MTODO CROMOGNICO-FLUOROGNICO PARA LA IDENTIFICACIN Y/O

RECUENTO DE Escherichia coli Y COLIFORMES POR LA TCNICA DE

FILTRACIN POR MEMBRANA CON EL EMPLEO DEL MEDIO m-
CROMOCEN CC

1. INTRODUCCIN
El grupo de los coliformes ha sido definido como el principal indicador de
contaminacin fecal en aguas para diferentes usos. El uso de diversos procedimientos
para la determinacin de estos microorganismos, permite valorar la calidad sanitaria
del agua, especialmente la de consumo humano, por los riesgos que para la salud
que implican, as como comprobar la efectividad de su tratamiento.
Este mtodo describe el anlisis de varios tipos de aguas, para la deteccin y/o
enumeracin de E. coli y coliformes, en el medio cultivo m-CromoCen CC, el cual
combina el sustrato cromognico 5-bromo-4-cloro-3-indolyl--D-galactopiransido
(X-Gal) para la deteccin de actividad galactosidasa presente tanto en E. coli, como
en el resto de los coliformes, conjuntamente con una sal de metil-umbeliferil--D
glucurnido (MUG) para la deteccin de la actividad de E. coli por la aparicin de
fluorescencia azul, permitiendo un procedimiento ms sencillo.
La combinacin de nutrientes en el medio, conjuntamente con inhibidores para los
microorganismos Gram-positivos, permite el adecuado crecimiento y recuperacin de
los microorganismos de inters.


2. INDICADORES DE DESEMPEO DEL MTODO

Exactitud relativa para coliformes totales en aguas: 97,5%
Sensibilidad relativa para coliformes totales en aguas: 97,3 %
Especificidad relativa para coliformes totales en aguas: 100%

Exactitud para E. coli en aguas: 99,6%
Sensibilidad para E. coli en aguas: 99,4%
Especificidad para E. coli en aguas: 100%

Razn de los falsos positivos y negativos: 0,1

Lmite de determinacin, con el medio m-CromoCen CC:1 UFC/100 mL

Lmite de cuantificacin con el medio m-CromoCen CC: 1-10 UFC/100 mL

Lmite superior de linearidad: 200 UFC


3. CONDICIONES DE SEGURIDAD

Manipule los microorganismos con extremo cuidado segn los requisitos de
Seguridad Biolgica. Estos microorganismos se encuentran en el grupo de
riesgo 2.
En caso de derrame de diluciones de microorganismos o medios inoculados,
bloquee la zona al acceso de cualquier persona. Inmediatamente aada
solucin desinfectante (alcohol al 70 % o fenol al 3 %) y mantngala sobre la
superficie aproximadamente 15 min. Recoja el material derramado, limpie la
zona.
En caso de quemadura en la piel por derrame de medios de cultivo calientes,
lave rpidamente la zona con agua fresca y acuda al mdico si es necesario.
Use bata de laboratorio.


4. PROCEDIMIENTO PARA EL CONTROL DE LA CALIDAD

1. Determinacin de pH.
2. Evaluacin microbiolgica.
Ver anexo A


5. CULTIVO EN PLACAS E IDENTIFICACIN

Coloque la membrana filtrante sobre la superficie del medio cromognico
m-CromoCen CC.

Incube el medio a 35 2 C durante 18-24 horas.

En este mtodo los coliformes totales se definen como aquella bacterias que
producen colonias azul verdosas en su centro, o en toda la superficie de la colonia,
con o sin fluorescencia azul bajo luz ultravioleta (366 nm), pudiendo presentar bordes
blancos y halos de color azul o azul verdoso alrededor de las colonias.

En este mtodo E. coli se define como aquellas bacterias que producen colonias con
centro azul verdoso, con fluorescencia azul bajo luz ultravioleta (366 nm), pudiendo
presentar bordes blancos y halos de color azul o azul verdoso alrededor de las
colonias.


6. CONFIRMACIN DE IDENTIDAD

Algunos rganos regulatorios pueden exigir la confirmacin de E. coli por algunas
pruebas adicionales a la deteccin de actividad galactosidasa y glucuronidasa
respuestas caractersticas en el medio m-CromoCen CC. En este caso, la
confirmacin de las colonias sospechosas de E. coli se puede ejecutar con la prueba
de glutamato decarboxilasa y/o la prueba rpida de indol (Ver anexo B).


7. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS
Ver Anexo B
Medio m-CromoCen CC
Agua de peptona bufferada.
Reactivos para prueba rpida de Indol
Reactivo para la prueba GAD
Solucin salina
KH
2
PO
4

MgCl
2

2
8. EQUIPAMIENTO, UTENSILIOS Y SUSTANCIAS ADICIONALES
8.1 Equipamiento y materiales

Horno o autoclave.
Incubadora (capaz de operar a las temperaturas 35 2 C )
Bao termostatado (capaz de operar a la temperatura de 35 2 C)
pH-metro con una exactitud en la calibracin de 0.1 unidades de pH a 20 C a
25 C.
Frascos de capacidad apropiada, de borosilicato, con tapas de rosca con liners
de neopreno.
Pipetas graduadas o automticas, de capacidades de 1 y 10 mL, graduadas en
divisiones de 0.5 y 0.1 mL.
Placas de Petri plsticas estriles de 9 x 50 mm, com tapas ajustadas, o de 10
x 55 mm o de 15 x 60 mm con tapas holgadas.
Lmpara UV de onda larga (366 nm).
Unidad de filtracin para membranas de 50 mm de dimetro, envuelta en papel
kraft y estril.
Bomba de vaco elctrica.
Frasco para filtracin (kitasato), usualmente de 1 L, con dos mangueras
correspondientes.
Frasco trampa que se conecta entre el Kitasato y la bomba.
Pinza con puntas planas y lisas.
Alcohol etlico al 95% en un frasco pequeo de boca ancha para la
esterilizacin de la pinza.
Mechero de gas o cabina de seguridad.
Membranas filtrantes cuadriculadas, de color blanco con un tamao de poros
de 0,45 0,02 m y con dimetro de 47 50 mm de dimetro, estriles.
Agua para diluciones: agua para diluciones tamponada estril, preparada en
grandes volmenes para enjuague de filtro entre las muestras.
Rotuladores de placas.
Frascos de vidrio graduados con tapa de rosca de volumen 1 L estriles para la
medicin de las muestras.


9. MICROORGANISMOS INTERFERENTES Y REACCIONES ATPICAS

En el caso de la deteccin de la actividad de la enzima -D- glucuronidasa (GUD) con
el sustrato 4-metilumbeliferil--D-glucurnido (MUG) incluido en el medio se debe
tener en cuenta que esta enzima est presente en el 94-96 % de las cepas de E. coli
(HARTMAN 1989). Solo unas pocas cepas de Salmonella, Shigella y Yersinia son
capaces de producir esta enzima tambin. En el caso de Salmonella y Shigella, las
colonias se observarn en el medio CromoCen CC de color blanco por lo que no
interfieren en la deteccin de E. coli (centro verde azul, con posible presencia de
bordes blancos, con posibles halos azules o verde azules y con fluorescencia azul).

Algunas cepas patognicas de E. coli, por ejemplo E. coli O157:H7, no poseen
actividad GUD. Otras especies de Escherichia no producen la enzima (RICE et al.,
1991). ALONSO et al. (1996) encontr cepas de Klebsiella oxytoca, Serratia fonticola
y Yersinia intermedia capaces de producir GUD. Otros autores reportan cepas
3
positivas a esta enzima en cepas de Citrobacter freundii (GAUTHIER et al., 1991,
MANAFI, 1995, PREZ et el., 1986, SHDIX et al., 1993).

Algunas cepas de Pseudomonas, en especial Pseudomonas aeruginosa producen un
pigmento que exhibe una fluorescencia verdosa bajo la luz ultravioleta (UV). Cepas
de Pseudomonas fluorescens muestran fluorescencia azulosa, pero la coloracin de
sus colonias es blanca. Pueden encontrarse cepas de Pseudomonas de coloracin
verdosa, pero con fluorescencia verde.

La enzima -D-galactosidasa que escinde al sustrato 5-bromo-4-cloro-3-indolyl--D-
galactopiransido (X-GAL) presente en el medio, se puede encontrar en cepas de
Aeromonas y puede generar falsos positivos. A. hydrophila, A. sobria, Vibrio
metschnikovii y V. vulnificus pueden dar reacciones tpicas de coliformes;
A. hydrophila incluso a muy bajas densidades (LEY et al., 1993).

En aquellas muestras, en que se sospeche la presencia de Aeromonas, que puedan
interferir en la identificacin y/o recuento de coliformes, se recomienda adicionar a la
muestra lquida solucin de cefsulodina a concentracin de 5 mg/L. Otro
procedimiento puede consistir en picar algunas colonias verde-azules (mnimo 5) y
realizar la prueba rpida de citocromo oxidasa para confirmar su ausencia o
presencia. De comprobarse la presencia de Aeromonas, recalcule el recuento para
obtener el recuento confirmado de coliformes ([nmero de colonias verde-azules
citocromo oxidasa negativas/nmero de colonias picadas para la prueba] 100).

Por otra parte, algunas cepas de Serratia, considerada por varios autores como
coliformes (Kreig, 1984; Topley, 1997; Swing, 1986; Ballows, 1992), pueden dar una
coloracin rosada intensa en el medio debido a su pigmentacin propia.

Otra consideracin a tener en cuenta es que la fluorescencia puede difundir a travs
de la membrana al medio en un perodo de tiempo relativamente corto, sobre todo a
pH cido, por lo que se recomienda, para la enumeracin de E. coli, la lectura de los
resultados en las 18-24 horas establecidas. El rango de concentracin de UFC del
total de microorganismos Gram-negativos para lograr un recuento efectivo es de 20 a
200 UFC/placa, aunque para una mejor visualizacin y enumeracin de E. coli y
coliformes, se obtienen mejores resultados en el rango de 20 a 80 UFC/placa de los
microorganismos diana y en especial para E. coli de 20 a 50 UFC/placa.

Las reacciones tpicas de los microorganismos diana se mantienen estables ms all
de las 18-24 horas de incubacin recomendadas. La fluorescencia y el color de las
colonias se mantiene hasta las 48 horas de incubacin, observndose colonias de color
ms intenso y de mayor tamao, la fluorescencia puede difundir a la superficie de la
membrana y del medio y el halo alrededor de la colonia de E. coli, si est presente,
puede aumentar en dimetro.

Algunos slidos en suspensin que se depositan y quedan retenidos en la membrana
filtrante, pueden mostrar fluorescencia bajo luz ultravioleta, por lo que siempre debe ser
comprobada la presencia de las colonias de E. coli por la coloracin azul verdosa, con o
sin bordes blancos de las colonias que le dan origen a la fluorescencia.

4
Colonias muy pequeas y lisas o colonias en forma de puntos de color azul o azul verdoso
(con dimetro inferior a 0,5 mm) en las membranas con altas densidades de
microorganismos Gram-negativos pueden originarse por otros microorganismos no diana
que se encuentran en escasas concentraciones. Estas colonias no deben ser tenidas en
cuenta para el clculo de los recuentos. Comnmente las colonias de los
microorganismos diana poseen dimetros entre 1 y 3 mm. No obstante si considera
necesario, puede picar al menos 5 colonias con las caractersticas antes sealadas y
ejecutar la prueba rpida de GAD o la rpida de Indol.


10. PROCEDIMIENTO
Ver Anexo C

10.1 Muestras.

Es importante que el laboratorio reciba muestras que no hayan sufrido daos o
cambios en su composicin y estado.

En el momento de la colecta, trate las muestras que contienen cloro residual con 1 mL
de solucin al 10 % de tiosulfato de sodio por litro de muestra.

Transporte las muestras en refrigeracin o en contenedores con hielo para mantener
la temperatura de 1 a 4 C.

Analice las muestras en el laboratorio lo antes posible. Ensaye el agua potable antes
de las 30 h posteriores a su recoleccin y el agua bruta antes de las 6 h.

10.1.1 Seleccin del tamao de la muestra:

Determine el tamao de la muestra teniendo en cuenta la densidad microbiana
esperada. Para analizar aguas potables, limite el tamao de la muestra slo por el
contenido de slidos en suspensin (turbiedad) o por el crecimiento de los
microorganismos en su conjunto (coliformes o no) en el medio. Para propsitos
regulatorios, el tamao oficial de la muestra es 100 mL.

Un volumen ptimo de muestras debe proporcionar entre 20 y 80 colonias de
coliformes y de E. coli por placa, aunque para este ltimo se logran mejores
resultados al obtener de 20 a 50 colonias por placa y no ms de 200 UFC/placa de
todos los microorganismos Gram-negativos en la superficie de la membrana filtrante.

Analice el agua potable filtrando entre 100 y 1000 mL, o filtre volmenes ms
pequeos tales como duplicados de 50 mL o porciones de cuatro rplicas de 25 mL.

Analice otros tipos de aguas con mayor densidad microbiana esperada o de mayor
turbiedad filtrando hasta tres volmenes diferentes (diluidos o no diluidos).

Si el volumen de muestra a filtrar, es menor de 10 mL (diluida o no diluida), previo a la
filtracin, aada aproximadamente 10 mL de agua para dilucin estril al embudo, o
tome con una pipeta el volumen de muestra y traspselo a un frasco para diluciones
estril y filtre posteriormente la dilucin completa.
5
El objetivo de aumentar los volmenes de agua para dilucin estril aadidos a la
muestra es lograr una distribucin ms uniforme de la suspensin bacteriana sobre la
superficie de la membrana filtrante.

10.1.2 Dilucin de la muestra.

En caso de analizar una muestra en que se sospeche un alto nivel de contaminacin,
prepare el agua para diluciones tamponada segn se indica en el anexo B.

Seleccione la dilucin a preparar de forma tal que el nmero total de UFC de
microorganismos diana a obtener en la placa se encuentre entre 20 y 80.

No mantenga las diluciones preparadas por un perodo mayor de 30 minutos a
temperatura ambiente, para evitar la multiplicacin o muerte de los microorganismos.

Volmenes de muestras recomendados a filtrar en dependencia de la fuente de agua.

Para consumo humano directo o indirecto:
Agua para consumo humano: 100 mL
Agua de pozos, manantiales, lagos, presas y reservorios: 10-100 mL
Puntos de entrada al procesamiento de agua: 0,1-10 mL
Agua de ro: 0,001-1 mL

Aguas recreacionales:
Piscinas: 100 mL
Playas: 0,1-10 mL

Aguas residuales:
Cloradas: 0,01-1 mL
Sin clorar: 0,0001-0,1 mL


11. FILTRACIN POR MEMBRANA CON EL EMPLEO DEL MEDIO m-
CROMOCEN CC

11.1 Procedimiento de cultivo en placas.
Prepare el medio m-CromoCen CC de ser necesario. Si las placas estn preparadas
con antelacin y refrigeradas, permita que estas alcancen la temperatura ambiente. Si
la superficie del medio est hmeda seque las placas en la incubadora durante 30 min
a 40C. Rotule las placas adecuadamente.
Utilizando la pinza flameada, coloque la membrana filtrante con la superficie
cuadriculada hacia arriba sobre la base porosa del filtro. Una el filtro con la base con
la ayuda del cierre, teniendo en cuenta no daar la membrana. Coloque
aproximadamente un volumen de 20 mL de agua para diluciones estril y fltrela
previamente. Agite vigorosamente la muestra unas 25 veces y tome posteriormente
en un contenedor estril el volumen de la muestra de agua (segn 10.1.1 y 10.1.2) y
fltrela conectando la bomba de vaco. Realice otro enjuague de aproximadamente 20
mL de agua para diluciones. Al terminar estos pasos, abra la unidad de filtracin y
retire la membrana filtrante con ayuda de la pinza flameada. Coloque esta membrana
6
sobre la superficie del medio m-CromoCen CC teniendo especial cuidado en que no
queden burbujas de aire entre la membrana y el medio.
Realice los enjuagues del filtro con agua para diluciones tamponada estril, antes y
despus de procesar cada una de las muestras.
Coloque las placas en la incubadora a temperatura de 35 2 C en posicin
horizontal, con la tapa hacia abajo, en columnas de no ms de 4 placas. Incube por
un perodo de 18 a 24 h. Luego de la incubacin, examine las placas para determinar
la presencia de colonias tpicas de E. coli y/o coliformes totales o para su
enumeracin.


12. INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS DEL MEDIO m-CROMOCEN CC
Ver Anexo D.

En el medio m-CromoCen CC, el crecimiento tpico de E. coli (excepto E. coli
O157:H7), son colonias con centro azul verdoso, pudiendo presentar bordes blancos
con o sin halo azul o azul verdoso y con fluorescencia azul (bajo luz UV). En el resto
de los coliformes las colonias tpicas son azul verdosas sin fluorescencia.

Las colonias incoloras o con pigmentacin propia corresponden a otras bacterias
Gram-negativas.

Los microorganismos Gram-positivos resultan inhibidos en el medio.

Nota: Tenga en cuenta la respuesta de los microorganismos interferentes o
reacciones atpicas para el anlisis de los resultados. (Ver acpite 9).


13. RECOMENDACIONES PARA EL RECUENTO DE COLONIAS EN EL MEDIO m-
CROMOCEN CC
Las placas deben mostrar recuentos en el intervalo de 20 a 80 UFC. Calcule la cuenta
por 100 mililitros de la muestra y reporte.

Cuando la muestra de 100 mL se separa en 2, 3 o 4 porciones de 50 y/o 25 mL,
determine la cuenta dada por cada placa y smelas. Reporte el recuento en
UFC/100 mL.
Si emplea diluciones de la muestra, tanto en 1, como en 2, 3 4 placas diferentes,
correspondientes a las porciones de la misma muestra, multiplique el nmero de
colonias diana por placa por el recproco de la dilucin empleada para cada placa. Si
emplea ms de una placa, sume los recuentos despus de haber multiplicado cada
una en la que se ensay una porcin diluida por el recproco de la dilucin.
Si emplea volmenes de muestra menores de 100 mL pero en una sola placa, divida
el recuento resultante en la placa entre el volumen de muestra filtrado y multiplique el
valor por 100 mL, para determinar el recuento en UFC/ 100 mL.
7
Si emplea volmenes de muestra menores de 100 mL de una muestra diluida, pero en
una sola placa, divida el recuento resultante en la placa entre el volumen de muestra
filtrado y multiplique el valor por 100 mL, y finalmente multiplique este valor por el
inverso de la dilucin empleada, todo esto para determinar el recuento en UFC/ 100
mL.
Con el fin de uniformar los criterios para el reporte de las cuentas en ensayos donde
las placas presenten situaciones no contempladas en los ejemplos anteriores, se
presentan las siguientes orientaciones:

Placas con menos de 20 colonias diana- Cuando las placas muestran cuentas de
menos de 20 colonias, cuente el nmero de colonias presentes en dicha placa y si ha
filtrado una dilucin, multiplquelo por el factor de dilucin para obtener el valor
estimado de cuenta en placa. Aclare en su informe esta situacin agregando al valor
encontrado la leyenda "valor <20".

Placas con ms de 80 colonias.- Cuando el nmero de colonias diana por placa
exceda de 80, cuente las colonias en aquellas porciones de la placa que sean
representativas de la distribucin de colonias. Cuente, por ejemplo, una cuarta parte o
una mitad del rea de la placa y multiplique el valor obtenido por 4 2,
respectivamente. Aclare en el informe esta situacin agregando al valor encontrado la
leyenda "valor >80".

Colonias extendidas.- Las colonias extendidas pueden presentarse en las siguientes
formas (tipos):

Cadenas de colonias no separadas claramente entre s, que parecen ser
causadas por la desintegracin de un cmulo de bacterias.
Colonias que se desarrollan en pelcula en la orilla de la placa sobre la
superficie de la membrana.
Colonias de crecimiento extendido y en algunas ocasiones acompaadas de
inhibicin del crecimiento, que en conjunto exceden el 50 % de la placa o
represin del crecimiento que por s mismo excede el 25 % de la superficie de
la placa.

Cuando es necesario contar en placas que contienen colonias extendidas que no
estn incluidas en alguno de los grupos anteriores, cuente cualquiera de los tipos
mencionados, como provenientes de una sola fuente. En el caso de las colonias del
primer tipo, si la placa contiene una sola cadena, cuente como una sola colonia, si la
placa contiene varias cadenas que parecen originarse de fuentes separadas, cuente
cada cadena como colonia individual. No cuente cada colonia de la cadena
individualmente. Las colonias del segundo tipo generalmente se observan como
crecimiento diferenciable de otras colonias y se cuentan como tales. Los crecimientos
del tercer tipo, reprtelos como crecimiento extendido. En caso de que una dilucin se
encuentre dentro del rango y otra dilucin presente colonias de crecimiento extendido,
reporte la dilucin en la que se pueden contar las colonias.

Placas sin colonias.- Cuando las placas no muestran colonias, reporte la ausencia.

8
Placas corridas por duplicado provenientes de una misma muestra, una con
crecimiento dentro del intervalo adecuado y otra con ms de 80 colonias.- Cuando
una placa tiene entre 20 y 80 colonias y su duplicado ms de 80 colonias, cuente
ambas placas incluyendo la que est fuera del intervalo para determinar la cuenta en
placa.
El recuento de coliformes totales (E. coli +otros coliformes) se realiza como sigue:
proceda como en los prrafos anteriores. Ejecute el recuento de todas las colonias de
color azul verdoso, tanto en su centro, como en toda la superficie con diferente
intensidad de color y con presencia o no de halo de color azul o azul verdoso. Las
colonias incoloras o con coloracin propia, diferente a la descrita, no sern tomadas
en cuenta.
El recuento de E. coli se realiza como se describe: coloque las placas en una
superficie plana dentro de un local oscuro, sin iluminacin alguna. Proceda a
iluminarlas con una lmpara de luz ultravioleta con una luz de 366 nm, acercando la
lmpara a la placa a una distancia de aproximadamente 5 cm. Realice el recuento de
las colonias que muestren fluorescencia azul propiamente en su superficie. Preste
especial atencin a las colonias no fluorescentes que colinden con las fluorescentes,
pues las primeras deben ser descartadas del recuento. Marque las colonias
fluorescentes bajo luz UV y despus compruebe que la coloracin de su centro es
azul-verdosa bajo luz visible y posee o no bordes blancos y con presencia o no de
halos azules o azul verdosos. Las colonias fluorescentes sin coloracin azul-verdosa
(no marcadas) no las tome en cuenta para el clculo de las UFC de E. coli.

14. CONFIRMACIN
Seleccione las colonias sospechosas de E. coli para la confirmacin con la prueba
rpida de GAD tal y como describe el procedimiento (ANEXO B), o de indol rpida
(Anexo E).
Las colonias seleccionadas debern ser de un nmero de al menos 5 por placa.
Utilice cultivos puros para ejecutar la prueba.
9

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25. Vracko, R., and Sherris, J . C. (1963). Am. J . Clin. Pathol. 39: 429.

11
ANEXO A: Control de la calidad del medio m-CromoCen CC
Determinacin del pH
Condiciones de Seguridad:
Use la bata de laboratorio.

Equipos, Materiales y Materias Primas:
Equipos:
Balanza de precisin de 0,01 g
pH-metro
Licuadora elctrica

Materiales:
Frasco cnico de 250 mL
Embudo de cristal de 120 mm de dimetro
Esptula de acero inoxidable
Papel de filtro neutro
Cilindro graduado de 100 mL
Pinzas con punta amiantada para vasos
Termmetro de 0-100 C (valor de divisin 1 )

Materias Primas:
Agua destilada o desionizada

Procedimiento:
a) Corte con una esptula el medio contenido de una o ms placas y adicinelo en el
vaso de la licuadora elctrica.
b) Aada un volumen de agua destilada o desionizada, medidos con el cilindro
graduado, igual al volumen de medio contenido en la placa o en las placas tomadas
para el ensayo, en varias porciones para arrastrar en cada una de ellas los restos de
medio que queden adheridos a las paredes de la placa.
c) Adicione todas estas porciones en la licuadora.
d) Homogeneice totalmente la mezcla en la licuadora durante 1 minuto, operando el
equipo segn la instructiva del mismo, y filtre todo el contenido a travs de un papel
de filtro neutro para filtracin rpida colocado en un embudo.
e) Recoja el filtrado en un frasco cnico.
f) Enfre el filtrado a una temperatura de 25 2 C y proceda a medir el pH en el
pHmetro. Opere el pHmetro segn la instructiva del mismo.
g) Realice el procedimiento por triplicado para cada muestra.
h) Anote los resultados.

Clculo e Interpretacin de los Resultados:
Calcule la media entre los tres valores obtenidos.
Aproxime los resultados hasta la dcima.

Criterios de aceptacin
El valor del pH debe ser 7,1 0,2.

12
ANEXO A (cont). Control de calidad del medio m-CromoCen CC

Evaluacin microbiolgica del m-CromoCen CC

Condiciones de Seguridad:
Manipule los microorganismos con extremo cuidado segn los requisitos de Seguridad
Biolgica.
En caso de derrame de diluciones de microorganismos o medios inoculados, bloquee la
zona al acceso de cualquier persona. Inmediatamente aada solucin desinfectante
(alcohol al 70 % o fenol al 3 %) y mantngala sobre la superficie aproximadamente 15
min. Recoja el material derramado, limpie la zona.
En caso de quemadura en la piel por derrame de medios de cultivo calientes, lave
rpidamente la zona con agua fresca y acuda al mdico si es necesario.

Equipos, Materiales y Materias Primas:
Equipos:
Balanza tcnica (precisin 0,01 g)
Incubadora de laboratorio
Microscopio ptico
Bao termostatado de laboratorio
Bomba de vaco
Espectrofotmetro (opcional)

Materiales:
Tubos de cultivo (125 x 15) mm o tubo con tapa de rosca (150 x 20) mm
Asa y aguja de nicrom
Gradillas para tubos
Frascos cnicos de vidrio sin tapa de 250 , 500 y 1 000 mL
Quemador de gas
Pipetas de 1 y 2 mL estriles
Portapipetas
Hisopo de algodn estril
Asa calibrada de 1 L
Placas de Petri de (100 x 13) mm y (150 x 25) mm
Cilindros graduados de cristal de 100 mL
Lmina portaobjetos
Lmina cubreobjetos
Esptula de Drigalsky
Pipeta Pasteur
Lpiz cristalogrfico
Tubo 0,5 de la escala MacFarland (opcional)
Pinza de acero inoxidable
Filtro de acero inoxidable para filtracin por membrana
Pinzas plsticas o de acero inoxidable para manipular las membranas filtrantes
Membranas filtrantes de acetato o nitrato de celulosa para filtracin por membrana



13

Materias Primas:
Alcohol al 70 % o fenol al 3 %
Medio de cultivo Agar Triptona Soya en tubos, con agar en plano inclinado
Medio de cultivo, de referencia o control, semejante al que se evaluar
Cepas ATCC de referencia o control Escherichia coli ATCC 25922, Enterobacter
aerogenes ATCC 13048 y Enterococcus faecalis ATCC 29212.
Algodn
Tubos con medio agarizado de uso general en plano inclinado, preparado
Tubo con Caldo Triptona Soya
Bata sanitaria
Botas cubrecalzado
Gorro
Agua destilada o desionizada
Operaciones Preliminares:
a) Compruebe que se ha realizado la limpieza de la meseta y el cuarto segn lo
establecido, observando el registro correspondiente.
b) Prepare el inculo segn los siguientes pasos.
c) Partiendo de cuas de los cultivos microbianos en conservacin (refrigeracin de 4 - 8
C), siembre por estras cada uno de los microorganismos de referencia en dos tubos de
Agar Triptona Soya con agar inclinado o en Caldo Triptona Soya, de las bacterias a
ensayar.
d) Incube a 35 2 C de 18-24 h para las bacterias.
e) Realice la Tincin de Gram, para comprobar la pureza del cultivo a sembrar.
f) La evaluacin del medio se realizar a partir de inculos estandarizados, ya sea a partir
del cultivo con 50 % de transmitancia en el espectrofotmetro, o del tubo correspondiente
a la escala 0,5 de MacFarland, para lo cual, estandarice el inculo y prepare diluciones
seriadas del mismo.
g) Rotule las placas que contienen el medio a evaluar.

Procedimiento:
Agrupe las placas rotuladas por microorganismo dentro del cuarto de siembra.

Mtodo de siembra por la tcnica de filtracin por membrana
Inoculacin del medio de cultivo.
a) Esterilice el equipamiento de filtracin antes de utilizarlo.
b) Con ayuda de una pinza estril, remueva la membrana de su embalaje individual y
colquela sobre la base del filtro.
c) Filtre la muestra (0,1 mL del cultivo en 20 mL de agua desionizada o destilada
estril) y enjuague el filtro con otros 10 mL del agua.
d) Remueva la membrana filtrante con ayuda de una pinza estril y colquela sobre la
superficie del medio agarizado.
e) Incube las placas invertidas a 35 2 C de 18-24 h.






14

Criterios de aceptacin (tabla 1)

Tabla 1. Criterios de aceptacin para el mtodo de siembra por filtracin por
membrana despus de incubacin por 18-24 h a 35 2 C

Microorganismo Caractersticas de
las colonias
aisladas
Fluorescencia
a 366 nm
Crecimiento en la dilucin
10
-5
E. coli ATCC 25922 Centro azul
verdoso, con o sin
bordes blancos
+(Azul) Bueno
Enterobacter
aerogenes ATCC
13048
Azul verdoso - Bueno
Salmonella
typhimurium ATCC
14028
Incoloras - Bueno
Enterococcus faecalis
ATCC 29212
Incoloras, si las hay - De inhibido a escaso
(recuperacin 0,01 % para
el inculo 10
5
UFC/mL)*

* siembra en paralelo con el Agar Triptona Soya.

Preparacin de patrones de la escala MacFarland
1 Condiciones de Seguridad:
Use bata de laboratorio.
Manipule con cuidado el cido sulfrico concentrado ya que puede causar
quemaduras severas en los ojos y la piel.

2 Equipos, Materiales y Materias primas:
Equipos:
Estufa con circulacin forzada de aire de 50 a 200 C
Agitador magntico
Balanza de 0,01 g de precisin

Materiales:
Bulbos de vidrio 2R
Tapones de clorobutilo 13 mm
Sellos de aluminio de 13 mm
Matraz de un solo trazo de 100 mL
Frasco cnico de 250 mL
Esptula
Vaso para precipitado de 25 mL
Pipeta automtica de 1 a 5 mL
Puntas para pipeta automtica de 1 a 5 mL
Bandeja de acero inoxidable (160 x 270) mm
Barra magntica (40 x 8) mm
15
Selladora manual para bulbos 2R
Pipetas de vidrio graduadas de 1 mL y 10 mL

Materias primas:
Agua potable
Detergente industrial
Agua desionizada
Acido sulfrico 98 % (p.a) (=1,84 g/cm
3
)
Cloruro de bario dihidratado (p.a.)

Operaciones Preliminares:
Fregado de los bulbos y tapones.
a) Sumerja los bulbos y tapones en una solucin de detergente.
b) Mantngalos en esta solucin durante 15 min.
c) Saque los bulbos y tapones del detergente y enjuguelos con suficiente agua
potable, hasta eliminar todo el detergente.
d) Enjuague los bulbos y tapones dos veces con agua desionizada.
e) Escrralos y colquelos en una bandeja de acero inoxidable.
f) Coloque la bandeja en una estufa con circulacin forzada de aire y seque los bulbos
y tapones a 70 C durante 2 h.
g) Una vez transcurrido el tiempo de secado, saque la bandeja de la estufa y deje
enfriar los bulbos y tapones hasta temperatura ambiente.

Preparacin de la solucin de cido sulfrico al 1 % .
a) Tome con una pipeta graduada 0,55 mL de cido sulfrico (p.a.) al 98 %, (=1,84
g/cm
3
) y depostelo en un matraz de un solo trazo de 100 mL .
b) Complete el volumen con agua desionizada.
c) Homogeneice bien la solucin, agitndola manualmente.

Preparacin de la solucin de cloruro de bario al 1 %.
a) Pese en una balanza de 0,01 g de precisin, con una esptula en un frasco cnico
de 250 mL,
1,17 g de cloruro de bario di-hidratado. Opere el equipo segn instructiva del mismo.
b) Aada agua desionizada hasta completar 100 g .
c) Homogeneice bien la solucin, agitndola manualmente.

Procedimiento:
Preparacin de la suspensin.
a) Endulce una pipeta graduada de 10 mL con la solucin de cido sulfrico al 1 %.
b) Endulce una pipeta graduada de 1 mL con la solucin de cloruro de bario al 1 %.
c) Mezcle en un frasco cnico de 250 mL los volmenes deseados de soluciones
segn las proporciones indicadas en la tabla 1. Segn el patrn que se desea
preparar.
d) Agite durante 5 min.






16
Tabla 1. Proporciones de los reactivos para la preparacin de la escala MacFarland

Escala de MacFarland
Tubo H
2
SO
4
1 % (mL) BaCl
2
1 % (mL)
0,5 9,95 0,05
1 9,9 0,1
2 9,8 0,2
3 9,7 0,3
4 9,6 0,4
5 9,5 0,5
6 9,4 0,6
7 9,3 0,7
8 9,2 0,8
9 9,1 0,9
10 9,0 1,0

Llenado de los bulbos.
a) Coloque el frasco cnico con la suspensin en el agitador magntico e introduzca
una barra magntica.
b) Comience a agitar a 500 r/min.
c) Grade la pipeta automtica para 3 mL.
d) Coloque la punta en la pipeta automtica.
e) Manteniendo en agitacin la suspensin dispense en cada bulbo 3 mL de la misma
con ayuda de la pipeta automtica.

Tapado y sellado de los bulbos.
a) Coloque los tapones y los sellos de aluminio sobre los bulbos.
b) Tome los bulbos uno a uno, colquelos fuera de la bandeja y vaya sellndolos con
la selladora manual para bulbos 2R.

Revisin.
a) Observe los bulbos individualmente a travs de la luz y elimine los que tengan
partculas extraas.

Rotulado.
a) Rotule los frascos con la etiqueta correspondiente.

Almacenamiento.
a) Almacnese en la oscuridad.

Preparacin de las cepas de trabajo

Operaciones preliminares.
Preparacin de la solucin de formaldehdo al 12 %
a) Vierta en un matraz de un solo trazo de 100 mL, 32,4 mL de formol al 37 %.
b) Complete el volumen con agua destilada o desionizada.
c) Homogeneice la preparacin invirtiendo el frasco de 4 a 5 veces el matraz.
17
d) Trasvase el contenido a un frasco mbar.
e) Rotule el frasco para identificar la solucin.

Preparacin de una solucin de cido sulfrico al 1 %. (m/v)
a) Tome con una pipeta graduada de 1 mL, 0,55 mL de cido sulfrico (p.a.) al 98 %^,
( =1,84 g/cm
3
) y depostelo en un matraz de un solo trazo de 100 mL.
b) Complete el volumen con agua desionizada.
c) Homogeneice la solucin agitndola manualmente.
d) Trasvase el contenido a un frasco mbar.
e) Rotule el frasco para identificar la solucin.


Preparacin de la solucin de cloruro de Bario al 1 % (m/v)
a) Pese en una balanza tcnica de precisin 0,1 g, en un frasco cnico de vidrio de
250 mL, 1 g de cloruro de bario di-hidratado.
b) Aada agua desionizada hasta completar 100 mL.
c) Homogeneice bien la solucin, agitndola manualmente.
d) Trasvase el contenido a un frasco.
e) Rotule el frasco para identificar la solucin.

Preparacin del cultivo para su posterior estandarizacin
Preparacin del cultivo puro (18-24 horas)
a) Tome con un asa de nicrom previamente esterilizada a la llama del quemador parte
de la biomasa del microorganismo procedente de una cua de conservacin (cepa
certificada) e inocule en un tubo de vidrio que contenga un medio slido de uso
general en plano inclinado (Ej: Agar triptona soya). Rotule el tubo con el nombre del
microorganismo en cuestin. En caso de contar con una cepa salvaje proveniente de
una muestra, tomar una colonia aislada y proceder de igual forma.
b) Incube el tubo inoculado en condiciones de tiempo y temperatura segn los
requisitos del microorganismo. (Bacterias generalmente a 35 2 C).
c) Si desea comprobar la pureza del cultivo despus de pasado el tiempo de
incubacin realice una tincin de Gram.

Preparacin de la suspensin
a) Tome el tubo de cultivo fresco y aada 5 mL de solucin salina estril.
b) Arrastre el cultivo del agar rotando el tubo con movimientos manuales,
manteniendo el tubo en posicin horizontal.
c) Vierta la suspensin final a un tubo de (150 x 20) mm con tapa de rosca, estril.
Rotule el nombre de la cepa y la fecha. (Tubo A).
d) Si desea compruebe la pureza del cultivo del tubo A realizando una Tincin de
Gram.

Estandarizacin de la cepa al 50 2 % de transmitancia utilizando un
espectrofotmetro a una longitud de onda de 580 nm
a) Encienda el espectrofotmetro 30 min. antes de ser utilizado.
b) Ajuste el equipo a 0 y 100 de transmitancia.
c) Extraiga con una pipeta estril de 1 mL en condiciones aspticas 1 mL del
contenido del tubo A y transfiralo a un tubo de (150x20) mL con tapa de rosca, no
necesariamente estril en este caso, indicando el nombre de la cepa y rotulndolo
como tubo B.
18
d) Aada 1 mL de formaldehdo al 12 % al tubo B.
e) Mantenga en contacto la suspensin de la cepa y el formaldehdo de 15-30 min.
f) Agite el tubo B, aada de su contenido aproximadamente 8 mL al tubo de lectura
del equipo, colquelo en el espectrofotmetro y observe el porcentaje de
transmitancia que mide el equipo.
g) Si el porcentaje de transmitancia est por debajo del 50 %, adale con cuidado
aproximadamente 1 mL menos de solucin salina al 0,85 %. Anote en su libreta de
trabajo los volmenes de solucin salina que va aadiendo.
h) Repita la operacin descrita en el apartado f.
i) Repita las operaciones descritas en los apartados g y h hasta alcanzar el 50 2 %
de transmitancia.
j) En caso de que el valor de la transmitancia exceda el 50 %, extraiga con una pipeta
estril de 1 mL en condiciones aspticas 1 mL del contenido del tubo A y transfiralo
al tubo B, aada 1 mL de formaldehdo al 12 % y contine la lectura despus de
haber transcurrido los 15 minutos.
k) Sume los volmenes de solucin salina al 0,85 % y de formaldehdo incorporados
al mL de suspensin microbiana.
Ejemplo:
1 mL de formaldehdo + mL de solucin salina =X mL de solvente
Entonces:
1 mL de suspensin microbiana +X mL de solvente (Formaldehdo y solucin
salina) ~50%

Estandarizacin por turbiedad similar al tubo # 5 de MacFarland
a) Tome un tubo de cultivo de vidrio (150 x 20) mm con tapa de rosca que contenga
en su interior 9 mL solucin salina, colquelo en una gradilla para tubos y rotlelo con
el nombre del microorganismo, la fecha y las iniciales M.F# 5 que significa
MacFarland #5 lo que corresponde aproximadamente a 3,0 10
8
clulas/mL.
b) Coloque el tubo A (suspensin microbiana) en la gradilla referida en el apartado
anterior 2.2.c.
c) Tome el tubo #5 de la escala de MacFarland y colquelo en la gradilla.
d) Extraiga con una pipeta de 1 mL estril en condiciones aspticas 0,5 mL del
contenido del tubo A y transfiralo al tubo de (150x20) mm con tapa de rosca rotulado
con M.F. #5 hasta alcanzar una turbiedad al tubo #5 de la escala de MacFarland.

Cuenta de viables de la suspensin estandarizada (Para determinar las
Unidades Formadoras de Colonias (UFC)).
a) Prepare la suspensin microbiana estandarizada (Tubo A).
b) Coloque en una gradilla 10 tubos de cultivo de vidrio (150 x 20) mm con tapa de
rosca, estril. Rotule los tubos indicando el nombre del microorganismo y diluciones
desde 10
-1
hasta 10
10
.
c) Adicione aspticamente 9 mL de solucin salina estril a cada tubo con una pipeta
de 10 mL estril y portapipetas automticos si posee.
d) Agite el tubo A con un agitador magntico si posee o con la mano durante 5
segundos.
19
e) Tome 1 mL aspticamente con una pipeta de 1 mL estril y portapipetas
automtico, del tubo A y adalo al tubo 10
-1
. Agite durante 2 3 segundos.
f) Transfiera de igual forma, 1 mL del tubo 10
-1
al tubo 10
-2
. Agite. Repita esta
operacin hasta el tubo marcado con 10
-10
.
g) Rotule 2 placas de Petri con el medio de cultivo especfico segn corresponda por
microorganismo y por dilucin e identifquelas con el nombre de la cepa, dilucin y
fecha de inoculacin.

Inoculacin
a) Agite la dilucin 10
-5
durante 2 3 segundos y tome 0,2 mL de la misma con una
pipeta de 1 mL estril e inocule esta cantidad en cada una de las 2 placas que
contienen el medio de cultivo.
b) Aplique rotacin manual en forma de 8 a las placas.
c) Deje reposar las placas con las tapas hacia arriba durante 15 minutos.
d) Incube las placas a la temperatura y el tiempo que se describe para el
microorganismo del ensayo.
e) Si desea comprobar la pureza del inculo a las placas incubadas realice Tincin de
Gram despus del tiempo de incubacin.

Lectura de las placas
Cuente las Unidades Formadoras de Colonias en cada una de las 2 placas
sembradas. Haga un promedio y tome el valor promedio (de no obtenerse
crecimiento en una de ellas, desechar el resultado de esa placa y solo tomar en
cuenta el de la placa restante) y antelo en el registro de cuentas de viables. Nota:
Si en lugar de partir de la cepa estandarizada con el espectrofotmetro parte de la
cepa estandarizada por MacFarland, realice los mismos pasos para hacer las
diluciones pero partiendo del tubo que contiene la suspensin estandarizada al 0,5
de MacFarland. El resto de los pasos se realiza de la misma forma.

Se considerar vlido el ensayo si:
a- En las diluciones de trabajo se encuentran las Unidades Formadoras de Colonias
necesarias para realizar nuestro ensayo en al menos 1 placa (de 10 a 100 UFC).
b- No existe contaminacin en las inoculaciones realizadas.

20
ANEXO B. Composicin y preparacin de los medios de cultivo y reactivos.

1. Agua para diluciones tamponada

Solucin stock de buffer de fosfato

Composicin.

Dihidrgenofosfato de potasio
(KH
2
PO
4
)
34,0 g
Agua destilada 500 mL

Preparacin.
Ajuste el pH de la solucin a 7,2 con el NaOH 1N y complete el volumen a 1000
mL con agua destilada. Esterilice en autoclave a 121 C durante 15 min.

Solucin stock de MgCl
2
: Disuelva 38 g de MgCl
2
anhidro ( 81,1 g del
hexahidratado) en un litro de agua destilada.

Preparacin.
Esterilice en autoclave a 121 C durante 15 min.

Almacene en refrigeracin ambas soluciones stock despus de la esterilizacin y
maniplelas aspticamente.

Solucin de trabajo final (pH 7,0 0,2): Aada 1,25 mL de la solucin stock
de buffer fosfato y 5 mL de la solucin stock de MgCl
2
para cada litro de
agua destilada preparada. Mezcle bien, dispense en contenedores
apropiados (frascos graduados o frascos de Erlenmeyer para el enjuague
del filtro) y autoclavee.


2. m-CromoCen CC

Bases nutritivas 11,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Mezcla cromognica-fluorognica 1,4 g
Agar 13 g

pH 7.1 0.2

Preparacin

De acuerdo a la cantidad deseada, pese el polvo en proporcin de 30,4 g/L de
agua destilada o desionizada. Para preparar 500 mL del medio, suspenda 15,2 g
del polvo en 500 mL de agua destilada o desionizada. Hierva hasta disolucin
completa y distribuya. No esterilice en autoclave.


21
3. Prueba Rpida de GAD para la identificacin de E. coli

El reactivo de la prueba rpida de glutamatodescarboxilasa (GAD) se prepara a partir
de los ingredientes siguientes:

0,1 g de cido L-glutmico
0,005 g de verde de bromocresol
9 g de cloruro de sodio
0,3 mL de Tritn X-100
100 mL de agua destilada

El reactivo debe tener el pH 3.5, tener color amarillo y estar transparente.
Esterilice el reactivo por filtracin y envselo aspticamente en un frasco de vidrio de
color mbar para su posterior almacenamiento en refrigeracin. Se ha comprobado
una estabilidad satisfactoria del reactivo en dichas condiciones en un perodo de 5
meses de almacenamiento.

Mtodo de empleo:

Pique una colonia de inters y prepare una suspensin concentrada en 0,5 mL de
solucin salina estril. A esta suspensin adale 0,2 mL del reactivo de GAD e
incube a 35 C durante 10-13 horas observando cada 30 min. Cualquier cambio de
color amarillo a verde o azul considrelo como reaccin positiva. Existen algunas
cepas de E. coli que responden de manera ms rpida y por tanto su respuesta se
observa en menor tiempo.


4. Prueba Rpida de indol para la identificacin de E. coli

Pruebas rpidas de indol
Fundamento: Se investiga la presencia en el microorganismo de la enzima
triptofanasa o triptofanodesaminasa, capaz de desdoblar el triptfano (aminocido) en
indol ms alanina. Se detecta la presencia de esta enzima mediante la reaccin de
indol producido con el reactivo p dimetilaminobenzaldehdo.

Prueba de Arnold Weaver

Medios de cultivo:
- Caldo de triptona (Agua de peptona) conteniendo triptfano.

Reactivos:
- Reactivo de Kovacs
Composicin del reactivo de Kovacs:
Alcohol amlico o isoamlico o butlico __ 5 mL
p dimetilbenzaldehdo _____________ 5 mg
HCl concentrado __________________ 25 mL

Procedimiento:
1. Inocule con gran abundancia un cultivo puro proveniente en cantidades de 0,4
mL de caldo de triptona (agua de peptona) conteniendo triptfano.
2. Incube a 37

C durante 2 horas.
22
3. Agregue reactivo de Kovacs y agite suavemente.

Interpretacin:
El color rojo en la capa reactiva indica formacin de indol.

Prueba spot de indol - Vracko - Sherris

Reactivos:
- p dimetilaminobenzaldehdo
- Solucin acuosa de HCl al 10 %

Procedimiento:
1. Coloque un papel de filtro Whatman N
0
1 (9 cm) en la tapa de una placa de
Petri.
2. Humedezca el papel de filtro con 1 mL de solucin 5 % de p
dimetilaminobenzaldehdo en la solucin acuosa de HCl al 10 %.
3. Extienda colonias aisladas de la placa en un rea pequea de papel de filtro
humedecido.

Interpretacin:
La presencia de indol est indicada por la aparicin de color rojo parduzco a rojo
prpura en 20 segundos. El color amarillo blanquecino indica la ausencia de indol.

Nota: La misma prueba puede hacerse con una asada de cultivo puro proveniente de
agua de peptona.

Ventajas:
- Muchas pruebas pueden hacerse sobre un trozo de papel de filtro impregnado.
- Cultivos individuales pueden examinarse varias veces por da.

Observaciones:
- La colonias a ensayar pueden ser analizadas nicamente si estn separadas
por lo menos en 5 mm a su alrededor de otras colonias o si se toman de cultivo
puro.

La prueba es algo menos sensible, cuando se hace con colonias en medios slidos,
que la prueba estndar de 48 horas, pero parece tener valor con las
enterobacteriaceas que fermentan la lactosa. Se han encontrado algunas dificultades
con aislamientos frescos de Proteus vulgaris y tambin se ha comprobado que
algunas cepas indol positivas son negativas a la primera prueba con medios slidos
que contienen triptfano. La prueba resulta segura para fermentadores de la lactosa.











23

Anexo C. Diagrama de flujo para la determinacin de E. coli en muestras de aguas.

Muestra de agua
Tome en un contenedor estril muestras con el volumen a filtrar.
Realice enjuague del filtro con el agua para diluciones tamponada estril (20 mL)
Filtre el volumen de la muestra (tenga en cuenta el acpite 10.1.1 y 10.1.2)
Realice el enjuague posterior (20 mL)
Coloque la membrana filtrante en el medio m-CromoCen CC.
Incube las placas a 35 2 C durante 18-24 horas.
Identifique las colonias de E. coli (colonias con centro azul verdoso, con o sin bordes blancos y con
fluorescencia azul bajo luz UV)
Ejecute, de ser necesaria la confirmacin de las colonias sospechosas de E. coli con la prueba de
glutamato descarboxilasa y/o la prueba rpida de indol.
Reporte los resultados.

































24
Anexo D. Ejemplo de reacciones tpicas y atpicas de los microorganismos
diana y de otros Gram-negativos


Fig. 2. E. coli bajo luz
visible en el medio
m-CromoCen CC.

Fig. 1. E. coli bajo luz
visible en el medio
m-CromoCen CC.




Fig. 2. E. coli bajo luz
ultravioleta en el
medio m-CromoCen
CC.

Fig. 3. Enterobacter
aerogenes (coliforme)
bajo luz visible en el
medio m-CromoCen
CC.

25

Fig. 4. Klebsiella
pneumoniae (coliforme)
bajo luz visible en el
medio m-CromoCen CC.




Fig. 5. Citrobacter
freundii (coliforme) bajo
luz visible en el medio
m-CromoCen CC.




Fig. 6. Serratia
marcescens (coliforme)
bajo luz visible en el
medio m-CromoCen
CC.
26


Fig. 7. Pseudomonas
aeruginosa (Gram-
negativo, no coliforme)
bajo luz visible en el
medio m-
CromoCen CC.



Fig. 8. Pseudomonas
aeruginosa (Gram-
negativo, no coliforme)
bajo luz ultravioleta en
el medio m-
CromoCen CC.

Fig. 9. Proteus mirabilis
(Gram-negativo, no
coliforme) bajo luz visible
en el medio m-
CromoCen CC.
27


Fig. 10. Bacteria
Gram-negativa, no
coliforme, bajo luz
visible en el medio
m-CromoCen CC.



Fig. 11. Cultivo mixto
bajo luz visible en el
medio m-CromoCen
CC.



Fig. 12. Cultivo mixto
bajo luz ultravioleta
en el medio m-
CromoCen CC.

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