Universidad de Concepcin Ingeniera en Biotecnologa Marina y Acuicultura Facultad de Ciencias Naturales y Oceanogrficas

Laboratorio Prctico N 3 Aislamiento y purificacin de fragmentos de ADN desde geles de agarosa

Nombre: Alonso Daz Alarcn Profesor: Dr. Fernando Cruzat Instructor: Cristin Muoz y Daniela Pereira

Ayudante: Hctor Castillo Fecha: 25 de Septiembre 2013

Introduccin. Muchos mtodos se han desarrollado en lo ltimos aos para recuperar ADN desde agarosa y geles de poliacrilamida. A pesar de la gran cantidad de mtodos, ninguno de ellos ha demostrado ser satisfactoria en todos los mbitos. Los problemas asociados con la recuperacin eficiente de ADN a partir de geles de agarosa incluyen: El ADN recuperado desde geles de agarosa es difcil para ligar, digerir o irradiar, recuperacin ineficiente de fragmentos grandes de ADN, Recuperacin ineficiente de pequeos fragmentos de ADN, Inhabilidad para recuperar un nmero diferente de fragmentos simultneamente (Michael A. et al 1990). Los diferentes tipos de protocolos para purificar ADN pueden ser usador para: Secuenciar ADN mediante fluorescencia, clonamiento, digestin mediante enzimas de restriccin o transcripcin en vitro, para su posterior manipulacin. Algunos protocolos son: la recuperacin sobre un papel de DEAE-celulosa, basndose sobre la unin del ADN a las membranas por interacciones electroestticas, entre las cargas negativas del ADN y las cargas positivas de la membrana; la electroelucin, la cual consiste en cortar el fragmento con el ADN (gel) para luego introducirla en una bolsa de dilisis con un buffer, sta bolsa se somete a un campo elctrico para sacar el ADN de la agarosa y purificarlo mediante extracciones orgnicas y concentrarlos por precipitacin etanlica; otro procedimiento es hacer electroforesis empleando agarosa de bajo punto de fusin y cortar el fragmento que contiene el ADN de inters, fundirlo y purificarlo mediante extracciones orgnicas ( Sambrook y Russel 2001). Para la realizacin del practico se utiliza el kit de purificacin Wizard SV gel and PCR clean-up system de promega, el cual inspira su funcionamiento al arte del ADN a unirse las membranas de slica en la presencia de sales caotrficas. Las bandas de inters para aislar el ADN son disueltas por la guanidina isotiocinato. El mtodo usado para la realizacin de este informe para aislar ADN desde agarosa disuelta es la centrifugacin, en comparacin con otros mtodos en donde el mismo kit se puede agregar a una alcuota de PCR para aislar directamente el ADN. En la centrifugacin el ADN se asla de los otros componentes debido a que este se une a la superficie de slice que tiene la minicolumna. Objetivos. Conocer y aplicar Fundamentos tericos para la purificacin de un segmento de ADN desde un gel de agarosa. Determinacin de pureza y concentracin del producto purificado mediante espectrofotometra.

Materiales y mtodos. Purificacin de fragmento de ADN desde gel de agarosa. Primero se realiz un electroforesis en gel de agarosa del gen de la superoxido dismutasa clonada y aislada desde un plsmido, para despus realizar las estimaciones necesarias para obtener el volumen de ADN que se obtuvo. La estimacin se hizo de la siguiente relacin: 0.1 gr son 100 L. El peso del fragmento de ADN se obtuvo por la diferencia entre el tubo eppendorff antes y despus de contener corte de gel. Los clculos se demuestran a continuacin. Tubo (N3) con gel Tubo (N3) sin gel Peso del gel con el fragmento de ADN 1,0447 gr 0,951 gr 0,0937 gr

Ahora con la relacin 0.1 gr son 100 L calculamos el volumen de ADN que se obtuvo. 0.1 gr de ADN 0.0937 X: 94 L Disolucin del gel de agarosa. Para la disolucin del gel de agarosa, a ste se le agreg 10 L de membrane bindig solution, la solucin fue agitada en vortex por 1 minuto y se incubo la mezcla a 50C por 15 minutos, hasta que la agarosa fue fundida. La Unin del ADN. La mezcla de agarosa fundida y Membrane binding solution fue transferida a una mini columna SV en tubo de coleccin, sta se incub por 1 minuto a temperatura ambiente, terminado lo anterior, la mini columna junto al tubo de coleccin se centrifugo a 12000 rpm por 1 minuto, descartando el lquido (del tubo de coleccin), para despus agregar 300 L de binding buffer y centrifugar a 12000 rpm por 1 minuto (descartando el lquido en el tubo colector). 100 L x L

Lavado de la muestra. A la columna se le adicionaron 700 L de Solucin SPW wash buffer con etanol, la muestra se centrifug a 1200 rpm por un minuto (descartando el lquido en el tubo de coleccin). El paso anterior se repiti agregando 500 L de solucin de lavado y centrifugndola a 12000 rpm por 5 minutos (descartando el lquido en el tubo colector). Para terminar la minicolumna se sec centrifugndola junto al tubo de coleccin a 12000 rpm por 1 minuto, con la tapa abierta para la evaporacin del etanol.

Elusin de la muestra. La minicolumna se transfiri a un nuevo tubo eppendorff de 1 ,5 mL, al cual se le adicionaron 25 L de elution buffer. La solucin anterior se incub por 1 minuto a temperatura ambiente centrifugandola a 12000 rpm por 1 minuto.

Cuantificacin del fragmento purificado. Se tom 1 L de la solucin eluida para determinar la absorbancia a 260 nm y 280 nm, teniendo como blanco el elution buffer, para determinar las concentraciones y pureza de la muestra original, Eficiencia de recuperacin del ADN. Para estimar la eficiencia de recuperacin en el aislado del ADN, Se compar la cuantificacin mediante espectrofotometra y la cantidad cargada inicialmente en la electroforesis, cantidad que asciende 1000 ng.

Resultados.

Cuantificacin del fragmento purificado. Concentracin ADN Relacin 260/280 Relacin 260/230 16,4 ng/ L 2,02 0,1

Eficiencia de recuperacin del ADN. Para estimar la eficiencia, cabe destacar que los 16,4 ng/ L estn estimado en 1 L de solucin, para la cantidad de 25 L de Elution buffer, queda as: 16,4 ng/ L X ng/ L 1 L 25 L

X: 410 ng/ L Entonces: 1000 ng 410 ng 100% X%

X: 41 % de eficiencia de recuperacin.

Discusin. El xito de las purificaciones de ADN se cuantifica mediante las relaciones 260/280 y 260/230, las cuales deben ser cercanas a 2 (Erlich 1989).La concentracin arrojada por la espectrofotometra asciende 16,4 ng/L, con una buena relacin 260/280: 2.02, el resultado anterior no se condice con la relacin 260/230: 0.1 la cual resulto muy baja, esto se explica debido a la presencia de etanol, el cual es el nico compuesto orgnico ocupado en el en la seccin de lavado de la muestra del protocolo, adems de la contaminacin de guanidina isotiocinato que est presente en el kit de purificacin. La contaminacin de guanidina isotiocinato fue muy determinante en los resultados obtenidos, lo anterior tambin se ve reflejado en el porcentaje de recuperacin de ADN, el cual asciende a un 41%, porcentaje muy bajo, ya que el estndar de recuperacin de ADN oscila cercano al 70%. Los resultados de Concentracin de ADN, las relacin 260/280, 260/230 y Porcentaje de recuperacin, dependieron mucho de la ineficacia de la parte del protocolo llamado lavado de la muestra, ya que en esta etapa el etanol precipita el ADN restante sin decantar por la accin de la centrifugacin, adems de supuestos errores en la ejecucin del protocolo.

Conclusiones. Existe una gran variedad de Kit en el mercado que permiten extraer ADN a partir de geles, las cuales los mismos fabricantes han estandarizado de manera prolija cada uno de los diversos pasos a seguir para una buena purificacin, actualmente los fabricante prometen en sus productos una eficiencia cercana al 90 %, pero el gran cuello de botella se produce en los laboratorio de consumo, en donde la expertis y la experiencia de las personas que estn a cargo de ejecutar el protocolo son vitales para una buena purificacin. Las relaciones 280/260 y 260/230 son una herramienta muy importante a la hora de evaluar el xito de una ejecucin del protocolo, ya que son una prueba fehaciente de cuan bueno es la extraccin, y sirven para tomar medidas de mitigacin para la ejecucin del protocolo.

Bibliografia Erlich, H. A. PCR technology. Principles and applications for DNA amplification. Macmillan Publishers, 1989.246 pp. Michael A. Innis,David H. Gelfand,John J. Sninsky,Thomas J. Whit. PCR protocols. A guide to methods and applications. Academic press 1990. 482pp. Sambrook J,Russel D.W. Molecular cloning. A laboratory manual. 3 edicion. Cold spring harbor laboratory press. Volumen 1.