1. 2. 3.

4. 5. 6.

7.

8. 9. 10. 11. 12. 13.

14.

4.2.4 Determinacin del corredor de error Determinacin Se preparan de 7 a 10 soluciones independientes, a tres niveles de concentracin (baja, intermedia y alta). Se construye el corredor de error a un nivel de confianza adecuado 95%, graficando la concentracin versus la seal obtenida. Utilizando para ello un programa estadstico apropiado. 4.2.5 Mtodo de comparacin Seal / Ruido Determinacin En el caso de procedimientos analticos instrumentales que estn sujetos a ruido de fondo, los documentos de la International Conference Harmonization describen una aproximacin comn que consiste en comparar las seales de muestras con concentraciones bajas (conocidas) del analito, contra las seales del blanco. Se preparan muestras de concentracin baja conocida a diferentes niveles de concentracin, de acuerdo con el mtodo en estudio. Se prepara un blanco, y se miden las seales de las soluciones preparadas. El Lmite de deteccin corresponde a la concentracin mnima a la cual el analito es detectado con una relacin seal ruido de 2:1 o 3:1 5 Lmite de cuantificacin 5.1 Mtodos no instrumentales 5.1.1 Con muestras preparadas Determinacin Se preparan varias muestras de concentraciones conocidas del analito en anlisis. Se analiza cada una de las muestras preparadas por el mtodo en estudio. El lmite de cuantificacin es la mnima concentracin cuantificable con una precisin y exactitud aceptable. (ver tabla 1)

-La desviacin ms grande (positiva o negativa) de la respuesta media Se calcula el lmite de cuantificacin, utilizando la siguiente frmula: LC = 10 x Desviacin mnima x la pendiente de la curva de calibracin. Donde la pendiente de la curva de calibracin se obtiene del estudio de linealidad del mtodo. 5.2.4 Mtodo de la inyeccin doble de la muestra de analito Determinacin Se preparan muestras del analito a bajas concentraciones. Se llevan a cabo dos corridas para cada una de las soluciones. Se calcula el Lmite de cuantificacin como la concentracin ms baja del analito a la cual la desviacin estndar relativa de las dos mediciones es 2% 6 Especificidad La especificidad puede verificarse de diferentes maneras, dependiendo del tipo de anlisis a realizar. Es importante tomar en cuenta, que en aquellos casos en que la matriz de la muestra es variable, tanto en trminos de su composicin (productos

12 biolgicos o de origen natural), as como en la fuente de las materias primas que las componen (diferentes proveedores, diferentes orgenes), se recomienda que la especificidad se establezca para las diferentes composiciones o fuentes en forma independiente. 6.1 Anlisis Tipo I: Potencia, disolucin y uniformidad de contenido. Se puede demostrar de diferentes maneras: 6.1.1 Comparacin del comportamiento de la matriz o impurezas con respecto al comportamiento del estndar. Verificacin

5.2 Mtodos instrumentales 5.2.1 Con muestras preparadasSe procede de la misma manera que en el caso de los mtodos no instrumentales.5.2.2 Mtodo de comparacin de Seal / RuidoDeterminacin:preparan muestras de concentracin conocida a bajos niveles, de acuerdo al mtodo en estudio. Se prepara un blanco, y se mide la seal de las soluciones preparadas.11 El lmite de cuantificacin es la concentracin de analito en la que se pueden dar cualquiera de las siguientes situaciones: - Relacin seal / ruido es 10:1. -Relacin seal / ruido es al menos 10 y la precisin de menos de 10% (Desviacin estndar relativa) -Relacin seal / ruido es mayor de 20 y la precisin menor de 5% (Desviacin estndar relativa) 5.2.3 Mtodo de respuesta de lnea base (cromatografa lquida o gaseosa) Determinacin Se debe preparar una solucin de blanco y se corre el cromatograma por un tiempo igual a 20 veces el ancho del pico obtenido para el analito. Se obtiene la medida de ruido como: -La ms grande fluctuacin pico a pico

Se prepara una solucin estndar del analito a la concentracin esperada en el procedimiento de ensayo, y una solucin de matriz a la misma concentracin relativa. Se lleva a cabo una comparacin de las mediciones de ambas soluciones. Criterio de aceptacin La matriz no debe presentar ningn tipo de seal que interfiera con la seal que se encuentra para el estndar. 6.1.2 Comparacin del comportamiento de muestra con respecto al comportamiento del estndar.

Verificacin Se prepara una solucin estndar del analito a la concentracin esperada en el procedimiento de ensayo y una solucin de muestra a la misma concentracin. Se lleva a cabo una comparacin de las mediciones de ambas soluciones. Criterio de aceptacin La muestra no debe presentar ningn tipo de seal que interfiera con la seal que se encuentra para el estndar6.1.3 Comparacin del comportamiento de muestra enriquecida con matriz con respecto al comportamiento de estndar enriquecido con matriz. Verificacin Se prepara una solucin estndar del analito a la concentracin esperada en el procedimiento de ensayo, y una solucin de muestra a la misma concentracin. Ambas soluciones son enriquecidas con una cantidad equivalente de matriz. Se lleva a cabo una comparacin de las mediciones de ambas soluciones enriquecidas. Criterio de aceptacin El criterio de aceptacin es que el comportamiento de las muestras enriquecidas y del patrn enriquecido, debe ser los ms cercano posible, en aquel punto en que se lleva a cabo la medicin del analito. Lo cual es indicativo de que la matriz, no aporta ningn tipo de seal que interfiera con la medicin. 6.1.4 Comparacin del comportamiento de muestras enriquecidas con analito con respecto al comportamiento de estndar enriquecido con analito. Verificacin Se prepara una solucin estndar del analito a la concentracin esperada en el procedimiento de ensayo, y una solucin de muestra a la misma concentracin. Ambas soluciones son enriquecidas con una cantidad equivalente de analito. Se lleva a cabo una comparacin de las mediciones de ambas soluciones enriquecidas. Criterio de aceptacin El criterio de aceptacin es que el comportamiento de las muestras enriquecidas y del patrn enriquecido, debe ser los ms cercano posible, en aquel punto en que se lleva a cabo la medicin del analito. Lo cual es indicativo de que la matriz, no aporta ningn tipo de seal que interfiera con la medicin Algunos autores recomiendan enriquecer tanto las muestras como el patrn con cinco niveles de concentracin del analito, y llevar a cabo la comparacin del comportamiento de las soluciones a los diferentes niveles. Esto permitira determinar el grado de interferencia, dependiendo de la concentracin del analito a determinar. Estos datos pueden obtenerse del estudio de linealidad del mtodo utilizando la adicin estndar. 6.1.5 Procedimientos adicionales para verificar la especificidad, pueden ser:

1. Ensayo de la pureza de pico, cuando se cuenta con un detector de arreglo de diodos o con espectrometra de masas. 2. Reanlisis del pico, cuando el analito de inters es recogido y reanalizado bajo diferentes condiciones cromatogrficas o con mtodos sensitivos a la estructura del analito 3. Comparacin de resultados obtenidos cuando la muestra puede ser analizada por dos o ms mtodos de separacin o de deteccin. 6.2 Anlisis Tipo II: Pruebas cuantitativas para la determinacin del contenido de impurezas o de valores lmites para el control de impurezas 6.2.1 Adicin estndar de impurezas a la muestra: Verificacin Este mtodo se utiliza, si se encuentran disponibles en el mercado los patrones correspondientes a las impurezas. Se agrega a la muestra, diferentes concentraciones de impurezas, a la concentracin normal de trabajo Criterio de aceptacin Se debe demostrar que el contenido de impurezas determinado en el ensayo tienen una exactitud y precisin apropiadas para el mtodo al lmite de cuantificacin. 6.2.2 Comparacin de mtodos Verificacin En los casos en que los patrones de impurezas no estn disponibles, la especificidad puede ser demostrada por comparacin de los resultados del ensayo con el mtodo propuesto, con resultados obtenidos por un segundo mtodo bien caracterizado u oficial. La comparacin debe incluir muestras almacenadas bajo condiciones extremas relevantes ( luz, calor, humedad, hidrlisis cida o bsica, oxidacin ). Estas condiciones deben ser escogidas de acuerdo a la estructura qumica del analito, que determinar la susceptibilidad del mismo a la descomposicin. Criterio de aceptacin En el caso de la determinacin cuantitativa de impurezas, se deben comparar los resultados obtenidos por ambos mtodos. En el caso de pruebas de impurezas cromatogrficas, se deben comparar los perfiles de impurezas. 6.3 Anlisis tipo IV: Pruebas de identificacin Verificacin Deben prepararse:

15. Muestras que contengan el analito a identificar 16. Muestras que no contengan el analito (matriz) 17. Muestras sin analito pero contaminadas con una sustancia de estructura similar 18. Solucin de patrn de la sustancia a identificar, preparado a una concentracin equivalente a las anteriores. Las tres primeras soluciones se comparan con la cuarta solucin. Criterio de aceptacin Deben obtenerse los siguientes resultados para cada solucin 1. La solucin 1 Identificacin positiva 2. La solucin 2 Identificacin negativa 3. La solucin 3 Identificacin negativa.