PURIFICACIN Y CARACTERIZACIN DE DOS INVERTASA DE CIDO SOLUBLE ISOENZIMAS DE FRUTA DE PERA JAPONESA

Hiroshi Hashizume, Koji Tanase 1 , Katsuhiro Shiratake, Hitoshi Mori 2 , Shohei Yamaki * Laboratorio de Ciencias Hortcolas, Escuela Graduada de Ciencias Bioagriculturales, Universidad de Nagoya, Chikusa, Nagoya 464-8601, Japn Recibido el 21 de agosto de 2002; recibido en forma revisada 24 de enero 2003.

Abstracto Dos isoenzimas (AIV AIV I y II) de la invertasa cida soluble (EC 3.2.1.26) se purificaron de fruta de pera japonesa a travs de procedimientos incluidos (NH 4 ) 2 SO 4 precipitacin, cromatografa de columna de DEAE-Sephacel, Concanavalina A (ConA)-Sepharose afinidad cromatografa, cromatografa en columna de hidroxiapatita y cromatografa Mono Q HR 5/5 columna. Las actividades especficas de purificado AIV I y II fueron AIV 2670 y 2340 (protena nkat / mg), respectivamente. AIV yo era una enzima monomrica de 80 kDa, mientras que AIV II puede ser tambin una enzima monomrica, que es fcil de ser escindido a 52 kDa y 34 kDa de polipptidos durante la preparacin por SDSPAGE. Los valores de K m de sacarosa de AIV AIV I y II fueron 3,33 y 4,58 mm, respectivamente, y el pH ptimo de tanto actividades de la enzima fue de pH 4,5. # 2003 Publicado por Elsevier Science Ltd. Palabras clave: (Pyrus serotina) Fruta Pera japonesa; invertasa cida soluble (AIV, EC 3.2.1.26), la purificacin de enzimas, isoenzimas de la AIV.

INTRODUCCIN Invertasa (bd-fructofuranosidasa) escinde sacarosa glucosa y fructosa. En general, las plantas superiores contienen una familia de invertasas, que puede ser discriminado en tres tipos de enzimas, a saber, vacuolar, la pared celular y (citoslicas Tymowska-Lalanne y Kreis, 1998) queridos. Invertasa cida con pH ptimos (cido invertasa; AIV) es localizada ya sea en la vacuola o en la pared celular. La ex es una protena soluble en la vacuola, que es AIV soluble (EC 3.2.1.26). En los rganos de almacenamiento, soluble AIV se purific a partir de raz primaria de la remolacha ( Leigh et al., 1979 ), Grano de maz ( Doehlert y Felker, 1987 ), disparar de Jerusaln airtichoke ( Goupil et al., 1988 ), la patata tubrculo ( Burch y col., 1992 ) Y del melocotn ( Moriguchi et al., 1991 ). Adems,

AIV soluble tiene dos o ms isoenzimas, que se purific y se caracteriz a partir algunas plantas ( Arai et al, 1991;. Obenland et al, 1993.; Tang et al., 1996 ). Sin embargo, hay pocos informes que soluble en AIV isoenzimas se purificaron a partir de fruta ( Yelle et al., 1991 ). AIV Soluble desempea importantes funciones biolgicas relacionada con el metabolismo de sacarosa y presumiblemente hidrolizar la sacarosa para suministrar hexosa para el crecimiento celular y desarrollo ( Morris y Arthur, 1984; Pfeiffer y Kutschera, 1995; Tang et al, 1996;. Woodson y Wang, 1987 ). Su actividad tambin se ha producido en estrecha colaboracin la correlacin de la relacin de sacarosa / hexosa en sinkorgan de fruto de tomate ( Ohyama et al., 1995 ) Y tubrculos de patata ( Zrenner et al., 1996 ) Transformado por el gen antisentido de AIV soluble. Adems, en la hidrlisis de la sacarosa vacuola por AIV soluble relaciona estrechamente con la expansin de clulas toda la regulacin de la presin osmtica ( Klann et al., 1996 ). En pera japonesa, la actividad AIV soluble fue rica en frutas jvenes y disminuy durante la maduracin de frutas cin en el que la fruta acumulado una gran cantidad de sacarosa ( Moriguchi et al, 1992;. Tanase y Yamaki, 2000). Sin embargo, todava no est claro si la disminucin de la AIV soluble actividad est relacionada con la acumulacin de sacarosa como el fruto madura ( Moriguchi et al., 1992 ). Tal vez, la presencia de diferentes isoenzimas que se necesita para lograr apropiado diferentes funciones, que pueden ser regulados diferencialmente. En el Page 1 Purificacin y caracterizacin de dos invertasa de cido soluble isoenzimas de fruta de pera japonesa Hiroshi Hashizume, Koji Tanase 1 , Katsuhiro Shiratake, Hitoshi Mori 2 , Shohei Yamaki * Laboratorio de Ciencias Hortcolas, Escuela Graduada de Ciencias Bioagriculturales, Universidad de Nagoya, Chikusa, Nagoya 464-8601, Japn Recibido el 21 de agosto de 2002; recibido en forma revisada 24 de enero 2003 Abstracto Dos isoenzimas (AIV AIV I y II) de la invertasa cida soluble (EC 3.2.1.26) se purificaron de fruta de pera japonesa a travs de procemientos incluidos (NH 4 ) 2 SO 4 precipitacin, cromatografa de columna de DEAE-Sephacel, Concanavalina A (ConA)-Sepharose afinidad cromatografa, cromatografa en columna de hidroxiapatita y cromatografa Mono Q HR 5/5 columna. Las actividades especficas de purificado AIV I y II fueron AIV 2670 y 2340 (protena nkat / mg), respectivamente. AIV yo era una enzima monomrica de 80 kDa, mientras que AIV II puede ser tambin una enzima monomrica, que es fcil de ser escindido a 52 kDa y 34 kDa de polipptidos durante la preparacin por SDS-PAGE. Los valores de K m de sacarosa de AIV AIV I y II fueron 3,33 y 4,58 mm, respectivamente, y el pH ptimo de tanto actividades de la enzima fue de pH 4,5. # 2003 Publicado por Elsevier Science Ltd. Palabras clave: (Pyrus

serotina) Fruta Pera japonesa; invertasa cida soluble (AIV, EC 3.2.1.26), la purificacin de enzimas, isoenzimas de la AIV 1. Introduccin Invertasa (bdfructofuranosidasa) escinde sacarosa glucosa y fructosa. En general, las plantas superiores contienen una familia de invertasas, que puede ser discriminado en tres tipos de enzimas, a saber, vacuolar, la pared celular y (citoslicas TymowskaLalanne y Kreis, 1998 ) queridos. Invertasa cida con pH ptimos (cido invertasa; AIV) es localizada ya sea en la vacuola o en la pared celular. La ex es una protena soluble en la vacuola, que es AIV soluble (EC 3.2.1.26). En los rganos de almacenamiento, soluble AIV se purific a partir de raz primaria de la remolacha ( Leigh et al., 1979 ), Grano de maz ( Doehlert y Felker, 1987 ), disparar de Jerusaln airtichoke ( Goupil et al., 1988 ), la patata tubrculo ( Burch y col., 1992 ) Y del melocotn ( Moriguchi et al., 1991 ). Adems, AIV soluble tiene dos o ms isoenzimas, que se purific y se caracteriz a partir algunas plantas ( Arai et al, 1991;. Obenland et al, 1993.; Tang et al., 1996 ). Sin embargo, hay pocos informes que soluble en AIV isoenzimas se purificaron a partir de fruta ( Yelle et al., 1991 ). AIV Soluble desempea importantes funciones biolgicas relacionada con el metabolismo de sacarosa y presumiblemente hidrolizar la sacarosa para suministrar hexosa para el crecimiento celular y desarrollo ( Morris y Arthur, 1984; Pfeiffer y Kutschera, 1995; Tang et al, 1996;. Woodson y Wang, 1987 ). Su actividad tambin se ha producido en estrecha colaboracin la correlacin de la relacin de sacarosa / hexosa en sinkorgan de fruto de tomate ( Ohyama et al., 1995 ) Y tubrculos de patata ( Zrenner et al., 1996 ) Transformado por el gen antisentido de AIV soluble. Adems, en la hidrlisis de la sacarosa vacuola por AIV soluble relaciona estrechamente con la expansin de clulas toda la regulacin de la presin osmtica ( Klann et al., 1996 ). En pera japonesa, la actividad AIV soluble fue rica en frutas jvenes y disminuy durante la maduracin de frutas cin en el que la fruta acumulado una gran cantidad de sacarosa ( Moriguchi et al, 1992;. Tanase y Yamaki, 2000 ). Sin embargo, todava no est claro si la disminucin de la AIV soluble actividad est relacionada con la acumulacin de sacarosa como el fruto madura ( Moriguchi et al., 1992 ). Tal vez, la presencia de diferentes isoenzimas que se necesita para lograr apropiado diferentes funciones, que pueden ser regulados diferencialmente. En 00319422/03 / $ - see front matter # 2003 Publicado por Elsevier Science Ltd. doi: 10.1016/S0031-9422 (03) 00107-9 Fitoqumica 63 (2003) 125-129 www.elsevier.com / locate / Phytochem * Autor para correspondencia. Fax: +8152-789-4025. E-mail: yamaki@agr.nagoya-u.ac.jp (S. Yamaki). 1 Direccin actual: Instituto Nacional de Floricultura Science, 360 Ano, Mie 514-2392, Japn. 2 Direccin actual: Divisin de Biologa del Desarrollo de sealizacin, Escuela de Graduados de Ciencias Bioagriculturales, Universidad de Nagoya, Chikusa, Nagoya 464-8601, Japn.

Para probar esta hiptesis, primero es necesario purificar soluble AIV isoenzimas y comparar sus propiedades. Los resultados de este esfuerzo se discuten a continuacin:

2. Resultados y discusin 2.1. La separacin y purificacin de dos isoenzimas de AIV en Pera japonesa AIV soluble de fruta de pera japonesa fue parcialmente purificada a travs de los procesos de sulfato de amonio precipitacin, cromatografa de DEAE-Sephacel y Cromatografa ConA-Sepharose ( Tabla 1 ). Parcialmente soluble en AIV isoenzimas purificadas se separaron y PUR- ified por la hidroxiapatita y cromatografa Mono Q- grafa. Como se muestra en la figura. 1 , La hidroxiapatita cromatografa (HA-1000) mostr dos picos de grandes Actividad AIV. Los primeros peakwas eluidas por la baja Na- concentracin de tampn de fosfato, y se define como AIV I. El segundo pico, que se eluy por alto Na-fosfato concentracin de tampn fosfato, se defini como AIV II. La ocurrencia de dos isoenzimas se inform tambin en mungo frijol ( Arai et al., 1991 ). Este fue un paso muy eficaz para AIVs separar y purificar, aunque una gran cantidad de la actividad se perdi. Despus de la cromatografa de hidroxiapatita, cada actividad peakof se purific adicionalmente de forma individual mediante cromatografa de intercambio aninico Mono Q. AIV I y AIV II se purificaron a las actividades especficas de 2670 y 2340 (protena nkat / mg), respectivamente, segn los procedimientos descritos en la Tabla 1 . La recuperacin de los AIV AIV I y II fue muy baja (1,38 y 0,62%, respectivamente) en comparacin con otras especies vegetales. La niveles de purificacin de virus de influenza aviar I y AIV II fueron 351 y 307 veces, respectivamente, de la actividad inicial medido despus de precipitacin con sulfato amnico. La especfica actividades de AIV I y AIV II fueron similares a los de los plntulas de frijol mungo ( Arai et al., 1991 ), Cebada deja ( Obenland et al., 1993 ) Y hojas de Arabidopsis thaliana ( Tang et al., 1996 ). 2.2. El peso molecular y la construccin subunidad La actividad peakof en AIV I o AIV II apareci en la misma fraccin (66.000 daltons) en el Superose 12 filtracin en gel (datos no mostrados). Anlisis por SDS-PAGE de la protena purificada de virus de influenza aviar que revel una sola protena con banda de 80 kDa ( . Fig. 2A, carril 1 ). El M r de AIV I era casi el mismo que el valor obtenido para el nativo protena por filtracin en gel Superose 12. Por lo tanto, AIV I es una protena monomrica similar a virus de influenza aviar I en hojas de cebada ( Obenland et al., 1993 ) Y el virus de influenza aviar en el tubrculo de la patata ( Burch et al., 1992 ). Por otro lado, la preparacin final de AIV II contena un total de tres bandas (80 kDa, 52 kDa y 34 kDa) como revelaron por SDS-PAGE ( . Figura 2B , carril 1). Transferencias de Western utilizando anticuerpos policlonales producidos en contra de los 38 kDa y 30 kDa de polipptidos de polipptidos de frijol mungo AIV (

Arai et al., 1991 ) puso de manifiesto las principales polipptidos en SDS-PAGE sean diferentes ( . Figura 2A y B , Carriles 2 y 3). El anticuerpo contra los 38 kDa polipptido es monoespecfico, mientras que el anticuerpo contra el polipptido de 30 kDa puede reaccionar de forma cruzada con la glicoprotenas. Los 80 y 52 kDa polipptidos de AV II claramente una reaccin cruzada con el anticuerpo contra la 38 kDa de polipptidos, mientras que los polipptidos de 34 kDa AIV II fueron reconocidos por slo el anticuerpo de 30 kDa lo que sugiere polipptido que los 52 y 34 kDa de poli- pptidos de AIV II de Pera japonesa frutas correspondieron a los 38 y 30 kDa polipptidos de frijol mungo AIV, respectivamente. La escisin proteoltica se ha informado de invertasas de hojas de cebada ( Obenland et al, 1993. ), Car- pudricin de plntulas ( Unger et al., 1992 ) Y frijol mungo semillas plntulas ( Arai et al., 1991 ). Adems, la recuperacin de la AIV II la actividad es menor que en AIV I como se muestra en la Tabla 1 , Por- HAPS debido a su menor estabilidad. 2.3. El pH ptimo Las actividades de escisin de sacarosa de tanto virus de influenza aviar I y II AIV se observaron en el intervalo cido. Ellos fueron los ms altos en pH 4,5 y se redujo drsticamente a un pH mayor (datos no mostrados), lo que implica que estos invertasas son invertasas cido.

2.4. Los parmetros cinticos y la especificidad por el sustrato Sacarosa reacciones de escisin de estas enzimas casi conformados a la cintica de Michaelis-Menten (Fig. 3).mLos parmetros cinticos de Lineweaver-Burkplot se muestran en la Tabla 2. Para AIV I, el valor de Km para la sacarosa fue de 3,3mM, que era casi el mismo que el de AIV II (4,6mM), y tambin como la de virus de

influenza aviar en fruta del melocotn (4,2 mM, Moriguchi et al., 1991), virus de influenza aviar en plntulas de zanahoria (5,0 mM, Unger et al., 1992) y INV1 y INV3 en Arabidopsis hojas thaliana (5,0 mM, Tang et al., 1996). Sustrato especificidad conocida por otros virus de influenza aviar (Pressey y Avants, 1980) se determinaron con el japons pera AIV isoenzimas. Estas enzimas tambin hidrolizadas y rafinosa estaquiosa, aunque las actividades eran aproximadamente 20 y 18% del de la sacarosa como sustrato, respectivamente (Tabla 3). Estas enzimas fueron incapaces de hidrolizar la lactosa, maltosa, trehalosa, melezitosa y melibiosa. La especificidad de sustrato es consistente con la de un b-fructofuranosidasa. Hay algunos informes acerca de la expresin de genes de AIV isoformas solubles, aunque la diferencia funcional de sus isoenzimas es ambiguo. En uva, dos ADNc(GIN GIN 1 y 2) se han clonado a partir de bayas (Davies y Robinson, 1996). La expresin de ambos genes era altamente activa en los jvenes berry antes de acumular mucho hexosa, y disminuy con la maduracin. Ambos mostraron el mismo patrn de expresin en baya. Sin embargo, en la hoja el GIN 1 se expres altamente en hojas sin expandir en comparacin con el GIN 2. En raz de zanahoria, dos isogenes SI y SII se clonaron (Unger et al., 1994). sI era expresada principalmente en la raz primaria, mientras que se expres altamente con la expansin de la raz primaria. Se sugiri que la expresin de sII controla la cantidad

y la composicin de azcar en la vacuola , y relacionado claramente para el crecimiento de la raz primaria ( Sturm et al . , 1995 ) . En japons pera , la actividad AIV soluble fue alta en frutos jvenes y la disminucin de la fruta durante la ampliacin ( Moriguchi et al. , 1992 ) . Sin embargo , no est claro cmo las dos isoenzimas del cambio AIV soluble durante el desarrollo del fruto . adems estudios sobre la regulacin de genes de virus de influenza aviar I y II ser necesaria para aclarar los detalles de sus funciones fisiolgicas de la fruta de pera japonesa.

3 . experimental 3.1 . Los materiales vegetales Frutos jvenes de japoneses pera ( Pyrus serotina Rehder var . culta Rehder cv. ' Hosui " ) se recogieron el 19 de junio y 21 en la huerta de Nomura en Anjo en Aichi- pref. Japn. Carne tejidos se extirparon y se almacenaron a ? 80 ? C despus de la congelacin en nitrgeno lquido. 3.2 . Purificacin de la AIV Todos los procedimientos se llevaron a cabo a 4 C. Para la purificacin de virus de influenza aviar soluble , tejido carne congelada ( 2 kg ) de carne joven japonesa de pera se homogeneizaron en 6 l de Tampn de fosfato de sodio 0,15 M ( pH 7,0 ) que contiene 1 mM EDTA , 10 mM de Na - ascorbato , 10 mM de b mercaptoetanol , 2 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo ( PMSF ) y 10 % PVPP insoluble . El homogeneizado se filtr a travs de 4 capas de gasa y se centrifug a 10.000 g durante 30 min . Se aadi sulfato de amonio slido al sobrenadante y el precipitado formado entre 40 y 80 % de saturacin de sal se recogi por centrifugacin a 10.000 g durante 30 min . El precipitado se resuspendi en un pequeo volumen de 10 mM de Na fosfato tampn ( pH 6,5 ) que contiene 1 mM de DTT ( tampn A ) , dializada frente a tampn A y adsorbida a DEAE Sephacel ( Amersham Pharmacia ) ( 2,5 cm de di ? 11 cm) equilibrada previamente con tampn A. El gel se lav con tampn A , a continuacin, las protenas se eluyeron con 400 ml de la elucin medio que dio un gradiente lineal de 0-350 mM NaCl en tampn A. Las fracciones activas se aplicaron a una Columna de Con-A Sepharose ( Amersham Pharmacia ) afinidad ( 1 cm d.i. ? 13 cm) previamente equilibrada con 10 tampn de fosfato de sodio mM ( pH 6,5 ) que contiene 0,5 M De NaCl , 1 mM de CaCl2 , MgCl2 1 mM , MnCl2 1 mM y 1 mM TDT (tampn B). La columna se lav con 100 ml de tampn B y se eluy luego con tampn B que contiene 0,65 M a- metilmansido . Despus de la centrifugacin en un Centricon 50 tubo de microcentrfuga ( Amicon ), el activo fracciones se desalaron por NAP10 ( Amersham Pharmacia ) la columna . La muestra se adsorbe a un HA1000 Columna ( Tosoh Co. ) hidroxiapatita ( 0,8 cm de di ? 7,5 cm ) equilibrada con 5 mM de tampn de fosfato de sodio ( pH 6,5 ) que contiene 1 mM de DTT ( tampn C ) . El gel fue se lav con tampn C , a continuacin, las protenas se eluyeron con un gradiente lineal de tampn de fosfato de Na 5-200 mM ( pH 6,5 ) que contena DTT 1 mM . Las fracciones activas se recogieron y se disolvi en un pequeo volumen de 20 mM de BTP - MES ( pH 6,5 ) tampn que contiene 10 % de glicerol y 1 mM de DTT ( tampn D ) . La muestra se adsorbe a Mono Q ( Amersham Pharmacia ) ( 0,5 cm d.i. ? 5,0 cm) pre-equilibrada con tampn D. El gel se lav con tampn y a continuacin, las protenas se eluyeron con un lineal

gradiente de 0-500 mM de NaCl en tampn D. El pico fracciones se ajustaron a 10 % de glicerol y se almacenaron a 80 ? C.

3.3. Estimacin del peso molecular por electroforesis en gel de Superose 12 filtracin Se estimaron los pesos moleculares de AIVs solubles utilizando una columna de Superose 12 (1,0 cm d.i. 30 cm?; Amersham Pharmacia) de filtracin en gel. La protena estndar muestras (alcohol deshidrogenasa, 150,000; BSA, 66000; anhidrasa carbnica, 29000 y citocromo c, 12.400) se aplicaron a una columna Superose 12 equilibrada previamente con tampn A que contiene 150 mM de NaCl y 10% de glicerol, y correr con el mismo tampn. La fraccin se recogi en 0,5 ml cada uno y se ensayaron para la actividad del virus de influenza aviar y de la absorcin de protenas estndar muestras a 280 nm. 3.4. Ensayo de la actividad AIV soluble La mezcla de reaccin contena tampn de acetato 30 mM (pH 4,5), sacarosa 200 mM y solucin de enzima, y se incubaron durante 30 min a 30? C. La reaccin se detuvo mediante la adicin de tampn Tris - HCl 400 ( pH 8,5 ) . La actividad de virus de influenza aviar se determin mediante la medicin de la cantidad de azcar reductor formado . Produccin de glucosa se determin mediante el kit de prueba de glucosa ( Wako Pure Chemical Co. ) . Se determin la produccin de fructosa por el mtodo enzimtico de acoplamiento utilizando ATP , NADP + , la hexoquinasa, la fosfoglucosa isomerasa y glucosa 6-fosfato

deshidrogenasa ( Bernt y Bergmeyer , 1974 ) . Una nkatal se define como la cantidad de enzima que cataliza la formacin de 1 nmol de producto por seg . 3.5 . Determinacin del contenido de protenas El contenido de protena se midi por el mtodo de Bradford ( 1976 ) . BSA se utiliz como el estndar . 3.6 . SDS - PAGE e inmunotransferencia SDS - PAGE se llev a cabo como se describe por el mtodo de Laemmli ( 1970 ) . El gel se ti con AgNO3 usando Silver Stain Plus ( BIO -RAD ) . Para inmunotransferencia despus de SDS -PAGE , se transfirieron las protenas a una membrana de nitrato de celulosa usando un semi-seco secante aparato ( BIO - RAD ) basado en el procedimiento modificado de Towbin et al . , ( 1979 ) . Los pptidos se cruzadamente con anticuerpos de conejo planteadas contra el frijol mungo AIV soluble ( 38 kDa y 30 kDa de pptidos ) ( Arai et al . , 1992 ) . Agradecimientos Esta investigacin fue financiada en parte por una subvencin - en-Ayudas (N 10219203 ) del Ministerio de Educacin, Ciencia , Deportes y Cultura de Japn . Referencias Arai , M. , Mori , H. , Imaseki , H. , 1991 . Roles de origen metabolizar enzimas en el crecimiento de las plntulas . La purificacin de la invertasa de cido crecimiento hipoctilos de plntulas de frijol mungo . Plant Cell Physiol . 32 , 129198 . Arai , M. , Mori , H. , Imaseki , H. , 1992 . La clonacin y la secuencia de ADNc para una invertasa cido intracelular de hipoctilos etiolados de frijol mungo y la expresin del gen durante el crecimiento de las plntulas . Plant Cell Physiol . 33 , 245-252 . Bernt , E., Bergmeyer , H.U. , 1974 . d- fructosa . En : Bergmeyer , H.U. (Ed. ) , Mtodos de anlisis enzimtico . Academic Press, Inc, New York , pp 1304-1307 . Bradford , M. M. , 1976 . Un mtodo rpido y sensible para la cuantificacin de las cantidades de microgramos de protena utilizando el principio de proteindye vinculante . Anal. Biochem . 72 , 248-254 . Burch , LR , Davies , HV , Cuthbert , EM, Machray , GC, Hedley, P. , Waugh , R. , 1992 . La purificacin de la invertasa soluble de patata . Phytochem . 31 , 19011904 . Davies , C. Robinson, S. P. , 1996 . La acumulacin de azcar en las bayas de uva : Clonacin de ADNc putativo dos invertasa vacuolar y sus expresin en los tejidos vid . Plant Physiol . 111 , 275-283.

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