MTODO CROMOGNICO-FLUOROGNICO PARA EL CULTIVO, AISLAMIENTO, DETECCIN, IDENTIFICACIN Y ENUMERACIN DE ESPECIES DE CANDIDA CON EL EMPLEO DEL MEDIO CROMOCEN

CND-F
BioCen, cdigo 4450

Aplicacin en muestras clnicas

El medio CromoCen CND-F est diseado para el cultivo, aislamiento, deteccin, identificacin y enumeracin de especies de Candida de mayor importancia en la clnica, a partir de la inoculacin directa del material patognico, utilizando las tcnicas tradicionales, o a partir de la resiembra de los aislamientos primarios logrados en el medio Agar Dextrosa de Sabouraud u otro, en el cual se sospeche la presencia de Candida spp. La recuperacin de diferentes especies de Candida a partir de muestras clnicas procedentes de diversos orgenes que abarcan las micosis cutneo-mucosas superficiales hasta las micosis sistmicas, comnmente estn relacionadas con la mayora de las infecciones oportunistas. Las principales muestras a analizar son: biopsias, lquidos estriles (LCR, pleural, peritoneal), sangre, catter, corneal, espacios interdigitales, heces, herida, odo externo, oral, orina, respiratorias (esputo, aspirado traqueal y bronquial, lavado broncoalveolar), uas y vaginal. Resumen de la aplicacin El fundamento del medio se basa en la deteccin de actividades enzimticas presentes en el gnero Candida (hexosaminidasas, - y -glucosidasas) mediante la hidrlisis especfica de dos sustratos cromognicos y de un fluorognico presentes en la formulacin. Este mtodo describe el procedimiento para el cultivo, aislamiento, deteccin, identificacin y enumeracin de especies de Candida, en varios tipos de muestras clnicas, con el empleo del medio CromoCen CND-F, el cual combina el sustrato cromognico para la deteccin de actividad glucosaminidasa, presente en Candida albicans y Candida tropicalis, conjuntamente con otro sustrato para la deteccin de la actividad -glucosidasa presente en Candida tropicalis, Candida kefyr, Candida guilliermondii y Candida lusitaniae y con un sustrato fluorognico para la deteccin de actividad -glucosidasa caracterstica de C. albicans, C. dubliniensis, C. tropicalis, C. guilliermondii, C. lusitaniae, C. famata y C. parapsilosis, permitiendo un procedimiento ms sencillo para la identificacin de las especies de mayor importancia mdica. La incorporacin de un extracto vegetal y el extracto de levadura, le confiere a la frmula una rica concentracin de macro y micronutrientes, vitaminas y carbohidratos, esenciales para el rpido desarrollo de las levaduras. La inhibicin de algunas bacterias Gram-negativas y Gram-positivas, se logra por la adicin de sustancias selectivas. Procedimiento El esquema general del mtodo se presenta en el Anexo A. Siembra en placas e identificacin Siembre sobre la superficie del medio CromoCen CND-F utilizando el mtodo de siembra de estriado hasta el agotamiento del inculo, con el objetivo de obtener colonias aisladas. Coloque la placa sobre una superficie lisa, levante ligeramente la tapa de la placa de Petri e inocule la suspensin microbiana o la porcin (colonia aislada) con un asa estril. En caso de que la muestra est contenida en un hisopo, siembre con el mismo la muestra directamente en el primer cuadrante. Para lograr obtener colonias aisladas con la ayuda de un asa estril, flameada a la llama, arrastre parte del inculo inicial a los dems cuadrantes de la placa. Incube la placa en una incubadora bacteriolgica a 35 2 C por 36-48 h. En la incubadora, coloque las placas en posicin horizontal, con la tapa hacia abajo, en columnas de no ms de 4 placas. Al finalizar la incubacin, observe el crecimiento y proceda a identificar de acuerdo con las instrucciones del fabricante, que se basan en las caractersticas de color y morfologa de las colonias aisladas. Para el recuento de colonias, utilice el mtodo de siembra por inundacin de la superficie, que se ejecuta distribuyendo homogneamente la muestra con ayuda de una esptula de Drigalsky. Coloque la placa sobre una superficie lisa. Levante ligeramente la tapa de la placa de Petri e inocule, para muestras de orina 5 L (0,005 mL) de la porcin de ensayo, en el centro de la placa con medio CromoCen CND-F. Distribuya la muestra sobre toda la superficie con una esptula de Drigalsky estril (embeber en alcohol y flamear), girando esta ltima siempre en posicin totalmente horizontal con respecto al plano de la placa. Deje la placa en reposo por 510 min para que la muestra penetre en el lecho del agar. Despus de incubar, para el recuento de C. parapsilosis, se marcan en la tapa de la placa las colonias fluorescentes al alumbrarlas con luz UV y se cuentan, de ellas, las que presentan coloracin blanca. Las dems colonias de Candida, se cuentan bajo luz visible segn sus diferentes caractersticas cromticas y morfolgicas. Confirmacin de identidad Si requiere la identificacin de las especies de levaduras que no son identificadas en el medio por su coloracin, se puede utilizar el mtodo auxonogrfico, basado en la asimilacin de compuestos carbonados para su confirmacin. (Ver Anexo B)

Interpretacin En el medio CromoCen CND-F, la interpretacin de los resultados se realiza al valorar las caractersticas culturales (color y morfologa) que exhiben las colonias, y se complementa con el desarrollo de la fluorescencia al visualizar las colonias bajo luz UV de 366 nm. Las de color verde o verde azul son propias de C. albicans y C. dubliniensis, las de color azul caracterizan a la especie C. tropicalis; C. kefyr presenta colonias de color rosado violceo; las colonias de color rosa a rosa plido indican la presencia de C. guilliermondii, C. lusitaniae y C. famata. Todas las especies descritas anteriormente, exceptuando C. kefyr, muestran adems, fluorescencia bajo luz UV. Otras especies de Candida muestran colonias de color blanco y entre ellas es posible lograr la identificacin de C. parapsilosis y C. krusei. Las cepas de C. parapsilosis pueden manifestar diferentes caractersticas macro-culturales desde colonias redondas y lisas, hasta colonias con una superficie rugosa, estrellada y de consistencia seca y con fluorescencia azul intensa bajo luz UV. Las cepas de C. krusei, son de color blanco opaco, con morfologa tpica de colonias planas, bordes irregulares, superficie algodonosa y sin fluorescencia. Otras especies muestran colonias de color blanco, redondas y lisas, sin fluorescencia, entre ellas, C. glabrata y C. rugosa. Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas resultan inhibidas en el medio, excepto Pseudomonas aeruginosa, la cual aparece de color verde semitransparente, bordes irregulares, aplastada y con fluorescencia verde-azul. Algunas cepas de E. coli, cido nalidixico resistentes, pueden crecer sin interferir la identificacin de las especies de inters. Microorganismo Color de las colonias Caractersticas de las Fluorescencia aisladas colonias aisladas a 366 nm C. albicans Verde o verde azul Redondas, lisas + C. tropicalis Azul Redondas, lisas + C. kefyr Rosado violceo Redondas, lisas C. krusei Blanco opaco Planas e irregulares C. parapsilosis Blanco Redondas lisas o rugosas + P. aeruginosa Translcidas Planas e irregulares + (Verde azul) Ventajas Ms rpido. La identificacin de las especies de Candida de mayor inters clnico se realiza en un mximo de 48 h, gracias a la identificacin directa (o con un mnimo de pruebas adicionales), en comparacin con los mtodos tradicionales que consumen ms de 96 h. La deteccin directa y simultnea de varias actividades enzimticas para una misma especie, en un mismo medio, eleva la exactitud del anlisis (100 %). No requiere de personal especializado para la preparacin del medio y la interpretacin de los resultados, ya que la identificacin de las especies de Candida se realiza visualmente, por el color y la morfologa colonial. Ahorro de recursos y disminucin de la carga de trabajo, pues el medio es capaz de aislar, recuperar e identificar las colonias de Candida de mayor relevancia en un solo paso. El balance de nutrientes e inhibidores de la frmula permite una recuperacin de 113 % al comparar los resultados de promocin del crecimiento de este medio con Agar Dextrosa de Sabouraud y una inhibicin ms efectiva de las bacterias Gram-negativas y Gram-positivas. Composicin y preparacin del medio de cultivo El medio de cultivo CromoCen CND-F posee en su composicin: Mezcla de extractos nutritivos (Extracto vegetal y extracto de levadura), 30 g/L; Mezcla cromognica-fluorognica, 0,3 g/L; Sales buferantes e inhibidores del crecimiento, 1,8 g/L, Agar, 15 g/L y Suplemento Glicerol, 10 mL/L. El medio debe tener un pH: 6,6 0,2. Para la preparacin del medio se deben seguir las siguientes indicaciones: Suspender 47,1 g de la Base de medio CromoCen CND-F (cdigo 4450) en 1 L de agua destilada o desionizada, adicionar 10 mL de Suplemento Glicerol (Cdigo 4448). Mezclar bien. Hervir durante 1 min. Enfriar hasta 45 C y distribuir en placas de Petri estriles. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Almacenamiento del medio CromoCen CND-F Mantener el frasco con el medio deshidratado hermticamente cerrado en lugar seco, fresco, protegido de la luz, a temperatura de 15 a 30 C Se podr almacenar las placas listas para el uso por un perodo de 30 das a temperatura entre 2 8 C protegido de la deshidratacin y de la luz. Para mayor informacin dirigirse a: Departamento de ventas: Ing. Carlos Prendes, tel. 8-81-70-24, e-mail: prendes@biocen.cu Asistencia tcnica: DrC Raisa Zhurbenko, tel. 047-68-2441, e-mail: raisa@biocen.cu

Anexo A: Esquema para el aislamiento, identificacin y diferenciacin de especies de levaduras a partir de muestras clnicas Muestra clnica

Elevada sospecha de presencia de levaduras y/o necesidad de urgencia en el diagnstico

Sospecha de levaduras

Aislamiento primario en Agar Dextrosa de Sabouraud Aislamiento primario, cultivo, deteccin, identificacin y enumeracin en CromoCen CND-F

Resiembra de las colonias sospechosas en CromoCen CND-F para la deteccin e identificacin

Interpretacin de los resultados: C. tropicalis: colonias azules, fluorescencia + C. kefyr: colonias rosadas violceas, sin fluorescencia C. krusei: colonias blancas, opacas, planas, irregulares, con superficie algodonosa, diferentes tamaos y sin fluorescencia C. parapsilosis: colonias blancas con morfologa rugosa o lisa, fluorescencia + C. inconspicua: colonias rosadas, opacas, planas, irregulares, con superficie algodonosa, tamao irregular y sin fluorescencia

Colonias con caractersticas similares, pruebas bioqumicas discriminatorias

C. albicans 45C: + XIL: + TRH:+

C. dubliniensis 45C: XIL: TRH:-

C. guilliermondii LAC: RAF: + Microm:

C. lusitaniae LAC: RAF: + Microm:

C. famata LAC: + RAF: + Microm:

C. parapsilosis 45C: TRH: + RAF: SAC:+ Microm: C. glabrata 45C: + TRH: + RAF: SAC:Microm:

Saccharomyces sp C. rugosa 45C: TRH: RAF: SAC:Microm: 45C: TRH: RAF: SAC:Microm:

ANEXO B: Prueba de asimilacin de carbohidratos para la identificacin de especies de levaduras. Mtodo auxonograma Es un procedimiento basado en la asimilacin de carbohidratos para la identificacin de levaduras hasta el nivel de especies. En el auxonograma, la asimilacin del azcar se detecta por el crecimiento visible de la especie en el medio de cultivo. El procedimiento modificado de auxanograma aplicado tiene su basamento en que los hongos son organismos quimitrofos, que degradan los nutrientes del medio exterior, como los complejos de hidrato de carbono, a travs de enzimas exocelulares (permeasas) en monosacridos ms simples para su absorcin. Los estudios de evaluacin nutricional sobre sustratos especficos ha permitido definir el patrn catablico que puede presentar un determinado gnero o especie. Formulacin del medio de cultivo: Para la prueba de asimilacin de carbohidratos se formula un medio de cultivo sinttico libre de carbono con la siguiente composicin: sulfato de amonio (NH4)2SO4 5,0 g; hidrgeno fosfato de potasio K 2HPO4 0,45 g; di-hidrgeno fosfato de potasio KH2PO4 0,31 g; hidrgeno fosfato de sodio Na2HPO4 0,92 g; cloruro de sodio NaCl 0,1 g; cloruro de calcio CaCl 2 0,05 g; sulfato de magnesio heptahidratado MgSO 4.7H2O 0,2 g; L-histidina 0,005 g; L-triptfano 0,02 g; L-metionina 0,02 g; agar 20 g; azul bromotimol 0,04 g y agua destilada 1 L. El pH del medio se ajusta a 6,6. Soluciones acuosas de carbohidratos estriles por filtracin con membranas de 0,2 micras, a una concentracin de 20 %. Se utilizan las siguientes sustancias carbonadas: Glucosa (GLU), Xilosa (XIL), Adonitol (ADO), Galactosa (GAL), Inositol (INO), Sorbitol (SOR), Metil alfa-D-glucopiransido (MDG), Celobiosa (CEL), Lactosa (LAC), Maltosa (MAL), Trehalosa (TRE), Melecitosa (MLZ), Rafinosa (RAF) cido lctico (AcL). Metodologa e interpretacin de los resultados: 1) Utilizando la composicin libre de carbono descrita anteriormente (formulacin del medio de cultivo), para cada cepa de estudio (una determinacin), se necesitan dos frascos volumtricos de 100 mL de capacidad cada uno, con 60 mL de medio de cultivo. 2) Se comprueba su pH, se funden y se esterilizan por autoclave a 121 C durante 15 min. Luego se colocan en bao de Mara a 45-50 C. 3) A partir de colonias aisladas de las cepas de estudio se realiza una suspensin microbiana similar al patrn de MacFarland 2 y se mezclan con el medio estril fundido, en una proporcin de 3:60 (mL de inculo y mL de medio de cultivo). 4) La mezcla se distribuye en una placa Petri estril (150 x 15 mm) y se deja solidificar en una superficie plana. 5) Una vez solidificado el medio, se rotula el fondo de ambas placas de Petri con las siglas asignadas a cada una de las sustancias a evaluar. En una placa pueden realizarse hasta 8 anlisis de diferentes carbohidratos incluyendo el punto central y 7 en los alrededores. 6) Con un asa de inoculacin estril se realizan cortes profundos en el agar y con ayuda de una pipeta semiautomtica se introduce en el orificio un volumen de 10 L de la solucin del carbohidrato estril. 7) Las principales sustancias carbonadas que se evalan son las siguientes: glucosa, xilosa, adonitol, galactosa, inositol, sorbitol, metil alfa-D-glucopiransido, celobiosa, lactosa, maltosa, trehalosa, melecitosa, rafinosa y cido lctico. 8) Todas las soluciones de carbohidratos al finalizar las incisiones son testadas en Caldo Triptona Soya, para comprobar su esterilidad. 9) Posteriormente, las placas se colocan invertidas, en una estufa a 35 C. 10) Cada 24 h se procede a la lectura de las mismas, hasta un mximo de 3 das, reportndose la asimilacin de las sustancias carbonadas, al evidenciarse una zona circular de mayor densidad de crecimiento alrededor del sitio donde se aplic la sustancia a estudiar en el agar, al realizar la observacin de las mismas a travs de la luz. 11) Los resultados obtenidos pueden ser comparados con los patrones de asimilacin de varios gneros y especies que se encuentran disponibles en la literatura.