
Serotipificacin del antgeno somtico O de Shigella
Si la cepa se identifica bioqumicamente como Shigella, conservar los tubos de TSI y BAB; a partir del crecimiento bacteriano del tubo de TSI sembrar en condiciones de esterilidad una placa de BAB por estra cerrada e incubar de 18 a 24 horas a 36 + 1 C. En un portaobjetos limpio y desengrasado colocar 6 gotas de solucin salina formalinizada (SSF) en el extremo superior separndolas lo suficiente para evitar que las gotas se mezclen; en el extremo inferior del portaobjetos colocar en forma correspondiente una gota de SSF y una gota de cada uno de los siguientes antisueros somticos polivalentes y monovalentes de Shigella A (1-7), B (1-6), C (1-7), DI y DII. Con un asa desechable o aplicador de madera tomar crecimiento de la placa de BAB e ir depositando en cada una de las gotas superiores de SSF para tener una suspensin bacteriana, mezclar cada gota de suspensin con la gota inferior correspondiente utilizando asa desechable o aplicador de madera y evitando contaminacin cruzada. Rotar suavemente el portaobjeto y observar a contra luz una reaccin de aglutinacin utilizando una lmpara de luz blanca, la observacin se hace durante un minuto; despus de ese tiempo la prueba se invalida. Interpretar el resultado usando la Tabla 6. Si la cepa aglutina con cualquiera de los antisueros polivalentes A, B o C; se realiza la prueba de aglutinacin en portaobjetos con los antisueros monovalentes correspondientes al grupo somtico con el cual se observ la aglutinacin. Si la cepa aglutina con los antisueros monovalentes DI o DII, se reportar como Shigella sonnei I Shigella sonnei II. En el caso de que la cepa no aglutine con ninguno de los antisueros polivalentes ni monovalentes sonnei, ser necesario aglutinar con los antisueros monovalentes A (8-15) y C (8-18). Si la cepa no aglutina con ninguno de los antisueros polivalentes o monovalentes en existencia, se reportar como Shigella spp. Cualquiera que sea el resultado de las pruebas serolgicas, ste deber ser registrado.
Serotipificacin del antgeno somtico O de Salmonella
Si se identifica bioqumicamente una cepa como Salmonella, separar los tubos de TSI y BAB; tomar crecimiento del tubo de TSI con un asa de punta estril y sembrar en placa de BAB por estra cerrada para obtener un crecimiento masivo, incubar de 18 a 24 horas a 36 + 1 C. En un portaobjetos limpio y desengrasado colocar 6 gotas de solucin salina formalinizada en el extremo superior separndolas lo suficiente para evitar que se mezclen, en el extremo inferior colocar en forma correspondiente a las gotas superiores una gota de SSF y una gota de cada uno de los antisueros somticos de Salmonella B, C1, O: 8, D y E pol. Con un asa desechable o aplicador de madera tomar crecimiento de la placa de BAB e ir depositando en cada una de las gotas superiores de SSF para tener una suspensin bacteriana, mezclar cada gota de suspensin con la gota inferior correspondiente utilizando un asa desechable o aplicador de madera evitando contaminacin cruzada. Rotar suavemente el portaobjeto y observar a contra luz una reaccin de aglutinacin utilizando una lmpara de luz blanca, la observacin se hace durante un minuto. Interpretar el resultado utilizando la Tabla 6 y reportarlo. Si la cepa aglutina con el antisuero O: 8, aglutinar con los antisueros O: 6 y O: 20; si como resultado de la aglutinacin la cepa aglutina con el antisuero E pol aglutinar con los antisueros E1, E2, E3 y E4. Si el resultado de la aglutinacin es negativo repetir la prueba utilizando los antisueros somticos del grupo F al 67 hasta identificar el grupo somtico al que corresponde la cepa y registrar. Si despus de aglutinar con todos los antisueros somticos en existencia no se logra identificar el grupo somtico, debe hacerse la bsqueda de la especie arizona. Inocular un tubo de caldo malonato con la cepa problema e incubar de 18 a 24 horas a 36 + 1 C. Interpretar el resultado y consultar la Tabla 5. Si la prueba es positiva, reportar como Salmonella arizona. Si la prueba es negativa reportar como Salmonella spp. Serotipificacin del antgeno flagelar H de Salmonella

Inocular la cepa problema identificada bioqumicamente como Salmonella en un tubo con caldo soya tripticasa (TSB), incubar de 18 a 24 horas a 36 + 1 C. Adicionar v/v solucin salina formalinizada (SSF) al tubo de TSB. Dejar reposar a temperatura ambiente de 2 a 24 horas. De acuerdo al grupo somtico de la cepa a probar, consultar la Tabla 9 para identificar los antisueros flagelares de prueba correspondiente a ese grupo. Colocar en una gradilla tubos de 12x75 mm sin labio, marcarlos y depositar 0.1 mL de cada antisuero flagelar, adicionar 0.9 mL de antgeno formalinizado. Incubar los tubos en bao Mara a 50 C por una hora y revisarlos (al sacar las gradillas del bao es importante no sacudirlas ni agitarlas, de lo contrario se podra perder la aglutinacin). Interpretar los resultados utilizando la Tabla 7. Considerando el antgeno somtico y las fases flagelares identificadas, buscar en el esquema de Kauffman-White el serotipo correspondiente y registrar. Si como resultado de la aglutinacin flagelar, se detecta solo una fase flagelar, realizar la tcnica de induccin de fase. Si no se detecta ninguna fase flagelar, realizar un pase en medio GARD para inducir movilidad como se menciona a continuacin.
Poner en bao Mara un tubo de medio GARD, cuando el medio se haya licuado y alcance una temperatura aproximada de 40 C, verterlo en una placa Petri estril y dejar solidificar en condiciones de esterilidad. Con un asa en punta, tomar crecimiento de un cultivo fresco en BAB de la cepa problema e inocular el agar al centro de la placa. Incubar de 18 a 24 horas a 36 + 1 C. Revisar la placa de GARD. Si la bacteria muestra una zona de crecimiento circundante al inoculo, tomar con una asa en punta crecimiento del rea ms lejana al centro de la placa e inocular un tubo de caldo TSB, incubar de 18 a 24 horas a 36 + 1 C. Formalinizar el cultivo de TSB, con solucin salina formalinizada, y realizar la tcnica de aglutinacin flagelar, considerando para ello el grupo somtico de la cepa. Leer aglutinacin, si se detectan las dos fases flagelares, reportar como lo indica el punto 9.5.5. Si solo se detecta una fase flagelar, realizar la tcnica de induccin de fase (ver ms adelante). Si en la placa de GARD no se observa ninguna zona de crecimiento circundante al inculo, reportar el gnero bacteriano y el grupo somtico correspondiente.
Induccin de fase para Salmonella

Sembrar la cepa problema por estra cerrada en medio de BAB. Incubar de 18 a 24 horas a 36 + 1 C. Licuar utilizando bao Mara, un tubo con medio de GARD y dejar enfriar a 40 C aproximadamente. Adicionar en condiciones de esterilidad con jeringa para insulina, 0.1 mL del antisuero concentrado correspondiente a la fase flagelar identificada, agitar en vortex, verter el medio en placa Petri estril y dejar solidificar en condiciones de esterilidad. Con un asa estril en punta, tomar crecimiento de la placa de BAB e inocular la placa de GARD justo al centro. Incubar de 18 a 24 horas a 36 + 1 C. Revisar la placa al trmino de este tiempo o en el intervalo de este tiempo. Si la bacteria muestra una zona de crecimiento circundante al inoculo, tomar con una asa en punta crecimiento del rea ms lejana al centro de la placa e inocular un tubo de caldo TSB, incubar de 18 a 24 horas a 36 + 1 C. Formalinizar el crecimiento del tubo de TSB, empleando solucin salina formalinizada, dejar reposar de 2 a 24 horas. Revisar el esquema de Kauffman-White (4) para seleccionar los antisueros correspondientes a las posibles combinaciones flagelares con la fase ya detectada. Realizar la prueba de aglutinacin flagelar como se indic con anterioridad. Si el resultado de la aglutinacin es la deteccin de la segunda fase flagelar, registrar. Si como resultado de la aglutinacin no se detecta la segunda fase flagelar, reportar la cepa como monofsica. Si se observa nuevamente aglutinacin de la fase inicialmente encontrada es necesario repetir el procedimiento de induccin de fase hasta tres veces, para lo cual se tomar crecimiento de la placa de GARD anterior para inocular la segunda y de la segunda para inocular la tercera. Si como resultado de la ltima aglutinacin, se identifica la segunda fase, registrar; si por el contrario persiste la aglutinacin de la primera fase, reportar la cepa con gnero y grupo
somtico, otra posibilidad es que se logre inhibir la primera fase pero no se expresa la segunda, reportar entonces gnero, grupo somtico y la leyenda monofsica. 6.8. Interpretacin por laboratorio
Para emitir un resultado positivo a Salmonella o Shigella de una muestra procesada, se considera la identificacin bioqumica que debe corresponder a los patrones bioqumicos de dichos gneros, as como a los resultados de serotipificacin de los antgenos somticos para ambos gneros bacterianos y antgenos flagelares de Salmonella. Un resultado negativo corresponde a la ausencia de Salmonella spp y Shigella spp en la muestra fecal o cepa recibida. 6.9. Medidas de bioseguridad
El nivel de bioseguridad es 2 por lo que se recomienda: Usar bata de laboratorio blanca, limpia y abotonada en las reas de trabajo y nunca fuera de ellas. Dejar fuera del laboratorio artculos personales. Mantener cerrada la puerta del laboratorio. Limpiar y desinfectar la mesa de trabajo antes y despus de procesar muestras. Lavarse las manos antes y despus de trabajar. No hablar, toser o estornudar durante la inoculacin y el sembrado de las muestras. Evitar pipetear directamente con la boca (usar bulbo de seguridad). Mantener las manos lejos de la boca, nariz, ojos y cara.
ANEXO 2. INTERPRETACIN Y RESULTADOS DE PRUEBAS BIOQUMICAS

TABLA 1. INTERPRETACIN DE PRUEBAS BIOQUMICAS
PRUEBA POSITIVA Medio turbio, Movilidad crecimiento en todo el medio El reactivo de Ehrlich Produccin de indol o Kovac toma una coloracin roja Descarboxilacin de Color prpura en el ornitina fondo del medio TSI PRUEBA POSITIVA Fermentacin de Fondo del medio glucosa amarillo (A) Fermentacin de Inclinacin del medio lactosa y sacarosa amarillo (A) Burbujas o Produccin de gas rompimiento del medio Precipitado negro en Produccin de H2S el fondo o en todo el medio LIA PRUEBA POSITIVA MIO PRUEBA NEGATIVA INDICADOR DE pH Crecimiento slo a lo Prpura de bromocresol largo de la picadura pH neutro = morado No cambia la pH alcalino = K = prpura = coloracin del descarboxilacin positiva reactivo pH cido = amarillo = Color amarillo en el descarboxilacin negativa fondo del medio PRUEBA NEGATIVA INDICADOR DE pH Fondo del medio sin Rojo de fenol cambio pH neutro = naranja Inclinacin del medio pH alcalino = K = rojo pH cido = A = amarillo roja (K) Sin formacin de Gas = producto de la burbujas ni ruptura fermentacin de la glucosa del medio H2S = reaccin enzimtica con el Sin precipitado negro tiosulfito de sodio y citrato frrico para formar un precipitado negro PRUEBA NEGATIVA INDICADOR DE pH Prpura de bromocresol pH neutro = morado pH alcalino = K = prpura = Descarboxilacin de Fondo del medio Fondo del medio descarboxilacin positiva lisina color prpura color amarillo pH = cido = A = amarillo = descarboxilacin negativa Prpura de bromocresol pH neutro = morado Desaminacin de Inclinacin del medio Inclinacin del medio pH alcalino= R = rojo = lisina color rojo o vino color morado desaminacin positiva pH cido = A = amarillo = desaminacin negativa Burbujas o Ausencia de burbujas Gas = producto de la Produccin de gas rompimiento del o rompimiento del fermentacin de la glucosa medio medio
TABLA 1. INTERPRETACIN DE PRUEBAS BIOQUMICAS (CONTINUACIN)

Produccin de H2S Caldo Arginina Descarboxilacin de la arginina Caldo peptonado Produccin de indol Oxidasa UREA DE CHRISTENSEN Ausencia de Precipitado negro en precipitado en el el fondo o en todo el fondo o en todo el medio medio PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA Color del medio prpura PRUEBA POSITIVA Color del medio amarillo
PRUEBA NEGATIVA No cambia la El reactivo toma una coloracin del coloracin roja reactivo Color azul en la tira Ausencia de reactiva coloracin PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA Inclinacin del medio sin cambio de color o amarillo PRUEBA NEGATIVA Inclinacin del medio color verde PRUEBA NEGATIVA Color rojo o sin cambio
INDICADOR DE pH Prpura de bromocresol pH = neutro = mbar pH = alcalino = prpura = descarboxilacin (+) pH = cido = amarillo INDICADOR DE pH
Presencia de la enzima citocromo oxidasa INDICADOR DE pH Rojo de fenol pH neutro = amarillo o ligeramente rosa pH alcalino = rosa = hidrlisis de la urea positiva pH cido = amarillo o sin cambio = hidrlisis de la urea negativa INDICADOR DE pH Azul de bromotimol pH neutro = verde pH alcalino = azul = utilizacin del citrato como nica fuente de carbono INDICADOR DE pH Rojo de fenol pH neutro = anaranjado pH cido = amarillo pH alcalino = anaranjado
Hidrlisis de la urea
Inclinacin del medio color rosa
CITRATO DE SIMMONS
PRUEBA POSITIVA
Utilizacin del citrato Inclinacin del como nica fuente de medio carbono color azul CALDO SORBITOL Fermentacin del sorbitol PRUEBA POSITIVA Color amarillo
TABLA 1. INTERPRETACIN DE PRUEBAS BIOQUMICAS (CONTINUACIN)

CALDO MUCATO Utilizacin del mucato CALDO MALONATO Utilizacin del malonato PRUEBA POSITIVA Color amarillo PRUEBA NEGATIVA Sin cambio o verdoso INDICADOR DE pH Azul de bromotimol pH neutro = azul menta pH cido = amarillo pH alcalino = azul menta verdoso INDICADOR DE pH Azul de bromocresol
PRUEBA POSITIVA Azul
PRUEBA NEGATIVA Verde
TABLA 2. IDENTIFICACIN DE DIFERENTES ESPECIES DEL GNERO VIBRIO

MICROORGANISMO Vibrio cholerae Vibrio alginolyticus Vibrio charchariae Vibrio cincinnatiensis Vibrio damsella ** Vibrio fluvialis Vibrio furnissi Vibrio hollisae Vibrio metschnikovii Vibrio mimicus Vibrio parahaemolyticus * Vibrio vulnificus COLONIA Amarilla Amarilla Amarilla Amarilla Amarilla Amarilla Verde TSI LIA M + + + -/+ + + + (7 das) + + + + I + +/+ -/+ -/+ + -/+ + + + O + V + + V CALDO ARGININA PEPTONADO + + + + + + -/+ + + + + + + + + +/ROJO DE METILO +/+ V + + + CALDO NUTRITIVO CON NaCl (%) V.P OXIDASA + +/+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 0 + + 1 + + + + + + + + + + + + 3 + + + + + + + + 6 V + + + + + + + 8 + +/+/+/V + 10 +/12 -/+ GAS + -
A (K)/A K/K A/A K/K A (K)/A K/K A (K)/A K/K (A) K/A K/K (A) A/A K/A A (K)/A K/A K/A K/A K/A K/K K/K K/K
Amarilla A/A Verde A (K)/A Azul-verde K/A Azul-verde A (K)/A
+ + + V + + + +/-
* : Ureasa positivo - : 0 a 10 % de positividad -/+ : 11 a 39 % de positividad V : 40 a 60 % de positividad +/- : 61 a 90 % de positividad + : 91 a 100 % de positividad
Fuente: Giono Cerezo S, Escobar Gutirrez A, Valdespino Gmez JS, Diagnstico de Laboratorio de Infecciones Gastrointestinales, 1994. InDRE, SSA, pp 310-315, Zinsser, Microbiologa, 1998, 20 edicin, Edit. Panamericana, pp 771 A
TABLA 3. RESULTADOS DE PRUEBAS BIOQUMICAS DE ENTEROBACTERIAS QUE DAN PRUEBA DE INDOL NEGATIVA MICROORGANISMO Salmonella spp Shigella spp A,B,C,D Citrobacter freundii Proteus mirabilis Proteus vulgaris Klebsiella pneumoniae Klebsiella rhinoscleromatis Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Enterobacter sakasakii Pantoea agglomerans Serratia marcescens Providencia heimbachae CITRATO +(95) -(100) -(100) +(78) +(65) -(85) +(98) -(100) +(95) +(100) +(99) +(50) +(98) -(100) UREA -(99) -(100) -(100) -(56) +(98) +(95) +(95) -(100) -(98) +(65) -(99) -(80) -(85) -(100) LIA K/K(98) K/A(100) K/A(100) K/A(100) R/A(100) R/A(100) K/K(98) K/A(100) K/K(98) K/A(100) K/A(100) K/A(100) K/K(99) R/A H2S TSI M I O +(95) K/A(99) +(95) -(99) +(97) -(100) K/A(100) -(100) -(50) -(99) -(100) K/A(98) -(100) -(100) +(98) +(78) K/A(78) +(89) -(77) -(100) +(98) K/A(98) +(95) -(98) +(99) +(95) K/A(98) +(95) +(98) -(100) -(100) A/A(98) -(100) -(100) -(100) -(100) K/A(100) -(100) -(100) -(100) -(100) A/A(95) -(100) A/A(93) -(100) A/A(99) -(100) K/A(60) -(100) K/A(98) -(100) K/A(100) +(97) -(100) +(98) +(95) -(100) +(96) +(96) -(88) +(91) +(85) -(80) -(100) +(97) -(99) +(99) -(54) -(100) -(100) MUCATO +(90) -(100) -(90) +(100) -(100) -(100) +(90) -(100) +(90) +(75) -(99) -(60) -(100) -(100) SORBITOL +(95) -(70) -(98) +(100) -(100) -(100) +(99) +(100) +(100) +(95) -(100) -(70) +(99) -(100)
TABLA 4 RESULTADOS DE PRUEBAS BIOQUMICAS DE ENTEROBACTERIAS QUE DAN PRUEBA DE INDOL POSITIVA MICROORGANISMO CITRATO UREA LIA H2S TSI M I O MUCATO SORBITOL E. coli -(99) -(99) K/K (90) -(99) A/A (95) +(95) +(98) +(65) +(95) +(94) K/A (60) E. coli (inactiva) -(99) -(99) -(99) K/A(75) -(95) +(80) -(80) -(70) -(75) Klebsiella oxytoca +(95) +(90) K/K(99) -(100) A/A(100) -(100) +(99) -(100) +(93) +(99) Citrobacter diversus +(99) +(75) K/A(100) -(100) K/A o A/A +(95) +(99) +(99) +(95) +(99) (50) Citrobacter +(95) +(85) K/A(100) -(95) K/A(65) +(95) +(100) +(95) +(96) +(99) amalonaticus Morganella -(100) +(95) R/A(99) -(80) K/A(99) +(95) +(95) +(95) -(100) -(100) morganii Morganella -(100) +(100) K/K(100) -(85) K/A(100) -(100) +(100) +(80) -(100) -(100) morganii biogrupo 1 Edwarsiella tarda -(99) -(100) K/K(100) +(100) K/A(100) +(98) +(99) +(100) -(100) -(100) Edwarsiella tarda Hafnia alvei Providencia rettgeri -(100) -(100) +(95) -(100) -(96) +(98) K/K(100) K/K(100) R/A -(100) -(100) -(100) K/A(100) K/A(95) K/A(95) +(100) +(85) +(94) +(99) -(100) +(99) +(100) +(98) -(100) -(100) -(100) -(100) -(100) -(100) -(99)
TABLA 5. Diferenciacin de Salmonella atpica CARACTERSTICA Salmonella Salmonella Salmonella Salmonella Salmonella typhi paratyphi A sp arizona choleraesuis Movilidad + + + + + Produccin de indol Descarboxilacin de la + + + + ornitina Fermentacin de la + + + + + glucosa Fermentacin de sacarosa Fermentacin de lactosa Produccin de gas + + +(-) + Produccin de H2S +* + +(-) +/Descarboxilacin de la + + + + lisina Uso del malonato + Utilizacin de citrato + + Hidrlisis de la urea Caldo mucato +(-) +(-) Caldo sorbitol + + + + + + :Reaccin positiva - :Reaccin negativa ( - ):Reaccin ocasionalmente negativa +/- reaccin al 50 % * se produce en poca cantidad
ANEXO 3. RESULTADO DE PRUEBAS DE AGLUTINACIN TABLA 6. Prueba de aglutinacin en portaobjetos PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA CONTROL NEGATIVO Formacin de grumos Suspensin homognea Suspensin homognea
TABLA 7. Lista de antisueros para la prueba de aglutinacin flagelar de Salmonella en tubo Grupo somtico (A) (B) (C1 ) (C2 ) (D1 ) (E1-E3 ) (E4 ) (F) (G1 ) (G2 ) (H) (I) (J) (K) (L) (M) (N) (O) Antisuero flagelar a, g, m, p, v, 5 f, g, s, h, r, i, 2, v, m, t, 7, z4, z23, b, 5, d, enx, x, z15 b, g, m, s, t, r, w, 5, z10, d, h, k, z29, enx, x, z15 d, h, r, 2, z4, z24, k, 5, enx, z10, i, z6, g, d, m, v, q, s, t, 5, 2, p, z28 h, v, 5, 6, 7, w, z10, z6, r, y g, s, t, i, 2 a, r, 5, enx, z28, z13, x, z15, z29 z, 6 f, g, z, w, b, 5, 6, s 7, d, y c, 5, y d, 5 z23, z4 b, enx, y 7, y b, enx f, g, z4, z23 b, enx, x, z15 7, c, z10, enx, x, z15 i, enx, x, z15
O:2 O:4 O:7 O:8 O:9 O:3,10 O:3,19 O:11 O:13,22 O:13,23 O:6,14 O:16 O:17 O:18 O:21 O:28 O:30 O: 35 O:40 O:44 O:47
PRUEBA POSITIVA Formacin de grumos
TABLA 8. Prueba de aglutinacin en tubo PRUEBA NEGATIVA CONTROL NEGATIVO Suspensin homognea Suspensin homognea
TABLA 9. DETERMINACIN DE ANTGENOS SOMTICOS DE VIBRIO CHOLERAE POR AGLUTINACIN EN PORTAOBJETOS Control Interpretacin del resultado O1 Poliv O1 O1 Ogawa O:139 negativo Inaba + + V. cholerae O1 Inaba + + + + + + + + dbil + + + + + V. cholerae O1 Ogawa V. cholerae No O1 Neg a O:139 V. cholerae No O1 Pos a O:139 V. cholerae No O1 Neg a O:139 V. cholerae No O1 Neg a O:139 V. cholerae No O1 Neg a O:139 V. cholerae O1 Ogawa

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RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA BACTERIANA

PRUEBA Autosuficiencia Aislamiento e en el identificacin. diagnstico Pruebas moleculares (PCR)

2012 META 31 31 y D.F. LESP 0 31 y D.F.

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ORGANIZACIN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA (EDA) BACTERIANA

Redes de Apoyo Jurisdiccionales

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*Medio de baja selectividad

Enriquecimiento para Salmonella spp Aislamiento en 2 medios de alta selectividad

**Identificacin Bioqumica **Identificacin Bioqumica

Aglutinacin para grupo y serotipo

Aglutinacin para grupo

Aglutinacin para serotipo

Prueba de susceptibilidad antimicrobiana

Identificacin de genes de toxigenicidad

Prueba de susceptibilidad antimicrobiana

Pruebas moleculares PFGE (Solo en caso de brote)

Pruebas moleculares PFGE (Solo en caso de urgencia)

* En caso de brote y se sospeche de Escherichia coli picar cinco colonias e identificar.

** Se pueden emplear mtodos automatizados o semi automatizados para la identificacin.

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Calidad de las muestras

Oportunidad en el envo de la muestra

Evaluacin del desempeo

Cumplimiento del envo de cepas

El laboratorio de referencia nacional enviar oficio de notificacin

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Identificacin Bioqumica Identificacin Bioqumica