Clase 4 Citogentica Mdica y Mutagnesis

Qu es la Citogentica?
Es la ciencia que tiene por objeto el estudio de la estructura y comportamiento cromosmico, a travs de tcnicas de microscopa.

Qu son los cromosomas?

Cuerpos coloreados (cromo: color; soma: cuerpo). Cromosoma: unidad de organizacin, estructura microscpica. Es un estado permanente dentro del ciclo celular, pero su condensacin es mxima en metafase.

Cmo se empaqueta el ADN?

I. II. Nucleosoma: octmero de H2A, H2B, H3 y H4 + ADN (146 pb). Solenoide o fibra de cromatina de 30 nm: empaquetamiento helicoidal (6 nucleosomas), interviene la H1. Bucles o fibra de 300 nm: andamio proteico al que se unen los bucles (e/ 20 y 100.000 pb). Cromtide o fibra de 700 nm: bucles enrrollados cable de telfono. Mximo nivel de compactacin: cromosoma metafsico.

III.

IV.

Elementos bsicos del cromosoma

Centrmero Longitudinalmente divide al cromosoma en cromtidas y transversalmente en brazos. I. Centrmero propiamente dicho o constriccin 1ria.: formado por ADN satlite asociado a protenas especficas. II. Cinetocoro: placas proteicas en las cuales se insertan los microtbulos. Telmero Protege y estabiliza a los cromosomas. Constitudo por repeticiones en tndem de TTAGGG, una de las cadenas tiene mayor longitud. Su elongacin se acorta con cada ciclo celular, por la telomerasa. Orgenes de replicacin Replicones o unidades de replicacin, En el genoma humano hay 20.000 funcionales, representan el 10 % del total de replicones.

As...
El cromosoma no slo tiene informacin para la sntesis bioqumica de las protenas, sino informacin esencial para su propia estabilidad y replicacin, para su ordenamiento mittico e interfsico y para el acceso a su propia informacin.

Cmo se caracteriza un conjunto cromosmico?

Constantes Cromosmicas Nmero: set cromosmico bsico haploide (n). En humanos n = 23, 22 autosomales y 1 gonosoma (X Y). En las clulas somticas de los organismos de reproduccin sexuada el nmero cromosmico es diploide (2n). En humanos 2n = 46 (Tjio y Levan, 1956), 44 autosomales y 2 gonosmicos (46,XX; 46,XY). 1. Morfologa Tamao del cromosoma: grandes, medianos y pequeos. Posicin del centrmero: metacntrico, submetacntrico y acrocntrico.

2.

Estructura Para poner de manifiesto las diferencias ultraestrusturales existentes entre los diferentes pares cromosmicos as como la posible aparicin de anomalas estructurales se utilizan las tcnicas de bandeo. Tipos de bandeo: Bandeos longitudinales Q, G y R Bandeos especficos C, T y Nor Bandeos de alta resolucin. Las bandas Q y G+ y R-, son ricas en A-T, son pobres en genes y de replicacin tarda. Las bandas Q-, G- y R+, son ricas en C-G, y en genes activos que se replican tempranamente.

Cariotipo
A partir de las tres constantes cromosmicas puedo establecer el cariotipo (ordenamiento sistemtico de los cromosomas). Los cromosomas se ordenan de a pares, de mayor a menor tamao y de acuerdo a la posicin del centrmero. Segn lo establecido por ISCN (Sistema Internacional de Nomenclatura en Citogentica Humana), la clasificacin bsica comprende 7 grupos

Obtencin de Cromosomas
Los cultivos celulares se pueden realizar a partir de diferentes tejidos.
- Diagnstico prenatal: lq.amnitico y vellosidad corial. - Diagnstico postnatal: sangre perifrica, mdula sea, clulas tumorales, etc.

Las clulas crecern en suspensin (clulas hematopoyticas) o en monocapa (vellosidades coriales, lquido amnitico, piel). El procesamiento ser directo (clulas en divisin: mdula, vellosidades, clulas tumorales) indirecto (clulas estimuladas: linfocitos, lquido amnitico, ganglio).

0.5 a 5 ml de sangre perifrica (heparina) siembra de las clulas en medio de cultivo (aminocidos, vitaminas, sales, nucletidos) + suero (hormonas y factores de crecimiento) + antibitico + mitgeno (induce la divisin celular; Ej.: Fitohemaglutinina) Incubacin a 37 C durante 48 a 72 hs Agregado de un agente antimittico (impide la formacin del huso mittico; Ej.: colchicina) Agregado de solucin hipotnica (para lograr dispersin cromosmica) Fijacin de las clulas (detiene la auto lisis y preserva el material) Goteo del material sobre portaobjetos Coloracin (homognea o bandeo) Cariotipo

Citogentica Clnica
Se trata de la investigacin y diagnstico de patologas cromosmicas, a nivel fetal Diagnstico Prenatal y en individuos ya nacidos y adultos Diagnstico Postnatal.

Anomalas Cromosmicas
Se presentan en 1 de cada 150 nacidos vivos. Son la principal causa conocida de retraso mental y de prdida de la gestacin. Se observan anomalas cromosmicas entre el 50 y el 20 % de los abortos espontneos del 1er y 2do trimestre. Se clasifican en: Anomalas del Nmero Anomalas de la Estructura

Anomalas Numricas
Clula Euploide: 23 o 46 cromosomas en su ncleo. Clula Heteroploide: se alejan del nmero exacto de cromosomas. Puden ser: Poliploides: presencia adicional de uno o ms set haploide completo en la clula Aneuploides: pierden o ganan algn/os cromosomas.

Anomalas del Nmero de Cromosomas

Poliploidas
Triploidas (3n = 69). Tetraploida (4n = 92).

Aneuploidas
Puden ser autosmicas o gonosmicas Aneuploidas Autosmicas Monosomas (2n -1= 45): una nica copia de un cromosoma en una clula (incompatibles con la gestacin a trmino). Trisomas (2n +1= 47): tres copias. Causas: No-disyuncin; Anafase lag.

Ejemplos de trisomas
Trisoma 21 (47, XY,+21), Sindrome de Down: frecuencia 1/750 nv.
Trisoma 18 (47,XX,+18), Sindrome de Edwards: 1 de cada 6.000 nv. El grado de retraso es mayor que en S. de Down.

Trisoma 13 (47,XX,+13), Sindrome De Patau: 1 de cada 12.000 nv.

Trisomas y Edad Materna

La mayora de las trisomas aumenta su prevalencia a medida que avanza la EM. 2 factores: Por envejecimiento celular y cambios en el medio hormonal; Se pierde la capacidad de reconocer concepciones anormales y eliminarlas. Ej. Down: en < 30 aos 1/800; a los 35 aos 1/400; a los 40 aos 1/100.

Aneuploidas Gonosmicas
Las consecuencias son menos graves que las aneuploidas de los autosomas, debido a la inactivacin del X.

Ejemplos
Monosoma del X (45, X0), Sindrome de Turner: frecuencia 1 en 2700 mujeres nv.

Sindrome de Klinefelter (47,XXY): 1 de cada 1.000 varones nv.

(47,XXX): 1 de cada 1.000 mujeres nv. 48,XXXX o 49,XXXXX: aumento del retraso mental y fsico. 47,XYY: 1 en 1.000 varones nv (trastornos menores de conducta y CI disminudo levemente).

Resumiendo
Del total de concepciones humanas: 50 % terminan en abortos ocultos 10 % terminan en abortos reconocidos 80 % en el 1er trimestre 50% por AC AC: 52 % T Autosomas; 20 % M X; 16 % 3n; 6 % 4n; 4 % ACE; 2 % Otros. 40 % llegan a trmino

Anomalas de la estructura cromosmica

Desequilibradas: la redistribucin causa una prdida o ganancia de material cromosmico. Equilibradas: no hay prdida ni ganancia. Las anomalas estructurales, especialmente las desequilibradas, pueden originar enfermedades en los individuos o en su descendencia.

Equilibradas
Translocaciones: intercambio de material gentico entre cromosomas no homlogos. Frecuencia 1/500 individuos. Translocaciones Recprocas: las roturas ocurren en dos cromosomas diferentes y el material se intercambia mutuamente. El portador suele ser normal, su descendencia puede ser: normal, portadora de la translocacin o presentar duplicaciones o deleciones del material gentico.

Translocaciones Robertsonianas: se pierden los brazos cortos y se funden los brazos largos de los cromosomas 13, 14, 15, 21 y 22. El nro. cromosomico disminuye en 1. El portador presenta fenotipo normal, pero su descendencia puede heredar la adicin o prdida de un cromosoma acrocntrico. Ej.: t(14;21) segregacin adyacente: S. Down

Inversin: es el resultado de dos roturas en un cromosoma, seguidas de la reinsercin del fragmento en orden invertido. Puede ser: i. Pericntrica (incluye el centrmero) o i.Paracntrica (no lo incluye). Alrededor de 1 de cada 1.000 personas es portadora de una inversin. Los progenitores suelen tener fenotipo normal, pero pueden tener hijos con duplicaciones o deleciones.

Desequilibradas
Deleciones: causada por una rotura cromosmica y la consiguiente prdida del material gentico Ejs.: - S. de cri-du-chat: del (5p) - S. De Wolf: del (4p)

Microdeleciones: deleciones muy pequeas, identificadas con las tcnicas de bandeo de alta resolucin y citomoleculares. Ejs.: S. de Prader-Willi (15q paterno); S. de Angelman (15q materno). Duplicaciones: copias extras de un segmento cromosmico. Pueden originarse de cruzamientos desiguales o aparecer en la descendencia de portadores de una translocacin recproca.

Resumiendo Anomalas cromosmicas

Expresin fenotpica La mayora se asocia con retraso del desarrollo en nios y retraso mental. Alteraciones de la morfognesis facial, que producen rasgos caractersticos. Retraso del crecimiento. En la mayora de los trastornos cromosmicos autosmicos aparecen con frecuencia aumentada defectos cardacos congnitos.

Citogentica del Cncer

Mientras las cromosopatas se producen por errores en las gametas, las redistribuciones cromosmicas en clulas somticas son causantes de tumores. La combinacin de citogentica convencional, FISH y anlisis molecular permite la clasificacin de las neoplasias y la monitorizacin del efecto del tratamiento. Leucemias LMC t(9;22) (q34;q11) LMA t(8;21) (q22;q22) Tumores slidos Linfoma de Burkitt t(8;14) (q24;q32) Retiniblastoma del (13) (q14) Tumor de Wilms del (11) (p13)

Cundo se solicita un cariotipo?

Diagnstico Prenatal Edad materna ( > 35 aos); Alto riesgo determinado mediante marcadores bioqumicos en suero materno y ecogrficos; Alteraciones cromosmicas estructurales balanceadas en los padres; Hijos previos con Cromosomopatas o Retraso mental; Infertilidad en la pareja; Riesgo laboral.
Diagnstico Postnatal Facies peculiar; Microcefalia; Prematuridad; Genitales ambiguos; Ginecomastia; Retraso del desarrollo y trastornos del aprendizaje; Retraso mental; Talla alta/baja; Amenorrea; Abortos repetidos; Azoospermia; Tumores slidos y leucemias

Mutagnesis
La citogentica se utiliza tambin para medir el efecto de agentes mutagnicos valorando la presencia de ACN y ACE.

Mutagnesis
Agentes genotxicos (qumicos, fsicos y biolgicos), artificiales y naturales, pueden producir alteraciones sobre el genoma, en clulas somticas y germinales. Estos eventos pueden ser causa de cncer y defectos del desarrollo.
Qumicos: existen ms de 70.000 sustancias qumicas, muchas de ellas genotxicas. Fsicos: radiaciones ionizantes (rayos X) y no ionizantes (rayos UV). Biolgicos: virus.

Ensayos de Genotoxicidad
Se pueden utilizar para evaluar el accionar de diversos agentes mutagnicos.

De Nivel Primario: procariotas. De Nivel Secundario: lneas celulares. De Nivel Terciario: animales de laboratorio. De Nivel Cuaternario: poblaciones expuestas.
Existen diversas tcnicas citogenticas para realizar esta evaluacin: Anlisis de Aberraciones Cromosmicas Estructurales (ACE). Ensayo de microncleos (MN). Ensayo de electroforesis en gel de clulas individuales (Cometa).

Anlisis de ACE
TIPO SUBCROMTIDA
-Brechas intersticiales o gaps (chtg, chrg) - Adhesividad cromosmica (tas)

TIPO CROMTIDA

- Fractura de cromtida (chtb, chrb)

TIPO CROMOSOMA

- Cromosomas en anillo (r)

-Intercambios Asimtricos o Cromosomas dicntricos (dic)

-- Fragmentos Cromosmicos (ace)

Ensayo de MN
Los MN son pequeas masas de cromatina que se ubican prximos a los ncleos en interfase. Se originan durante la divisin celular por la prdida de fragmentos y/o cromosomas enteros. Permiten detectar diferentes tipos de lesiones: Roturas de doble cadena del ADN Roturas de cadena simple Cromosomas dicntricos Necrosis y apoptosis

0.5 a 5 ml de sangre perifrica (heparina) siembra de las clulas en medio de cultivo (aminocidos, vitaminas, sales, nucletidos) + suero (hormonas y factores de crecimiento) + antibitico + mitgeno (induce la divisin celular; Ej.: Fitohemaglutinina) Incubacin a 37 C durante 72 hs Agregado de un agente bloquedor de la citosinesis (impide la formacin de la membrana plasmtica; Ej.: citocalasina B) Agregado de solucin hipotnica (para lograr dispersin cromosmica) Fijacin de las clulas (detiene la auto lisis y preserva el material) Goteo del material sobre portaobjetos Coloracin (homognea o bandeo)

Ensayo Cometa
Consiste en la electroforesis en gel de clulas nicas. Es una tcnica muy sensible que detecta rompimientos de cadenas sencillas. Se basa en la migracin, durante la electroforesis, de fragmentos rotos de ADN. Se mezclan las clulas con agarosa y se siembran en un portaobjetos que presenta otra capa de agarosa, se sumergen en solucin de lisis y se desnaturaliza el ADN. Luego se realiza la corrida electrofortica. Se colorea el ADN con bromuro de etidio y se estima el dao en el ADN a partir de la observacin del cometa.

Concluyendo
Una clula mutada puede desencadenar: Procesos neoplsicos, teratognicos o apoptticos.

En los estudios de monitoreo genotxico es importante contar con biomarcadores de gran sensibilidad y bajo costo, que puedan ser aplicadas en diversos tipos de muestras y poblaciones.

Dieta

Exposicin a carcingenos dietarios Farmacognesis Sntesis y Reparacin del ADN Apoptosis

Estabilidad Genmica Micronutrientes

Importantes en la prevencin de Enfermedades Degenerativas.

Niveles sub-ptimos Fracturas en la cadena de ADN Lesiones oxidativas

Bibliografa Sugerida
Jorde LB, Carey JC, Bamshad MJ, White RL (2004). Gentica Mdica. Harcourt Brace. Espaa. Solari AJ (2004). Gentica Humana. Fundamentos y aplicaciones en medicina. Ed Mdica Panamericana. Argentina. McKinlay RJ, Sutherland GR (1996). Chromosome Abnormalities and Genetic Counseling. Oxford University Press. Oxford.