EXAMEN DE BIOQUIMICA

PRESENTADO POR: JACK ANDRS RINCN PREZ

PRESENTADO A: Ph.D. Vctor Ruiz

INSTITUTO TECNOLGICO TUXTLA GUTIRREZ MAESTRIA EN CIENCIAS EN INGENIERIA BIOQUIMICA TUXTLA GUTIRREZ 11/10/13

1. Estrategia experimental para DNA polimerasa B2 de Entamoeba histolytica. Cultivos de E. histolytica Se cultivaran de manera muy axenica trofozotos de E. histolytica en medio TYI-S33 suplementado con 15% de suero bovino a 37 oC (Diamond L, Harlow D et al. 1978, Pastor, Azuara et al. 2010).

Extraccin

El mtodo de extraccin se realizara modificando el mtodo propuesto por Venisse et al. El cual est hecho de la siguiente forma: Buffer de extraccion: 50 mM buffer fosfato sdico (pH 7.5) 1 mM polietileneglicol 1 mM fenilmetilsulfonil fluoruro 8 % (p/v) polivinilpirolidona 0.01 % (v/v) Triton X-100 1 2 Se centrifugara a 18000 rpm por 20min a 4oC. Se transferir el sobrenadante a un nuevo microtubulo y se mantendr el extracto crudo en hielo. Se analizara el extracto crudo de inmediato. La actividad de la muestra puede caer si se congela y descongela. Se pipeteara 1 ml de la mezcla de reaccin en microtubos de 1,5 ml. Se aadir 1 ~ 50 l del extracto crudo de la mezcla de reaccin, luego se aplicara vortex, y se grabara el punto de inicio de tiempo. Despus de aprox. 5 min se transferir la muestra a cubetas, para evitar la oxidacin (Venisse, Gullner et al. 2001)

Purificacin

El mtodo de purificacin de DNA polimerasa B2 se realizara por el mtodo modificado de Cann y et al. A partir de E. histolytica, se realizara el cultivo del protozoo hasta tener cultivos de 1 L de clulas que alberguen la enzima y se cosechara por centrifugacin a 7000 x g por 10 min. Los pellets de las clulas se suspendern en 30 ml de buffer (50 mM Tris-HCl [pH 8.0], 0.1 mM EDTA, 10% glicerol, 0.5 mM ditiotreitol) y ser lisado por dos pasos a travs de presin celular por prensa Francesa. El resultado de los lisado ser centrifugado a 48000 x g por 30 min y el sobrenadante de cada preparacin se calentara a 80C durante 15 min y luego se volver a centrifugar. El sobrenadante con el contenido de la DNA

polimerasa B2 se le aplicara a un gel de filtracin por columna (Superdex 200; Pharmacia) y se le adicionara buffer (50 mM Tris-HCl [pH 8.0], 0.1 mM EDTA, 10% glicerol, 0.5 mM ditiotreitol) para amortiguar, seguido con elucin con el mismo buffer (Cann, Ishino et al. 1999).

Identificacin

Para comprobar la activad de la polimerasa recombinante se modificara el mtodo utilizado por Pastor y et al. el cual se llevara a cabo ensayos de polimerizacin y se utilizara un sustrato de DNA de doble cadena en donde un plantilla de 42 bases se hibridara con un iniciador de 19 bases marcado con P 32. El buffer de reaccin estar formado por 50mM Tris pH 7, 10mM MgCl2, 1mM DTT, 1 x10-7 de enzima recombinante y 1 x10-6 de substrato de ADN de doble cadena. Los productos de reaccin se corrern en un gel de secuenciacin desnaturalizante al 14%(PastorPalacios and Tello-Ruiz).

Cuantificacin

La cuantificacin se realizara por el mtodo modificado de Cann y et al. la actividad de la DNA polimerasa B2 en extractos de clulas de E. histolytica. Extractos de clulas de E. histolytica se fraccionaran mediante una cromatografa de intercambio aninico, y se tomaran alcuotas de las fracciones y se analizara la actividad de la DNA polimerasa B2. Los picos de actividad que arroje se identificaran por medio de perfiles de elucin de gradiente de NaCl, lo picos tienen que se te obtengan tienen que coincidir con concentraciones de NaCl de aproximadamente 12 y 20 Mm (Cann, Ishino et al. 1999).

2. Caracterizacin bioqumica de la enzima DNA ligasa de T. vaginalis

En el trabajo realizado por Kaur, sugiere que la caracterizacin bioqumica de la enzima DNA ligasa de T. vaginalis puede ser estudiada usando una concentracin de sustrato y ezima en la relacin de 1:10 (enzima:sustrato) cuando aproximadamente el 50 % de ligacin es completa en 2 min. Como la relacin enzima a DNA se permitir la reaccin para ser disecada respatando los efectos de los cambios de condicin de la reaccin, por ejemplo temperatura o pH sobre los dos minutos iniciales de la reaccin donde la velocidad es directamente dependiente de la enzima(Kaur 2009).

Temperatura

La actividad de la enzima DNA ligasa de T. vaginalis puede ser determinada a diferentes temperaturas pero se determinara en un rango de 30 a 40 oC ya que en el trabajo de (Kaur 2009) se demostr que esta era su rango ptimo. Trichomonas vaginalis crece a 30 C - 35 C y la actividad enzimtica ptima a estas temperaturas se ver reflejado claramente en las condiciones fisiolgicas de crecimiento del parsito que sirve como fuente para la DNA ligasa (Kaur 2009).

pH

La actividad de DNA ligasa de T. vaginalis se determinara a un pH 7 a 7.5 y se utilizara un buffer C (1 mM DTT, 1 mM ATP y 10 mM MgCl2) y adems 50 mM TrisHCl o 50 mM MOPS o 50 mM buffer de citrato sdico ya que se segn el trabajo realizado por Kaur la DNA ligasa no parece ser tolerante a niveles de pH altos y solo mantiene un 56% de su mxima actividad a un pH de 8(Kaur 2009).

3. Secuencia de aminocidos, modelo estructural y caractersticas bioqumicas de alguna extremo enzima de la familia de las cellulasas.

Considere trabajar con la Familia 1 B-glucosidasa De Thermotoga maritima en complejo con Lactam isofagomina ya que lo que Thermotoga martima, es una bacteria que es termfila y vive en niveles de temperatura muy altas y produce la extremo enzima B-glucosidasa que pertenece a la familia de las celulasas. Se utilizo como programa para poder ver la estructura de la enzima el Cn3d y se utilizo la bases de datos de estructuras de protenas de National Center for Biotechnology information, la cual su pgina web es http://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/

Fig. 1 Familia 1 B-glucosidasa De Thermotoga maritima en complejo con Lactam isofagomina (Madej, Addess et al. 2012)

Referencias

Cann, I. K., Ishino, S., Nomura, N., Sako, Y., & Ishino, Y. (1999). Two Family B DNA Polymerases from Aeropyrum pernix, an Aerobic Hyperthermophilic Crenarchaeote. JOURNAL OF BACTERIOLOGY, 181(19), 5984-5992. Diamond L, S., Harlow D, R., & Cunnick C, C. (1978). A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 72, 431432. Gmez-Gutirrez, J. G., Bermdez-Humarn, L. G., Tamez-Guerra, R., AdameRodriguez, J. M., & Montes-de Oca Luna, R. (2002). Produccin y purificacinde la Taq DNA polimerasaa partir de E. coli recombinante. CIENCIA UANL, 5(3), 316. Kaur, L. (2009). Developing an Assay to Screen Inhibitors for various ATPdependent ligases. Tesis doctoral, University of Westminster. Madej, T., Addess, K., Fong, J., Geer, L., Geer, R., Lanczycki, C., . . . Bryant, S. (2012). MMDB: 3D structures and macromolecular interactions. Nucleic Acids Res, 40. Pastor-Palacios, G., & Tello-Ruiz, M. K.-L. (n.d.). Clonacion y caracterizacion de una Dna polimerasa de Entamoeba histolytica: en busca de una dna polimerasa mitocondrial. Sociedad Mexicana de Bioqumica. Mxico, DF. Pastor-Palacios, G., Azuara-Liceaga, E., & Brieba, L. G. (2010). A Nuclear Family A DNA Polymerase from Entamoeba histolytica Bypasses Thymine Glycol. PLoS Negl Trop Dis, 4(8), e786.