Estudio del gen luxS en S.

typhimurium LT2
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Estudio del gen luxS y sus niveles de expresin en Salmonella entrica serovar Typhimurium LT2 en condiciones de estrs osmtico.
Constanza Galilea Solar, Eric Herdocio Canales #
Departamento de Ciencias Biolgicas, Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Andrs Bello, Av. Repblica 237, Santiago, Chile. Telfono: 661 8000. Fax: 6201120. E- mail: uandresbello@unab.cl

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Autor correspondiente. Correo electrnico: e.herdocio@uandresbello.edu; Direccin: Real Audiencia #1170 San Miguel, Santiago; Telfono: 61077859

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Resumen
El gen luxS codifica una enzima esencial para la sntesis de molculas sealizadoras conocidas como autoinductores (AI). La expresin de luxS puede verse fuertemente regulada bajo ciertas condiciones ambientales o frente a un aumento de la densidad poblacional, lo que culmina con el cambio del comportamiento de la poblacin bacteriana. Para estudiar la regulacin de luxS se gener una mutacin en dicho gen mediante el mtodo de recombinacin Red, obtenindose una cicatriz FRT que permiti realizar una fusin transcripcional lacZY al promotor luxS de Salmonella entrica serovar

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Typhimurium LT2. Esto nos permitira evaluar la expresin del gen luxS bajo condiciones de estrs osmtico y adems conocer la posible implicancia de ste sobre el proceso de formacin de biopelcula y la motilidad. La informacin obtenida sugiere que la presencia y expresin del gen luxS es importante para la motilidad bacteriana, pero no as para la formacin de biopelcula en S. typhimurium LT2.

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Introduccin
El Qurum sensing, tambin conocido como autoinduccin, es un mecanismo por el cual las bacterias regulan la expresin de un conjunto de genes especializados frente al aumento de la densidad poblacional, lo que les permite adaptarse y sobrevivir en el ambiente que los rodea (1). Este mecanismo implica la produccin de molculas de sealizacin extracelulares conocidas como autoinductores, los cuales son liberados al medio extracelular y cuando se alcanza una concentracin umbral de estos, se inicia una cascada de transduccin de seales que culmina en un cambio en el comportamiento de la poblacin y por ende, el control de procesos celulares (2). En general, cada especie bacteriana produce una molcula sealizadora distinta; en bacterias Gram positivo, la molcula encargada de la sealizacin clula clula es un oligopeptido, mientras que en especies Gram negativo es la acil homoserina lactona (AHL), que son sintetizadas mediante dos rutas metablicas distintas. Sin embargo, existe una tercera ruta metablica conocida como la ruta AI-2/LuxS, la cual se encuentra en especies Gram positivo y Gram negativo. El producto final de esta ruta metablica es una molcula conocida como 4,5-dihidroxi-2,3pentadiona (DPD), que deber pasar por distintas modificaciones intermoleculares antes de formar la molcula denominada AI-2. Los receptores para estas molculas sealizadoras unirn distintos estereoismeros de estas, por lo que sern capaces de reconocer sus mismos AI-2 y los de otras especies bacterianas, siendo conocido este sistema como un lenguaje universal (3). En algunas bacterias patgenas, se ha descrito que los AI-2 son capaces de regular distintos procesos fisiolgicos tales como: motilidad, formacin de biopelcula,

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virulencia, generacin de antibiticos, transferencia de plsmidos conjugativos y divisin celular, entre otras (4). La regulacin de la expresin del gen luxS no est limitada nicamente al aumento de la densidad poblacional, otros factores ambientales como el pH y la osmolaridad tambin podran tener influencia sobre sta. Las bacterias son capaces de sensar el medio ambiente y de esta forma modificar su expresin gnica para adaptarse a este. Estudios previos han demostrado que en algunos patgenos de la familia Enterobacteriaciae, la expresin del gen luxS est controlada por factores ambientales. Un aumento de la osmolaridad y la disminucin del pH mostraron un aumento en la expresin de dicho gen, mientras que un descenso en la osmolaridad y un aumento en el pH generaron la disminucin de la expresin (5,6). Si bien esto est descrito en patgenos de la familia Enterobacteriaciae como Shigella flexneri, Escherichia coli y Helicobacter pylori, en Salmonella

Typhimurium no lo est y tampoco hay informacin suficiente sobre su implicancia en la regulacin de ciertos procesos fisiolgico en dicha bacteria. Es por esta razn que para obtener una informacin ms completa sobre la regulacin del gen luxS en Salmonella entrica serovar Typhimurium LT2 , realizamos una mutante para el gen luxS mediante el mtodo de recombinacin Red (Wanner & Datsenko, 2000) con el fin de estudiar el papel de este gen sobre la motilidad y la formacin de biopelculas. A partir de esta mutacin se gener una fusin transcripcional lacZY al promotor de luxS, lo que nos permitira estudiar de forma cuantitativa y cuanlitativa los niveles de expresin de luxS bajo condiciones de estrs osmtico.

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Mtodos y materiales
Extraccin plasmidial. Se realiz la extraccin de los plsmidos pKD3, pKD4, pKD46, pCP20, pCE36, pCE37 (tabla 1), mediante lisis alcalina desde S.typhimurium LT2. Y para esto,se crecieron las bacterias toda la noche en 5 mL de medio de cultivo ms el antibitico correspondiente. Se concentraron mediante centrifugacin de 1,5 mL de clulas durante 3 minutos a 14.000 rmp (X3), posteriormente se resuspendi el pellet en 200 l de Buffer de lisis (Tris-HCl 25 mM pH 8, EDTA 10mM, Glucosa 50 mM) y se dej 5 min a T ambiente. Luego se agregaron 400 l de solucin desnaturante, SDS/NaOH (NaOH 0,2 M, SDS 1%), se mezcl suavemente por inversin y se dej en hielo por 10 minutos. Se agregaron 300 l de acetato de amonio 7,5 M y nuevamente se pusieron en hielo durante 10 minutos. Se centrifug 10 min a 10.000 rpm. Luego se recuper 800 L del sobrenadante.

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Posteriormente se agregaron 0,1 volmenes (vol) de acetato de sodio 3 M y 0,6 vol de isopropanol. Se mezclaron suavemente por inversin y dejaron a T ambiente durante 1015 min. Se centrifugaron 20 minutos a 14.000 rpm y se elimin el sobrenadante y se lav el pellet con 200 l de etanol 70% fro. Se centrifugaron por 5 minutos a 14.000 rpm, y se elimin el etanol, se dej secar. El pellet se resuspendi en 20 L de agua bidestilada estril. Para confirmar la extraccin de los plsmidos, se visualiz en un gel de agarosa al 0,8%. Se utiliz la tincin con bromuro de etidio y un Ladder de 1kb como estndar de peso molecular.

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Electrotransformacin de Salmonella entrica serovar Typhimurium LT2 con pKD46. Se cultiv la cepa en medio Luria Bertani (LB). Se realiz la preparacin de las clulas electrocompetentes. Se coloc el cultivo a 4C y se concentraron las clulas mediante centrifugacin a 13000 rpm por 5 minutos y se elimin el sobrenadante (x3). Se lav el pellet con 1 ml de agua destilada y se centrifugo por 3 min a 13.000 rpm (x3).

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Posteriormente se resuspendi el pellet en 50 L de agua destilada para obtener un volumen aproximado de 100 L de bacterias electrocompetentes. Se mezclaron 50 L del cultivo de bacterias con 1 L del plsmido pKD46 dializado y se electropor (2,5 KV, 25F, 800`). Las clulas se re suspendieron en 1 mL de medio LB y se incubaron por 1 h a 30C. Para confirmar la transformacin con pKD46 se tomaron 1 mL clulas electroporadas y de clulas control, se centrifugaron por 3 minutos a 13.000 rpm, se elimin el sobrenadante y se resuspendi el pellet y se sembraron en placas de agar LB con Ampicilina 20 g/mL. Las placas fueron incubadas a 30C O/N. Intercambio allico por producto de PCR. Para la interrupcin del gen luxS se procedi a generar un producto de PCR a partir del plsmido pKD3 como templado para amplificar el cassette con el gen cat, que se encuentra flanqueado por sitios FRT. La amplificacin por PCR fue realizada con Master Mix 2X 12,5 L (Buffer de PCR, MgCl2, dNTPs, taq polimerasa), 0,25 L de cada partidor (LuxSWF 5cgcagtcgatcatacccggatgcaagcgccggcggttccgggtgtagctggagctgcttc 3 , LuxSWR 5ctttcggcagcgccagctctttattgctgttcacgcgcacatgggaattagccatggtcc 3), 1 L DNA templado y

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11 L de agua destilada. El programa de PCR fue de 94C 10 min, 35 ciclos de 94C 30 s, 53C 30s, 72C 120 s y extensin final de 10 min de 72C. Finalmente el producto de PCR se someti a una electroforesis en gel de agarosa 0.8% utilizando 1 L de buffer de carga y 5 L de muestra. Ladder, GeneRuler 1kb DNA Ladder para comprobar la presencia del cassette de resistencia a cloranfenicol (gen cat). Fue visualizado con bromuro de etidio. Electrotransformacin de producto de PCR Se realiz la preparacin de las clulas electrocompetentes y se electropor, segn el mtodo previamente descrito a la cepa S.LT2 /pKD46 con el producto de PCR de pKD3 y se gener la mutante S. Typhimurium luxS::cat. Se sembraron 2 mL de la cepa S.LT2 /pKD46 en medio LB con ampicilina a 30C O/N (preinculo). Se agregaron 200 L del preinculo a 25 mL de LB con ampicilina suplementado con arabinosa, se incubaron a 30C con agitacin hasta DO600 = 0,4. Se centrifug por 10 min a 13.000rpm, el pellet obtenido se resuspendi en 1mL de agua destilada (x3). Se centrifug a 13.000 rpm por 3 minutos y el pellet se resuspendi en 50L de agua estril. Se mezclaron 50 L con 10 L del producto de PCR dializado generado previamente y se electrotransform (ver condiciones anteriores). Luego se incub durante 1 hora a 37C en 1mL de medio LB. Se centrifug por 3 min a 13.000 rpm, se elimin el sobrenadante y se re suspendi pellet. Para confirmar la presencia de pKD3 se plaquearon las clulas electroporadas y de clulas control en placas de agar LB con Cloramfenicol (20g/mL). Finalmente se incuban a 30 C O/N.

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PCR Confirmacin Genotpica. Para confirmar la mutacin del gen luxS, se extrajo DNA cromosomal de las colonias resultantes, Se cultivaron las bacteria O/N en 5 mL de medio LB mas cloranfenicol. Se centrifugaron 1,5 mL de clulas durante 3 min a 14.000 rpm (x3). Se resuspendi el pellet en 560 L de Buffer TE (Tris-HCl 10 mM pH 8, EDTA 1 mM). Se agregaron 30 L de SDS 10%. Se agitaron por inversin e incubaron por 1 h a 37C. Se agreg volumen de cloroformo: alcohol isoamlico (24:1) y volumen de fenol saturado bsico. Se agit hasta obtener una emulsin. Se centrifug por 5-10 min a 13000 rpm. Transfiri la fase acuosa y se precipit el DNA cromosomal agregando 0,1 volumen (vol) de acetato de sodio 3 M y 2,5 vol de etanol absoluto frio. Se mezclaron suavemente por inversin hasta la aparicin de precipitado y se dejaron a -20C por 10 min. Se centrifugaron durante 10 min a 13.000 rpm y se elimin el sobrenadante. Se lav el pellet con 500 L de etanol 70% fro. Centrifug por 5 min a 13.000 rpm. Se elimin el etanol, seco y disolvi el pellet en 50 L de agua bidestilada estril y se realiz un PCR. Se agreg 1 L de templado (WT y luxS::cat); 12,5 L de master mix (2X), 0,25L de cada primer (LuxS ComproF 5ccc gga aca aag agt tca gt 3,LuxS ComproR 5 tat tat tcg ctg ccc aaa gg 3) y 11L de agua destilada. El programa de PCR fue 94C 10 min, 35 ciclos de 94C 30 s, 55C 30s, 72C 120 s y extensin final de 10 min de 72C. Finalmente se realiz una electroforesis en gel de agarosa 0.8%, del producto amplificado por el PCR de colonias de la cepa S. Typhimurium luxS::cat y de la cepa wild type de S. typhimurium LT2 para determinar la presencia o ausencia del cassette de resistencia a cloramfenicol (gen cat).

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Ensayo de motilidad Se realiz un cultivo O/N de las bacterias a analizar. Posteriormente se inocul el centro de la placa de LB (0,8% de agar) con la cepa Wt y con la cepa luxS::cat. Luego se incub por 7 horas a 37C. Finalmente se midieron los halos de motilidad. Ensayo de biopelcula Se realiz un cultivo O/N de bacterias WT y de la cepa luxS::cat a analizar. Se diluy el cultivo 1:100 en medio LB. Posteriormente, se agregaron 100 L de la dilucin a cada pocillo de la placa. Se incub 36 horas a 37C. Se elimin el sobrenadante de cada pocillo, y luego se lav la biopelcula generada en cada pocillo con 100 L de agua destilada estril. Posteriormente se ti la biopelcula con 100 L de cristal violeta 0,01%, y se dej incubar por 10 min. Se elimin el exceso de colorante y se lav con 100 L de agua destilada estril. Luego se disuelvi el colorante retenido en la biopelcula con 100 L de etanol 95%, por 5 min. Finalmente se traspasaron 100 L a una nueva placa y se realiz una lectura a 595 nm. Remocin de cassettes gnicos flanqueados por secuencias FRT. Para el estudio de la regulacin de la expresin de luxS, se gener una mutante S. typhimurium luxS:: aph mediante el mtodo de Wanner & Datsenko, la cual se transform con el plsmido pCP20 utilizando los mismos protocolos descritos anteriormente. Se sembraron 100 L en placas de agar LB con ampicilina (100 g/ml). Se incub O/N a 30C. Para confirmar la remocin del cassette, las colonias obtenidas se plaquearon en agar

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LB con ampicilina (100 g/ml) incubndolas a 30C, LB con ampicilina (100 g/ml) a 37C y LB con Kanamicina a 30C. Fusin LacZY cromosomal. Para la generacin de la fusin LacZY cromosomal S.Typhimurium luxS::FRT/lacZY se realiz el mtodo descrito por Ellermeier (7) utilizando el plsmido pCE37. Se realizo la electrotransformacin del plsmido pCE37 mediante el protocolo descrito anteriormente. Para confirmar la transformacin con pCE37 se tomaron 1 mL clulas electroporadas y de clulas control, se centrifugaron por 3 minutos a 13.000 rpm, se elimin el sobrenadante y se resuspendi el pellet para luego sembrar en placas de agar LB con Kanamicina

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50g/mL e incubadas a 30C O/N. Ensayo -Galactosidasa. Se determin la actividad -Galactosidasa de la cepa S. Typhimurium luxS::pCE37 en forma cualitativa y cuantitativa. La primera se realiz con medio slido Agar MacConkey con kanamicina a 37C y la segunda se realiz con las bacterias en fase logartmica de la curva de crecimiento en medio LB lquido bajo 2 condiciones. La primera condicin es en medio LB, la segunda en medio LB + 0,5 p/v% NaCl. Luego de crecer las bacterias en estas condiciones, se detuvo el crecimiento ponindolas en hielo. Se alicuot para cada muestra 900 L de buffer Z (60 mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4, 10mM KCl, 1 mM MgSO4, 50 mM -mercaptoetanol, pH 7.0) en triplicado y se agreg 100 L de cultivo de cada condicin. Posteriormente, las clulas fueron permeabilizadas con 10 L de cloroformo y 10 L de SDS 0.1%, se agit en vortex por 10 segundos y luego fueron incubadas a 30C

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durante 10 minutos. Posteriormente se adicionaron

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galactopiransido (ONPG, 4 mg/mL). Se incub a 30C y se cronometr el tiempo de la reaccin hasta obtener un color amarillo. La reaccin se detuvo aadiendo 500 L de Na2CO3 1M. Se midi la absorbancia de las muestras a 420 y 550 nm.

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Resultados
Extraccin plasmidial. La presencia de los plsmidos extrados a partir de S. typhimurium LT2 utilizados en este trabajo se analizaron con una electroforesis en gel de agarosa en donde no es posible apreciar ningn amplicn asociada a alguno de los plsmidos que se extrajeron. Esto fue as, tanto para los plsmidos pKD3, pKD4 y pKD46 (Fig 1), como para pCE36, pCE37 y pCP20 (Fig 2). Amplificacin cassette de resistencia cat La amplificacin del casette de resistencia cat mediante PCR se observ mediante electroforesis en gel de agarosa, en donde se aprecia una banda (Fig. 3) Seleccin de transformantes pKD46 y producto de PCR Se observ crecimiento de colonias en la placa LB con ampicilina. El control negativo utilizado corresponde a S. typhimurium LT2 sin electrotransformar (Fig 4) Por otra parte, en las placas utilizadas para verificar la transformacin de la bacteria en estudio con el producto de PCR, el gen cat, se observ crecimiento en la placa LB con cloranfenicol, mientras que en la placa control no se observ nada. (Fig 4)

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Confirmacin genotpica de la mutagnesis Se observ en el gel de agarosa dos bandas; una para la cepa WT y para la mutante. El amplicn de de la cepa WT migr ms que el de la cepa mutante a lo largo del gel. No se observa ninguna banda para el carril del control. (Fig. 5) Ensayo motilidad El ensayo de motilidad se realiz para la cepa LuxS::cat y se utilizo como control una cepa WT. Se observ una disminucin en la motilidad de la cepa LuxS::cat en comparacin con la cepa WT(Tabla 2) Ensayo Biopelcula Se analiz la cantidad de biopelcula formada por la cepa WT y LuxS::cat. No se observ una diferencia significativa entre los valores de ambas cepas (Fig. 6) Seleccin de electrotransformantes pCP20 y perdida del casette de resistencia La electrotransformacin con el plsmido pCP20 (tabla 1) se realiz en una nueva mutante; luxS::aph. Los resultados para la seleccin de transformantes luxS::aph/pCP20 mostraron que hubo crecimiento en placas LB con ampicilina incubada a 30C y 37C. Tambin se aprecia crecimiento bacteriano en la placa LB con kanamicina.(Fig, 7)

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Ensayo -Galactosidasa. Los resultados obtenidos mostraron un aumento en las unidades Miller al someter a la bacteria en estudio a condicin de estrs osmolar. Se observa una disminucin de los valores de la absorbancia a 420 nm al aumentar la concentracin de NaCl y aumenta al medirla a 550 nm (Tabla 3)

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Discusin
El gen luxS codifica para la enzima s-ribosilhocisteinasa (LuxS) la cual cataliza la sntesis de los AI-2 (5). Se ha mostrado que los AI-2, el cual est involucrado en el proceso de qurum-sensing, posee un rol en la formacin de biopelcula y en la motilidad en mltiples especies. Para determinar si existe alguna relacin entre la expresin del gen luxS sobre la motilidad y formacin de biopelcula en S. typhimurium LT2, se realizo una mutacin sitio dirigida a este. Primero se hizo una extraccin de los plsmidos pKD3, pKD4 y pKD46 desde S. Typhimurium LT2 y para verificar la presencia de estos y su tamao, se realizo una electroforesis en gel de agarosa de la cual no se obtuvieron los resultados esperados (no se observaron banda). Esto puede deberse a una baja concentracin de los plsmidos en la clula de la cual se hizo la extraccin, as como a errores durante la extraccin. A partir del plsmido pKD3, se realiz la amplificacin del cassette resistencia cat presente en este. Los resultados mostraron una banda que corresponda al amplicn del gen cat , de aproximadamente 1003 pb (8). Antes de transformar la bacteria en estudio con el amplicn antes mencionado, se transform con el plsmido pKD46. Este plsmido tiene los genes necesarios que codificarn una serie de enzimas (tabla 1) que generarn el intercambio allico entre el gen luxS y el cassette de resistencia a cloranfenicol. Para verificar si las bacterias se electrotransformaron correctamente con este plsmido, estas se sembraron en placa LB con ampicilina y se incubaron a 30C. Las colonias que lograron transformarse son aquellas que crecieron en esta placa, ya que este plsmido tiene el gen bla que confiere resistencia a ampicilina. Estos resultados coinciden con lo descrito por Wanner & Datsenko. De la

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misma forma, coinciden los resultados obtenidos al realizar la transformacin con el casette de resistencia. Estos autores describen que al transformarse la bacteria con el producto de PCR, ocurrir la recombinacin homloga, integrndose el gen cat al genoma de la bacteria. As, se genera la cepa S. typhimurium LT2 y la seleccin de estos

transformantes se realiza en placa LB con cloranfenicol, en donde sern capaces de crecer. Nuestros resultados muestran que hubo crecimiento bacteriano en la placa conagar LB y cloramfenicol, mientras que las bacterias sin transformar con el producto de PCR, no lo hicieron. Seguido de la seleccin de transformante, se procedi a hacer un ensayo genotpico para conocer si efectivamente hubo el intercambio allico.

Se extrajo el DNA cromosomal de la cepa

y WT y se utilizaron partidores

para amplificar el gen luxS. La recombinacin homologa implica la integracin del gen cat en el cromosoma, especficamente en el gen luxS (6), por lo que el amplicn de la cepa fue ms grande (aproximadamente 1670 pb) y migr menos en el gel. El amplicn de la cepa WT migr ms debido a que no tena insertado el gen cat. Este amplicn tiene una tiene un tamao de 670 pb (9). Con respecto al estudio de motilidad entre la cepa WT y la cepa S. typhimurium LT2 luxS::aph, esta ltima mostr una disminucin de la motilidad. Esto, en concordancia con estudios previos realizados en Helicobacter pylori y Vibrio cholerae que mostraron la disminucin de la motilidad al realizar una mutacin en el gen luxS (10). En relacin a la formacin de biopelcula, los resultados obtenidos estn en oposicin a lo encontrado en la literatura, donde al mutar luxS se observa una disminucin de la formacin de biopelicula (11). En este estudio no se encontraron diferencias significativas entre los resultados de la cepa y WT.

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Se sabe que la expresin del gen luxS en Salmonella entrica serovar Typhimurium puede estar controlada por efectos ambientales como la osmolaridad y el pH. Para realizar el estudio de expresin, se realiz unafusin transcripcional al promotor del gen luxS. Para esto, se trabajo con una mutante luxS::aph generada mediante el mtodo descrito por Wanner y Datsenko, la cual se transform con el plsmido pCP20 con el fin de generar una cicatriz FRT.(Tabla 1). El plsmido pCP20 les entrega a las bacterias que lo obtienen, resistencia a ampicilina por lo que solo los transformante podrn crecer en medio con este antibitico (7). Nuestros resultados mostraron que hubo crecimiento bacteriano en agar LB con ampicilina, pero tambin se apreci crecimiento en la placa control, en donde se sembr con bacterias sin transformar con el plsmido pCP20 y se incub a 30C. Esto podra deberse a que, al generar la mutante luxS::aph, no se elimin correctamente el plsmido pKD46 (6), lo que podra estar generando la resistencia a ampicilina en las bacterias que no fueron transformadas con el plsmido pCP20. Para asegurar esto, se realiz una siembra de la cepa luxS::aph/pCP20 en agar LB con ampicilina a 30C; agar LB con ampicilina a 37C y LB con kanamicina a 30C. En el medio LB con ampicilina incubado A 30C, el plsmido pCP20 est activo y entrega resistencia a ampicilina, por lo que las bacterias deberan crecer. En el medio LB con ampicilina A 37C, el plsmido pCP20 no se replica debido a que presenta un origen de replicacin termosensible, por lo que no debera haber crecimiento bacteriano ya que no se sintetiza la enzima encargada de generar la resistencia a ampicilina. Para corroborar que el cassette de resistencia aph fue eliminado a travs de la enzima flipasa codificada en el plsmido pCP20 al incubarlo O/N a 30C, se sembr esta cepa en una placa LB con kanamicina (7). Los resultados obtenidos fueron opuestos a los descritos anteriormente; hubo crecimiento bacteriano en las tres

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placas. Es relevante el hecho de que en la placa con agar LB y ampicilina, haya habido crecimiento bacteriano. Tanto el plsmido pCP20 como pKD46 no pueden replicarse a 37C, por lo que la presencia de estos no es el culpable de generar la resistencia a ampicilina (6,7). Existe la posibilidad de que el plsmido pKD46 haya sido integrado al genoma durante el desarrollo de la tcnica de recombinacin Red o por una mutacin espontanea que le confiri la resistencia a ampicilina. El hecho de que la bacteria haya crecido en kanamicina, implica que no hubo una correcta transformacin con el plsmido pCP20, lo que confirma de cierta manera la posibilidad de que la resistencia a ampicilina se encuentre en el genoma de la bacteria. A partir de la cicatriz FRT generada por la remocin del cassette de resistencia gracias a la enzima FLP codificada en el plsmido pCP20, se realiz una fusin transcripcional lacZY La fusin transcripcional al promotor del gen luxS permitir conocer la cantidad de transcrito que se produce de dicho gen de forma indirecta mediante el uso de un gen reportero, en este caso fue la enzima -Galactosidasa que se encuentra codificada en el gen lacZ (7). Utilizando el plsmido pCE37 se logr generar la fusin al promotor de luxS. Las condiciones en las cuales se evalu la expresin del gen luxS fue estrs osmtico. Se ha observado en la literatura que la osmolaridad elevada est relacionada con un aumento de la expresin del gen luxS (12). Sin embargo, esto no fue posible de confirmar ya que no se obtuvo una diferencia significativa en la expresin de luxS en condiciones de alta osmolaridad en el ensayo de - galactosidasa, todo esto debido a errores durante el proceso experimental del ensayo. Del presente estudio se resume que en S.typhimurium LT2, la expresin del gen luxS no est relacionado con los procesos formacin de biopelcula, pero si con el aumento en la

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motilidad de las bacterias. Se ha mostrado en otros estudios que un aumento en la osmolaridad del medio, est relacionado a una regulacin positiva de la expresin de luxS, sin embargo en eeste estudio no fue posible de demostrarlo.

355 356 357 358 359 360 361 362 363 364 365 366 367 368

Agradecimientos

Agradecemos a las profesoras Pamela Machuca y Gabriela Gonzalez por entregarnos parte de sus conocimientos durante el desarrollo de este estudio.

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19 369

Referencias
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370 371 372 373 374 375 376 377 378 379 380 381 382 383 384 385 386

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20 387 388 389 390 391 392 393 394 395 396 397 398 399 400 401 402 403 404 405 406

7. Ellermeier C, Janakiraman A, Slauch J. 2002. Construction of targeted single copy lac fusions using Rad and FLP-mediated site-specific recombination in bacteria. Gene.290: p. 153-161. 8. Farjn M, Flores O, Navarro N, Pardo V, Mora G, Toro C. 2002.Molecular characterization of resistance mechanism to chloramphenicol in Shigella flexneri strains itolated from Chilean children with acute diarrhea. Revista mdica chilena. Vol. 130: n3. 9. Rezzonico F, Duffy B. 2007. The role of luxS inthe Fire Blight Patoghen Erwinia amylovara Is Limited to Metabolism and Does Not Involve Quorum Sensing.The American Phytophatological Society. Vol. 20: p. 1284 1297. 10. Biswas S, Mukherjee P, Kar S, Ghosh C. Identification of the Role of LuxS in the Regulation of Motility & the Expression of the Flagellar Structural & Functional Regulators in Vibrio Cholerae. 2012. Global Journals Inc. Vol. 12: 5 versin. 11. Sela S, Frank S, Belausov E, Pinto R. 2006. A mutation in the luxS gene Influences Listeria monocytogenes Biofilm Formation. AEM. Vol. 72: p 5653 5658. 12. Surette MG., Bassler BL.1999.Regulation of autoinducer production in Salmonella typhimurium. Molecular Microbiology. Vol. 31: p. 585595

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21 407 408 Plsmidos 409 pKD46 410 pKD3 411 412 413
MW 1 2 3

Tabla 1: plsmidos utilizados.

Caractersticas relevantes bla Pbad gam bet exo pSC101 oriTS bla FRT cat FRT PS1 PS2 Ori R6K bla cat cI857 flp pSC101 oriTS aph FRT lacZY+ this oriRK6

Referencia Datsenko & Wanner (2000) Datsenko & Wanner (2000) Datsenko & Wanner (2000) Ellermeier, Janakiraman & Slauch (2002)

pCP20 pCE37

414 415 416 417 418 419 420 421 422 423

Figura 1: anlisis de extraccin de plsmidos para mtodode Wanner y Datsenko. Electroforesis en gel de agarosa 0.8% : MW: marcador de peso molecular Ladder 1Kb, carril 1: pKD3,carril 2: pKD4, carril 3: pKD46.

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22 424 425 426 427 428 429 430 431 432 433 434 435 436 437 438 439 440 441 MW 1 33 2 3

Figura 2: 1: anlisis de extraccin de plsmidos para mtodode Wanner y Datsenko. Electroforesis en gel de agarosa 0.8% : MW: marcador de peso molecular Ladder 1Kb, carril 1: pCP20, carril 2: pCE36, carril 3: pCE37.
MW 1

Figura 3: anlisis de amplificacin del casette de resistencia del plsmido pKD3. Electroforesis en gel de agarosa 0,8%. MW: marcador de peso molecular 1 Kb Ladder (MW), carril 1: amplicn gen cat (CAT)

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23 442 Control 443 444 445 446 447 448 449 450 451 452 453 454 455 456 457 458 459 Producto PCR Transformante

pKD46

Figura 4: seleccin de transformantes pKD46 y producto de PCR en placas LB con ampicilina y cloranfenicol respectivamente. (a) Control (b) transformantes pKD46, (c) transformante (luxS::cat), (d) control.
MW 1 2 3

Figura 5: confirmacin genotpica del intercambio allico. MW: DNA 100 pb Ladder (MW), carril 1: Wild Type, carril 2: LuxS::cat , carril 3: control negativo.

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24 460 461 462 463 464 465 466 467 468 469 470 471 472 473 474

Tabla 2: ensayo de motilidad.

Figura 5: ensayo biopelcula. Medicin de absorbancia a 595 nm para biopelcula de cepa Wild
Type (WT), la cepa LuxS::cat (mutante). P value = 0,394037689 (p<0.05)

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475 476 477 478 479 480 481 482 483 484 485 486 487 488 489 490

Figura 6: seleccin de transformantes pCP20. Siembra en placas LB con ampicilina; (a) transformante, (b) control negativo.

Figura 7: prdida del plsmido pCP20 y del cassette de resistencia aph. (a) transformante pCP20, LB + Amp / 37C (b) transformante pCP20, LB + Amp / 30C, (c) transformante pCP20, LB + Kan / 30C.

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26 491 492 493 494 495 496

Tabla 3: condiciones y resultados obtenidos para ensayo -Galactosidasa cuantitativo.