CARRERA DE ODONTOLOGIA

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS MICROBIOLOGIA

Prof. Marcela Seplveda Araneda 2008

CONSIDERACIONES GENERALES DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO. Es muy importante para su seguridad y la de sus compaeros observar siempre las siguientes medidas mnimas de seguridad. Es obligatorio concurrir al laboratorio con delantal blanco, lpiz demogrfico o plumn de tinta permanente. Todo el material que use en el laboratorio debe considerarse como CONTAMINADO y, por lo tanto, debe manejarse con cuidado, procurando no dejarlos en los mesones sino eliminarlos slo en los recipientes dispuestos para ello. En la eventualidad de cualquier accidente, por pequeo que parezca, debe comunicarse inmediatamente al profesor a cargo de la actividad. Respete siempre las indicaciones que se darn durante las primeras actividades prcticas respecto al uso del mechero, asas, tubos u otros materiales. Est estrictamente prohibido ingerir cualquier tipo de alimento o bebida en el laboratorio. Jams debe sacar material contaminado o cultivos bacterianos fuera del laboratorio.

No haga bromas, ni permita que sus compaeros las hagan, con cultivos bacterianos o material contaminado. Antes de abandonar el laboratorio lave cuidadosamente sus manos.

Recuerde!! El principal responsable de su seguridad es usted

INTRODUCCIN AL TRABAJO DE LABORATORIO OBJETIVO Identificar los diferentes instrumentos y materiales de uso comn en el laboratorio de Microbiologa

Principales herramientas de trabajo microbiolgico a) Mechero: El mechero es el principal elemento que nos ayuda a trabajar en forma estril, este sirve para esterilizar el asa microbiolgica, la boca de tubos de ensayo, pipetas, portaobjetos, etc. y para mantener un ambiente de trabajo estril. b) Placas de Petri: Placas de vidrio o de plstico en las cuales se deposita una determinada cantidad de medio de cultivo slido (altura de 4 mm). Consta de una base y una tapa, debe mantenerse cerrada, excepto en los breves momentos en que debe sembrarse el medio de cultivo. c) Asas: Instrumento con un mango y un alambre (nicrom) en la punta. Existen dos tipos: asa recta (que termina en punta), y asa en anillo (un pequeo crculo en el extremo). Sirven para sembrar muestras bacterianas en superficie y en profundidad (asa recta) y para sembrar en superficie y trasladar pequeas gotas (asa en anillo). d) Pipetas Pasteur: Es un tubo angosto que termina en punta, puede ser de vidrio o de plstico, estriles o no. Sirve para trasladar material lquido (gotas) o bien para diseminar siembras acodando un extremo o formando un rastrillo. Debe romperse la punta y esterilizarse antes de ser utilizada. e) Pipetas Graduadas: Son las pipetas corrientes utilizadas en qumica, pero que para el uso microbiolgico deben esterilizarse en horno Pasteur envueltas en papel. Al desenvolverse deben flamearse al mechero. f) Tubos de ensayo: En microbiologa los tubos de ensayo deben esterilizarse en horno Pasteur y taponarlos con algodn hidrfobo o con tapas especiales de goma o plstico. Debe flamearse la boca del tubo cada vez que se saque la tapa y antes de volver a colocrsela. g) Matraces: Son los matraces corrientes que se deben taponar con algodn hidrfobo o tapn especial y esterilizados al horno Pasteur. Debe flamearse la boca despus de sacar la tapa y antes de volver a ponerla.

h) Microscopio: En microbiologa se emplea el objetivo 40 X para observaciones sin tincin (al fresco) y el objetivo 100 X para observaciones por inmersin (con aceite) en preparaciones teidas. El microscopio debe quedar perfectamente limpio despus de finalizada la observacin correspondiente. i) Estufa de Cultivo: Los productos biolgicos o siembras de bacterias en medios de cultivo deben cultivarse en estufas que se encuentran generalmente a una temperatura de 35 - 37C. j) Bao Mara: Consiste en un recipiente con agua de la llave que tiene una fuente de calor para mantener una determinada temperatura. Generalmente se hace hervir el agua, por ejemplo, para fundir el agar en los tubos con medio de cultivo slido. k) Horno Poupinel o Pasteur: Es un aparato que sirve para esterilizar todo el material de vidrio que se utiliza en microbiologa. La esterilizacin se realiza a 180C por una hora Es una esterilizacin en seco. l) Autoclave: Es un aparato que sirve para esterilizar medios de cultivo (agares, caldos, etc.) y tambin para esterilizar material contaminado (placas de Petri con cultivos positivos, caldos con crecimiento, muestras patolgicas, etc.). La esterilizacin se realiza a 120C por 15 min y es una esterilizacin hmeda.

Material de Laboratorio en Microbiologa

1. can 2. base 3. anillo que regula entrada de aire (virola) 4. entrada de gas (chicl) 5. tubo de gas 6. llave de paso

Mechero Bunsen

Medios de cultivo

Autoclave

Horno Pasteur (Poupinel)

Cmara de anaerobiosis (Gas pack)

Microscopio ptico Sistema ptico Ocular: Lente situada cerca del ojo del observador. Ampla la imagen del objetivo Objetivo: Lente situada cerca de la preparacin. Ampla la imagen de sta Condensador: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin Diafragma: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador Foco: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador Sistema mecnico Soporte: Mantiene la parte ptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo Platina: Lugar donde se deposita la preparacin Cabezal: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular Revlver: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos Tornillos de enfoque: Macromtrico que aproxima el enfoque y micromtrico que consigue el enfoque correcto MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO PTICO 1. Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se guard correctamente en el uso anterior, ya debera estar en esas condiciones 2. Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas

3. Comenzar la observacin con el objetivo de 4x (ya est en posicin) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparacin es de bacterias 4. Realizar el enfoque de acuerdo a los siguientes pasos: - Acercar el lente del objetivo a la preparacin, empleando el tornillo macromtrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a travs del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin pudindose daar alguno de ellos o ambos - Separar lentamente el objetivo de la preparacin con el macromtrico y, cuando se observe algo ntida la muestra, girar el micromtrico hasta obtener un enfoque fino - Pasar al siguiente objetivo. La imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente mover el micromtrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdi por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operacin desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparacin y por ello es fcil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparacin si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersin si se observa una preparacin que ya se enfoc con el objetivo de inmersin 1. Observacin con objetivo de inmersin - Bajar totalmente la platina - Subir totalmente el condensador para ver claramente el crculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habr que echar el aceite - Girar el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio camino entre ste y el de 40x - Colocar una gota de aceite de inmersin sobre el crculo de luz - Terminar de girar el revlver hasta la posicin del objetivo de inmersin - Mirando el objetivo, subir la platina lentamente hasta que el lente toque la gota de aceite - Enfocar cuidadosamente con el micromtrico - Una vez finalizada la observacin de la preparacin se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revlver. En este momento ya se puede retirar la preparacin de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersin en posicin de observacin - Limpiar el objetivo de inmersin con cuidado empleando un papel especial para ptica. Comprobar tambin que el objetivo 40x este perfectamente limpio

ACTIVIDAD PRACTICA N 1 CARACTERIZACIN MACROSCOPICA DE BACTERIAS COLONIAS BACTERIANAS Objetivos Distinguir caractersticas de colonias bacterianas en placas de cultivo

CONCEPTOS BSICOS INVOLUCRADOS EN ESTA CLASE PRCTICA Observacin macroscpica de bacterias. Colonias bacterianas Esta observacin se realiza analizando el crecimiento bacteriano en una placa de cultivo posterior a un perodo de incubacin. El examen visual consiste en distinguir: - tamao aproximado de la colonia (muy pequea, puntiformes, pequeas, medianas, grandes, etc.), - color de las colonias (blancas, amarillas, grises, doradas, etc.) - superficie de las colonias (hmeda, seca, viscosa, etc.) - invasividad de las colonias sobre la placa (velo fino de desarrollo en la superficie) - otras caractersticas, como por ejemplo, hemlisis si el medio contiene sangre. La hemolisina se observa mirando el medio de cultivo al trasluz.

Figura. Caractersticas macroscpicas de colonias bacterianas

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Crecimiento colonia mucosa/viscosa (capsulada)

Crecimiento de bacteria hemoltica

Crecimiento colonia invasiva

Crecimiento colonias hmedas (brillantes)

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Colonias secas

Colonias coloreadas

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Crecimiento en medio lquido

a
a) b) c) d)

formando pelcula en superficie formando sedimento en profundidad turbidez completa sin crecimiento

TRABAJO PRACTICO Observacin macroscpica En el laboratorio encontrar placas de Petri que contienen cultivos de diversas bacterias. Observe caractersticas morfolgicas de las colonias (aspecto, tamao, color, etc.) de acuerdo a las instrucciones de la profesora. Conteste las siguientes preguntas: Puede Ud. distinguir distintos tipos de colonias en el cultivo?. Justifique Not Ud. alguna modificacin caracterstica del medio de cultivo? Observe cada caso y anote los resultados en su cuaderno

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ACTIVIDAD PRACTICA N 2 MORFOLOGIA Y AGRUPACIN BACTERIANA Objetivos Distinguir las diferentes morfologas y agrupaciones de las clulas bacterianas Manejar adecuadamente la observacin microscpica de bacterias

CONCEPTOS BSICOS INVOLUCRADOS EN ESTA CLASE PRCTICA Observacin microscpica de bacterias y tinciones La observacin microscpica de bacterias permite conocer algunas caractersticas de ellas como forma, agrupacin, presencia o ausencia de cpsula, esporas, flagelos, movilidad, etc. Adems el estudio microscpico es la primera etapa del estudio de las bacterias y el diagnstico bacteriolgico. A. Observacin de bacterias vivas - Al fresco: permite observar a la bacteria en estado vivo. En este caso se coloca una suspensin bacteriana efectuada en caldo, agua o suero fisiolgico estril en un portaobjetos. La observacin se realiza con aumento 10x 40x, sin inmersin, disminuyendo la iluminacin, bajando el condensador del microscopio. Su aplicacin ms importante se refiere al estudio de la movilidad. - En campo oscuro: Se emplea para la observacin de bacterias muy pequeas o de aquellas que difcilmente se observan con el microscopio corriente (ej. Treponema pallidum). Se utiliza un condensador especial que enva la luz de la lmpara de tal manera que no entra directamente a la preparacin. Los rayos luminosos son refractados por los microorganismos observndose como cuerpos brillantes sobre un fondo oscuro.

Treponema pallidum en campo oscuro

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B. Observacin de bacterias muertas Para este objetivo se utilizan tcnicas de coloracin, lo que implica la muerte de las bacterias y, por lo tanto, algunas alteraciones en su constitucin. Tinciones simples: estas tinciones se basan en el uso de un solo colorante sobre la clula bacteriana, todas ellas se observan de un mismo color. Este tipo de tincin sirve slo para observar la forma y agrupacin de las bacterias. Se debe preparar un frotis a partir de cultivos bacterianos en medios slidos o lquidos, para luego teirlos. La preparacin de cualquier frotis implica tres etapas fundamentales: - extensin - secado - fijacin Procedimiento 1. Limpiar un portaobjeto con alcohol y pasarlo rpidamente por la llama del mechero, dejar enfriar 2. Colocar una gota de agua, suero fisiolgico o caldo estril en el centro del portaobjeto. 3. Con el asa esterilizada en la llama tomar una asada del cultivo en placa, dispersar el material en la gota y extender suavemente en una superficie adecuada (1cm2), esterilizar el asa en la llama del mechero 4. Secar el frotis pasndolo suavemente por la llama del mechero, en la estufa de cultivo o a temperatura ambiente. Este procedimiento tiene como objeto "fijar" la preparacin (adherir las bacterias a la superficie del vidrio) y el frotis queda en condiciones de ser teido 5. Colocar la lmina en la vasija de tincin y verter sobre ella el colorante escogido dejndolo actuar por 1 2 minutos 6. Lavar el frotis con agua 7. Secar el portaobjeto colocndolo sobre papel absorbente en forma inclinada y luego pasarlo rpidamente por la llama del mechero para terminar con el secado 8. Observar al microscopio, con objetivo de inmersin

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Tinciones diferenciales: estas tinciones permiten agrupar a las bacterias de acuerdo a su afinidad por los diferentes colorantes que se utilizan. As, bacterias que quedan teidas de diferente color pertenecen a grupos tambin diferentes. Estas tinciones son de gran importancia, debido a que existe una correlacin entre la capacidad tintorial de la bacteria y algunas propiedades basadas en diferencias estructurales principalmente a nivel de la pared bacteriana nos permitirn un estudio ms profundo de ellas. Entre estas tinciones estn la tincin de Gram y la tincin de Ziehl - Neelsen. A. Tincin de Gram (Christian Gram 1884)

Esta tincin es probablemente la ms importante en bacteriologa, nos permite distinguir a las bacterias como Gram-positivas (color azul violeta) y Gram-negativas (color rojo). Se puede reconocer tambin un tercer grupo de bacterias que se denominan Gram variables que son positivas cuando jvenes, pero a medida que envejecen gradualmente se vuelven Gram negativos (los bacilos esporulados son un ejemplo de este grupo). Las bacterias son cubiertas por una solucin de cristal violeta (1 er colorante), luego se les agrega un mordiente (fijar colorante) que es una solucin de yodo (lugol). Luego la lmina se cubre con alcohol-acetona (decolorante) hasta arrastrar todo el colorante remanente y por ltimo se agrega safranina (colorante de contraste). La fase de decoloracin con alcohol constituye la etapa ms importante de la tincin de Gram, y en ella, reside su carcter diferencial. Procedimiento 1. A partir de un cultivo bacteriano (slido o lquido), se prepara un frotis y se procede a efectuar la tincin de Gram. 2. Cubrir el frotis con Cristal Violeta o Violeta de Genciana al 1% durante 1 minuto, cuidando que el colorante cubra toda la preparacin. 3. Eliminar el exceso de colorante y lavar rpidamente con agua manteniendo la lmina inclinada. 4. Cubrir la preparacin con la solucin de lugol, durante 1 minuto y lavar con agua. 5. Decolorar con alcohol - acetona durante 30 segundos y lavar con agua. 6. Cubrir la lmina con safranina por 30 segundos y lavar con agua. 7. Secar la lmina en forma inclinada sobre papel absorbente. 8. Observar al microscopio con objetivo de inmersin.

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Cocceas Gram positiva Streptococcus pyogenes

Bacilos Gram negativos Escherichia coli

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B. Tincin de Ziehl - Neelsen Esta tincin al igual que la de Gram emplea dos colorantes, la fucsina y el azul de metileno (o amarillo victoria), con una decoloracin intermedia basado en el uso de un colorante enrgico (alcohol cido). Esta tincin es empleada para las bacterias alcoholcido resistentes (Mycobacterium spp.). Estas bacterias poseen una membrana crea lo que hace que sea difcil de teir, por lo que se emplean colorantes fuertes y decolorantes cidos. Las bacterias alcohol-cido resistentes son aquellas que no pierden la coloracin inicial con fucsina por accin del alcohol - cido y se teirn de color rojo, el resto de la preparacin se observar de color azul. Procedimiento 1. Realizar un frotis con el material que contiene bacterias: - Expectoracin - Orina La muestra de expectoracin se extiende sobre un portaobjetos con un aplicador y luego con otro portaobjeto se extiende la muestra hasta obtener una copa fina y homognea que cubra las 2 terceras partes del portaobjetos, luego se seca a la llama del mechero por 2 a 3 segundos. La muestra de orina se debe sedimentar, el sedimento se pone en un tubo de centrfuga y se centrifuga a 1.500 r.p.m. x 5 min. Se elimina el sobrenadante y a partir del sedimento (pellet) se realiza el frotis extendiendo la muestra en el portaobjeto. Este frotis se debe fijar en la estufa. Esta misma operacin se realiza con otros lquidos como L.C.R., lquido pleural, etc. 2. Cubrir la lmina con fucsina fenicada (previamente filtrada) y calentar hasta que emita vapores blanquecinos visibles. Repetir este proceso dos veces y evitar que el colorante se seque sobre la lmina. El calentamiento se puede realizar con un hisopo impregnado en alcohol. Cuando aparecen vapores se ha logrado el calentamiento aproximado de 90C con lo que se obtiene una cubierta crea ms blanda que se deja impregnar por el colorante. 3. Eliminar la fucsina inclinando el portaobjetos hacia adelante, lavar el frotis con un chorro de agua suave sobre la parte del portaobjetos que no contiene extendido y dejar escurrir el agua sobre la pelcula coloreada de modo que sta no se desprenda. 4. Cubrir la totalidad de la lmina con alcohol - cido de manera que vaya decolorando y arrastrando suavemente la fucsina hasta que las partes ms gruesas del extendido conserven slo un ligero tinte rosado. Eliminar el alcohol - cido y lavar con agua. 5. Cubrir la lmina con azul de metileno durante 30 segundos (azul suave). 6. Eliminar el azul de metileno y lavar con agua a baja presin por ambos lados. 7. Secar a temperatura ambiente. 8. Observar al microscopio. Nota. La etapa de tincin con fucsina se puede realizar sin emitir vapores, dejando actuar el colorante por 10 minutos.

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Tinciones especiales: estas tinciones, cuyas tcnicas son ms complejas que las tinciones anteriores, tienen por objeto destacar algunas de las partes que constituyen a la bacteria, por ejemplo tinciones de flagelos, cpsulas, esporas, etc. En general no son de uso rutinario y encuentran su aplicacin en trabajos de investigacin bacteriolgica

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TINCIN DE FLAGELOS

TINCIN DE CPSULA

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TINCIN DE CPSULA

TINCIN DE ESPORAS

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C. Otros tipos de observacin microscpicas de bacterias Microscopa electrnica: Procedimientos que permiten observar la clula bacteriana con extraordinario aumento. Ejemplo, microscopa de transmisin, microscopa de barrido. Epifluorescencia: En este caso se tien las bacterias con un colorante epifluorescente (ejemplo, naranja de acridina) y se observa bajo luz ultravioleta. Las bacterias se observan con fluorescencia naranja o verde intensa, dependiendo del estado metablico en que se encuentran las bacterias. Inmunofluorescencia: En este caso, la preparacin de bacterias se trata con anticuerpos marcados con un colorante fluorescente y especficos para ellas. Bajo la luz ultravioleta las bacterias se observan de color verde intenso. Esta tincin, a diferencia de la epifluorescencia, no slo permite visualizar las bacterias, sino que tambin las identifica porque la tincin es positiva solamente cuando la bacteria ha reaccionado especficamente con su anticuerpo especfico.

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TAMAO CELULAR Las bacterias son organismos unicelulares, cuyo tamao vara de acuerdo a la especie y las condiciones de cultivo. Aquellas bacterias que se relacionan con el ser humano tienen un tamao que vara entre 0,5 y 5 m. Dos ejemplos: a) las clulas individuales de Staphylococcus y de Streptococcus, bacterias comnmente asociadas a cuadros infecciosos de tipo pigeno, tienen forma esfrica con dimetro que vara entre 0,75 y 1,25 m. b) Escherichia coli, bacteria considerada como habitante normal del intestino humano y animal, tiene la forma de cilindro con un dimetro de 0,5-1,0 m y un largo de 2-3 m.

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MORFOLOGIA CELULAR Debido a su pequeo tamao las bacterias se visualizan por observacin en un microscopio de tipo ptico, especialmente en preparaciones de cultivos teidos con diferentes colorantes. Las bacterias se pueden agrupar en cuatro grandes grupos de acuerdo a su forma: i) cocceas son clulas bacterianas de forma esfrica o aproximadamente esfricas, pudiendo ser tambin ovaladas ii) bacilares de morfologa mucho ms variable, se trata de clulas en las cuales uno de sus ejes es mucho mayor que el otro, adoptando por consiguiente la apariencia de un bastn o cilindro iii) espiraladas se trata de clulas muy largas y que, adems, presentan una torsin alrededor de un eje central (espira) iv) curvas (retorcidas pero que no alcanzan una torcin completa)

Bacterias cocceas

Bacterias bacilares

Bacterias espirales

Bacterias espiroquetas

Bacterias de formas no tradicionales

Bacterias filamentosas

24 Bacterias filamentosas

AGRUPACION DE LAS CELULAS BACTERIANAS Adems de la forma de la clula bacteriana, es importante el tipo de agrupacin que presentan. En este sentido se pueden distinguir las siguientes agrupaciones: Pares: las clulas se presentan, mayoritariamente, en parejas. Si la forma bacteriana es coccea se habla de diplococos (Ej. Neisseria spp.), si la forma de la clula es bacilar se habla de diplobacilos. Cadenas: las clulas se ubican en lnea formando cadenas de longitud variable. Esta agrupacin se presenta porque la divisin celular se produce en un solo plano y las clulas no se separan despus de la divisin. La agrupacin en cadena es caracterstica del gnero Streptococcus (forma coccea) pero la presentan tambin algunas bacterias bacilares como Bacillus y Lactobacillus. Racimos: en este caso la divisin celular se produce en tres planos dando origen a masas de clulas que en la observacin microscpica semejan racimos. Esta agrupacin es caracterstica del gnero Staphylococcus. Cubos: se producen cuando la divisin celular se realiza en tres planos dando origen a masas de clulas que semejan un cubo. Esta agrupacin es caracterstica del gnero Sarcina (coccea). Empalizada: agrupacin que se encuentra slo en bacterias en forma de bacilo. Las clulas se disponen una al lado de la otra dando la impresin de una empalizada. Ej. Corynebacterium. Letra china: tambin se presenta slo en bacilos. Las clulas se disponen formando diferentes ngulos que dan la idea de letras chinas Ej. Corynebacterium. La agrupacin de las clulas de cada especie es una propiedad constante que, por esta razn, facilita su identificacin en el laboratorio.

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Figuras. Agrupacin de bacterias bacilares

Agrupacin: aislada

Agrupacin: en pares

Agrupacin: en cadenas o filamentos

Agrupacin: empalizada y letra china

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Figura. Agrupacin de bacterias cocceas

Agrupacin: aislada

Agrupacin: en pares

Agrupacin: en cadenas

Agrupacin: en ttradas

Agrupacin: sarcina

Agrupacin: racimo

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TRABAJO PRACTICO Observacin microscpica Se le proporcionarn diversos frotis de cultivos bacterianos teidos con tincin de Gram, efecte una observacin microscpica de cada uno de ellos. En el laboratorio tambin encontrar frotis teidos con diferentes estructuras bacterianas, observe al microscopio. Responda las siguientes preguntas: Puede Ud. reconocer diferentes formas y agrupaciones celulares? Existe relacin con lo observado a nivel macroscpico? Anote caractersticas particulares y dibuje en su cuaderno lo que observe. Observacin al fresco En el Laboratorio encontrar placas de cultivos con bacterias mviles e inmviles, debe estudiar cada uno de ellos anotando todas las caractersticas y observaciones en su cuaderno. Procedimiento 1. Colocar una gota de suero fisiolgico sobre un portaobjeto limpio y dispersar en ella una asada del cultivo a observar, cubra esta preparacin con el cubreobjetos y observe al microscopio. 2. Con un asa Pasteur sacar una gota de caldo de cultivo y ponerlo sobre un portaobjeto limpio, cubrir la preparacin con un cubreobjetos y observar al microscopio. Ambas preparaciones se deben observar al microscopio con aumento menor y luego con aumento mayor bajando el condensador para disminuir la intensidad de la luz y lograr un contraste que permite una buena visin.

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LABORATORIO N 3 AGENTES ANTIBACTERIANOS OBJETIVO Conocer el empleo de algunas metodologas que permitan evaluar la susceptibilidad o resistencia de los compuestos antibacterianos. CONCEPTOS BSICOS INVOLUCRADOS EN ESTA ACTIVIDAD PRCTICA Los agentes antibacterianos son compuestos qumicos, de origen natural y/o sinttico, de accin selectiva o relativamente selectiva sobre diversos microorganismos, que pueden actuar sobre ellos inhibiendo su crecimiento o bien provocando la muerte a muy bajas concentraciones. El conocimiento de las principales propiedades que tienen los antibacterianos es fundamental para los alumnos del rea de la salud. En los ltimos aos la gran actividad antibacteriana se ha visto opacada por la aparicin de cepas de elevada multirresistencia y por la aparicin de nuevas etiologas de enfermedades infecciosas por el desplazamiento de las especies o cepas ms susceptibles. Una manera de disminuir la intensidad de los fenmenos indeseables atribuibles al uso de los antibacterianos es su empleo adecuado. Para ello, el Laboratorio de Bacteriologa es indispensable. Propiedades generales de los agentes antibacterianos: A. Espectro de actividad antibacteriana Cada agente antibacteriano puede actuar solamente sobre un determinado nmero de especies bacterianas, de tal manera que su utilidad clnica se dirige a las infecciones producidas por estos microorganismos. As, por ejemplo las bacterias Gram-negativas son ms difcilmente afectadas por estos compuestos debido a la complejidad de su estructura de envoltura lo que dificulta su penetracin intracelular. El conjunto de especies bacterianas que pueden ser inhibidas o muertas por un agente antibacteriano (susceptibles al antibacteriano) constituye su espectro de actividad antibacteriana. Generalmente se acepta que los antibacterianos que actan solamente sobre bacterias Gram-positivas, o bien solamente sobre Gram-negativas poseen reducido espectro de actividad antibacteriana. En cambio, aquellos que pueden actuar sobre especies de ambos grupos de microorganismos poseen amplio espectro de actividad antibacteriana. Es importante comprender que esta clasificacin de espectro antibacteriano expresa una tendencia de este compuesto para actuar preferentemente sobre uno o los dos grupos bacterianos definidos por la tincin de Gram. B. Tipo de actividad antibacteriana Los antibacterianos pueden inhibir el desarrollo de la poblacin bacteriana (actividad bacteriosttica) o matar la poblacin bacteriana (actividad bactericida). En el laboratorio se expresa la actividad inhibitoria de estos compuestos a travs de la concentracin mnima inhibitoria (CMI) y la actividad bactericida a travs de la concentracin mnima

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bactericida (CMB). La primera (CMI) se define como la concentracin ms baja de antibacteriano que es capaz de inhibir el crecimiento o desarrollo de la poblacin bacteriana y la segunda (CMB) como la menor concentracin que produce la muerte del cultivo. Ambas concentraciones se pueden determinar con relativa exactitud en el laboratorio y son frecuentemente utilizados para evaluar la actividad antibacteriana de los compuestos antibacterianos. Un antibacteriano tendr mayor potencia en la medida en que sus CMI y CMB sean ms bajas, es decir, que las concentraciones requeridas para inhibir o matar una cepa bacteriana sean bajas. Cuando un agente antibacteriano es administrado en el organismo como tratamiento de un proceso infeccioso, puede manifestar una actividad bacteriosttica o bien una bactericida sobre el agente etiolgico. En el primer caso se denominan compuestos bacteriostticos y si pueden matar microorganismos in vivo se denominan bactericidas. El efecto que produce el antimicrobiano in vivo es una consecuencia de la relacin entre la CMI, la CMB y la concentracin de antibacteriano que se alcanza en el lugar de la infeccin. La mayor posibilidad de obtener un efecto bactericida in vivo sobre una cepa bacteriana existe cuando la CMB del antibacteriano es muy baja, ya que es ms factible que el nivel orgnico sobrepase dicha concentracin. Resistencia de las bacterias a los agentes antibacterianos Este es uno de los fenmenos de mayor importancia que ocurre naturalmente y se expresa a causa del empleo de los agentes antimicrobianos. La resistencia o insusceptibilidad de una cepa bacteriana a un determinado agente antibacteriano puede ser: a) natural, porque esta propiedad es un atributo de la especie a la cual pertenece la cepa b) adquirida, si la especie est formada por cepas susceptibles que paulatinamente cambian su comportamiento frente al uso de un antibacteriano, apareciendo las resistentes. La diferencia entre una cepa susceptible y una resistente (ambas de la misma especie) frente a un agente antibacteriano se expresa por la CMI superior presentada por la cepa resistente. La aparicin de cepas resistentes en la naturaleza se realiza por dos procesos: a) Mutacin. Las mutantes resistentes se producen espontneamente con una frecuencia definida y caracterstica para cada agente antibacteriano. La presin selectiva (empleo clnico) del antibacteriano selecciona estas mutantes eliminando las susceptibles, lo que da origen a una cepa con menor susceptibilidad. Esta nueva cepa, sin embargo, presenta resistencia slo al antibacteriano involucrado en su seleccin, o a otro muy relacionado. b) Transferencia gentica de resistencia. Algunos genes extracromosomales que codifican resistencia estn ubicados en plsmidos, transposones y/o integrones y, por lo tanto, pueden transferirse desde bacterias resistentes a bacterias susceptibles, bajo ciertas condiciones. Estos elementos extracromosomales codifican resistencia para ms de un antibitico, por lo tanto, la adquisicin de esta resistencia puede conducir a multirresistencia.

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Determinacin de la susceptibilidad a los antibacterianos El fundamento de esta determinacin es establecer, en forma cuantitativa o relativamente cuantitativa, la mayor o menor actividad relativa de determinados antibiticos sobre las cepas bacterianas que se aslan de procesos infecciosos. De esta manera, el laboratorio de bacteriologa se encuentra en condiciones de informar los antibacterianos sin actividad o con actividad frente a las cepas estudiadas. Los mtodos ms utilizados para determinar la sensibilidad de una bacteria a agentes antimicrobianos son: - Difusin en agar (antibiograma) - Dilucin en caldo o agar Susceptibilidad determinada por difusin en agar (Mtodo de Kirby-Bauer) Este mtodo, ms conocido como antibiograma, se enfrenta una bacteria inoculada sobre la superficie de un cultivo slido a una solucin antibitica absorbida en papel filtro (sensidiscos). Est basado en el hecho de que existe una relacin entre la concentracin del antibacteriano necesaria para inhibir una cepa bacteriana y el halo de inhibicin de crecimiento en la superficie de una placa de agar sembrada homogneamente con la bacteria a ensayar. ACTIVIDAD PRACTICA Procedimiento En el laboratorio encontrar placas con agar Meller-Hinton, agar Meller-Hinton/sangre y tubos con un cultivo bacteriano Prepare el inculo bacteriano que posea una concentracin celular aproximada de 10 8 ufc/ml en caldo Meller-Hinton Con una trula de algodn estril siembre en las placas de agar el inculo bacteriano de tal forma que toda la superficie del agar quede sembrada (tapiz bacteriano) Seleccione los antibiticos a ensayar, dependiendo del microorganismo utilizado Coloque los discos de antibacterianos sobre la placa de agar, distribuyndolos de tal manera de mantener una distancia de 1 a 2 cm entre cada disco, utilizando una pinza metlica esterilizada con alcohol encendido en la llama del mechero. Espere que la pinza se enfre lo suficiente para no alterar el antibacteriano del disco Deje las placas a temperatura ambiente alrededor de 15 minutos para que difunda el antibiticos, posterior a este tiempo incube las placas a 37C por 18-24 horas A las 24 h de incubacin proceda con las siguientes actividades: - Mida los dimetros de los halos de inhibicin en milmetros sobre fondo negro - Interprete los resultados catalogando a la bacteria como susceptible (S), intermedio (I) o resistente (R) haciendo uso de la tabla de interpretacin adjunta (Tabla de CLSI)

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Interpretacin de zonas de inhibicin de crecimiento bacteriano Agente antimicrobiano Amikacina Amoxicilina /clavulnico Staphylococcus sp. Otros microorganismos Ampicilina Bacterias Gram-negativas Staphylococcus sp. Enterococcus sp. Streptococcus sp. Ampicilina /sulbactam Gram-negativos entricos y Staphylococcus Aztreonam Carbenicilina Pseudomonas sp. Otros Gram-negativos Cefoperazona Cefotaxima Cefradina Ceftazidima Ceftizoxima Ceftriaxona Cefuroxima (oral) Cefuroxima (parenteral) Cloranfenicol Cloxacilina Ciprofloxacina Eritromicina Furazolidona Gentamicina Penicilina G Staphylococcus sp. Enterococcus sp. Streptococcus sp. Contenido del disco 30 g 20/10 g 20/10 g 10 g 10 g 10 g 10 g 10/10 g 30 g 100 g 100 g 75 g 30 g 30 g 30 g 30 g 30 g 30 g 30 g 5 g 15 g 10 g 10 U 10 U 10 U Dimetro de inhibicin (mm) Resistente Intermedio Susceptible 14 19 13 13 28 16 21 13 15 13 19 15 15 14 14 14 13 14 14 12 10 15 13 14 12 28 14 19 14 12 10 13 15-16 14-17 14-16 17 22-29 17 20 18 17 29 30 17 22 17 23 21 23 18 18 20 21 23 18 18 13 21 23 17 15 29 28 19 15 16 19

14-16 16-21 14-16 20-22 16-20 15-22 15-17 15-19 14-20 15-22 15-17 13-17 16-20 14-22 13-14 15 20-27 15-18 13-14 11-15 14-18

Tetraciclina 30 g Tobramicina 10 g Trimetoprin/sulfametoxazol 1.25/23.75 g Agentes especficos para Tracto urinario Acido nalidixico 30 g

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Nitrofurantoina Norfloxacina

300 g 14 10 g 12 ACTIVIDAD PRACTICA N4

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DIVERSIDAD BACTERIANA - FLORA NORMAL Objetivos Relacionar diversidad bacteriana con presencia de flora normal del organismo humano Comprender importancia de la toma de muestra en el trabajo microbiolgico Aplicar tcnicas adecuadas en la obtencin de muestras para estudios microbiolgicos

CONCEPTOS BSICOS INVOLUCRADOS EN ESTA CLASE PRCTICA Muchos microorganismos existentes en la naturaleza viven gran parte de sus vidas en relacin estrecha (simbiosis) con otras especies de seres vivos. La microbiota normal humana, corresponde a todos los microorganismos simbiticos que se encuentran normalmente asociados a sistemas anatmicos como la piel, tubo digestivo, sistema respiratorio superior, sistema urogenital, conjuntiva, etc. El feto humano in utero se encuentra libre de bacterias y otros microorganismos, sin embargo, a las pocas horas de nacido comienzan a colonizarse por una gran diversidad de microorganismos en forma progresiva, estimndose que un adulto normal posee aproximadamente 1014 bacterias simbiontes. La mayora de los microorganismos que pertenecen a la microbiota normal estn en relacin comensal con el hospedador, sin embargo, algunos pueden estar en relacin mutualista y otros como parsitos, los cuales junto a los microorganismos patgenos sern responsables de procesos infecciosos en el ser humano. El estudio de procesos infecciosos requiere, habitualmente la recuperacin de microorganismos causantes de la infeccin, y su caracterizacin contempla varias etapas: - Observacin microscpica, ya sea de material al fresco o teido, para visualizar elementos que nos permitan entregar un diagnstico preliminar al mdico clnico - Cultivo microbiano: Esta tcnica sigue siendo el gold standard para la mayora de los agentes bacterianos. Consiste en la inoculacin de la muestra en medios de cultivos apropiados, seleccionados de acuerdo al conocimiento de la fisiologa de las bacterias y al cuadro clnico. Este procedimiento permite obtener desarrollo bacteriano suficiente para proceder con la identificacin de la bacteria - Estudio del comportamiento bacteriano frente a los antimicrobianos y as escoger la terapia emprica local ms adecuada. Uno de los eventos ms importante es la recuperacin de microorganismos desde los diferentes sitios orgnicos. Esta recuperacin parte con la recoleccin de la muestra y traslado de la misma al laboratorio. Este proceso consta de cuatro pasos: a) Seleccionar el sitio anatmico adecuado para la toma de muestra b) Usar la tcnica de recoleccin ms apropiada c) Poner la muestra recolectada en un envase que favorezca la viabilidad de los microorganismos causantes del proceso infeccioso d) Enviar la muestra en forma rpida y expedita al laboratorio, y en caso que esto no sea posible, asegurarse que sea almacenada a la temperatura y medios de transporte adecuados
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Una muestra mal tomada puede inducir a error en el aislamiento e identificacin del microorganismo causante del cuadro clnico e iniciar una terapia antibacteriana inadecuada. La calidad del trabajo realizado en el laboratorio de microbiologa no puede ser superior a la calidad de la muestra recibida Reglas bsicas a considerar en el momento de tomar y enviar una muestra al laboratorio de microbiologa: a) La muestra debe ser tomada con mximas precauciones de asepsia, usando el instrumento adecuado y estril (trula, esptula, etc.) b) La muestra debe ser representativa del proceso infeccioso, es decir, debe tomarse del sitio de infeccin, evitando la contaminacin con tejido adyacente, rganos o secreciones c) Debe ser obtenida en el momento ptimo, esto requiere conocimiento de la historia natural y la fisiopatologa de la infeccin. El ejemplo ms clsico corresponde a la fiebre tifoidea, en la cual el agente se encontrar en las primeras semanas en sangre y posteriormente en deposiciones d) Se debe obtener una cantidad suficiente de muestra, segn el nmero de exmenes requeridos, y debe ponerse en recipientes adecuados y estriles e) Una vez obtenida la muestra, sta debe ser enviada al laboratorio a la brevedad (en medios de transporte adecuados si el caso lo requiere), debido a que algunos microorganismos tienen baja resistencia a las condiciones ambientales y en otras muestras (orina) la temperatura ambiente favorece la multiplicacin bacteriana, induciendo a error en el recuento de colonias f) En lo posible, para que la muestra tenga un valor significativo, sta debe obtenerse antes de la administracin de antibiticos. Esto es especialmente importante en el aislamiento de Streptococcus -hemolticos (muestras farngeas), Neisseria gonorrhoeae (cultivos genitourinarios), Haemophilus influenzae y Neisseria meningitidis (lquido cefalorraqudeo). Si el enfermo ya est en tratamiento con antibiticos, estos debern suspenderse por un mnimo cuatro veces la vida media del frmaco y posteriormente tomar la muestra g) La muestra debe rotularse en forma adecuada e ir acompaada de una solicitud de examen que debe indicar bsicamente: -Nombre completo del paciente -Edad -Nmero de ficha clnica -Procedencia (hospitalizado, servicio, nmero de cama o si es ambulatorio) -Tipo de muestra -Fecha y hora de recoleccin de muestra -Examen solicitado -Nombre del mdico -Otras observaciones (control, tcnica usada en recoleccin, etc.)

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FLORA NORMAL DEL CUERPO HUMANO La piel y mucosas hospedan a una gran variedad de bacterias que forman parte de la flora normal y se pueden dividir en: a) Flora residente. Son microorganismos relativamente fijos que se encuentran en un sitio anatmico dado. Si por alguna razn se trastorna esta microflora, rpidamente es restablecida. Son microorganismos comensales y su permanencia en un rea determinada depende de factores como temperatura, humedad, nutrientes e inhibidores. b) Flora transitoria. Son microorganismos no patgenos o slo potencialmente patgenos que se hospedan en la piel o mucosas en forma transitoria, provienen del ambiente y no producen enfermedad a no ser que la flora residente sufra alteraciones. Si esto sucede, la flora transitoria puede colonizar, proliferar y producir enfermedad. Flora normal de la piel La piel debido a su constante exposicin y contacto con el ambiente, es capaz de albergar muchos microorganismos transitorios; sin embargo, existe una flora residente constante y bien definida, siendo diferente en los sitios anatmicos por las secreciones, el hbito de llevar ropa, proximidad de las mucosas, etc. La sudoracin abundante, el lavado, el bao no pueden eliminar o modificar significativamente a la flora normal residente. Algunos microorganismos de la piel son: - Staphylococcus epidermidis - Staphylococcus aureus (pequea cantidad) - Micrococcus sp. - Streptococcus alfa hemolticos - Streptococcus no hemolticos - Propionibacterium sp. - Peptococcus sp. - Otros organismos como Candida sp., Acinetobacter sp., etc. en personas que trabajan en el rea de la salud Flora Normal de la boca y Vas Respiratorias Las mucosas de la boca y de la faringe son a menudo estriles al nacer, pero pueden contaminarse en el paso por el canal vaginal y luego de 4 a 12 horas despus del nacimiento se establecen Streptococcus del grupo viridans como flora residente, junto con Staphylococcus sp., Neisseria sp., difteroides, en trminos generales bacterias aerobias y anaerobias. En la faringe, traquea y fosas nasales se establece una flora similar. En los bronquios se encuentran slo algunas bacterias, pues bronquios y alvolos son normalmente estriles. Algunos microorganismos de nasofaringe son: - Difteroides - Neisseria sp. (no patgenas) - Streptococcus alfa hemolticos - Staphylococcus epidermidis - Haemophilus sp. (no patgenos)

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- Varias especies de bacterias anaerobias Flora Normal del Intestino Al nacer el intestino es estril, pero pronto son introducidos los microorganismos con los alimentos y saliva. Microorganismos intestinales - Enterobacterias (excepto Salmonella sp., Shigella sp., Yersinia sp., Vibrio sp., Campylobacter sp.) - Enterococcus sp. - Staphylococcus epidermidis - Streptococcus alfa hemolticos - Streptococcus no hemolticos - Levaduras en escasa cantidad - Anaerobios en gran nmero - Staphylococcus aureus (escasa cantidad) Flora Normal de Uretra La porcin anterior de la uretra en ambos sexos contiene un nmero pequeo de los mismos tipos de microorganismos hallados en piel y perineo. Flora Normal de la Vagina Poco despus del nacimiento aparecen en la vagina lactobacilos aerobios (bacilos de Doderlein) los cuales permanecen mientras el pH es cido, cuando el pH se hace neutro (pubertad) aparecen cocos y bacilos y adems los lactobacilos en gran cantidad lo que permite una proteccin contra microorganismos patgenos. Microorganismos comensales: - Lactobacillus sp. - Corynebacterium sp. - Streptococcus alfa hemolticos - Streptococcus no hemolticos - Staphylococcus epidermidis - Anaerobios Flora Normal del Ojo (conjuntiva) Los microorganismos del ojo son preferentemente difteroides, Neisseria sp. (no patgenas), etc. La flora de la conjuntiva se mantiene normalmente regulada por el flujo de las lgrimas que contienen lisozima antibacteriana Microorganismos comensales del ojo: - Difteroides - Neisseria sp. (no patgenas)

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- Haemophilus sp. (no patgenos) - Staphylococcus no hemolticos - Streptococcus no hemolticos TRABAJO PRACTICO I. Flora normal de las vas respiratorias

1. Con una trula estril tome a su compaero una muestra de secrecin nasal 2. Siembre esta muestra en agar sangre, agar Mac Conkey y caldo Tripticasa de Soya. II. Flora normal de la piel

1. Con una trula estril humedecida en suero fisiolgico estril tome una muestra de alguna zona de la piel a un compaero. 2. Siembre esta muestra en Agar Sangre, Agar Mac Conkey y caldo Tripticasa de Soya. II. Flora normal de conducto auditivo externo

1. Con una trula estril humedecida en suero fisiolgico estril tome una muestra de alguna zona de la piel a un compaero. 2. Siembre esta muestra en Agar Sangre, Agar Mac Conkey y caldo Tripticasa de Soya. Incube todas las placas sembradas en estufa a 37C por 24 horas. Posterior a la incubacin, observe sus cultivos, anote y discuta resultados con sus compaeros.

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ACTIVIDAD PRACTICA N5 DIVERSIDAD BACTERIANA MUESTRAS CLINICAS Objetivos Relacionar diversidad bacteriana con presencia de flora normal del organismo humano Comprender importancia de la toma de muestra en el trabajo microbiolgico Aplicar tcnicas adecuadas en la obtencin de muestras para estudios microbiolgicos

TRABAJO PRACTICO Ud. recibir una serie de muestras clnicas las cuales deber sembrar en placas de cultivo de agar sangre, agar Mac Conkey y caldo Tripticasa de Soya. Incube todas las placas sembradas en estufa a 37C por 24 horas. Posterior a la incubacin, observe sus cultivos, anote y discuta resultados con sus compaeros.

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ACTIVIDAD PRACTICA N6 HONGOS Y LEVADURAS Objetivos Distinguir diferentes formas, macroscpicas y microscpicas, de hongos filamentosos y levaduras Conocer algunas metodologas en el estudio de hongos y levaduras CONCEPTOS BSICOS INVOLUCRADOS EN ESTA CLASE PRCTICA Los hongos comprenden un amplio y variado grupo de organismos eucariontes que poseen una pared celular definida y existencia heterotrfica. Pueden ser saprfitos o parsitos, segn si obtienen sus nutrientes de la materia orgnica muerta o viva respectivamente. Estos microorganismos pueden ser: Pluricelulares, complejos y heterogneos, llamados hongos filamentosos Unicelulares, llamados levaduras La identificacin de los hongos filamentosos est basada principalmente en las caractersticas macro y microscpicas de las colonias. Entre estas, la morfologa microscpica de los cultivos es la que proporciona los datos ms importantes: el grosor de los filamentos, el tipo y la distribucin de los septos, y, sobre todo, la forma, el tamao y la disposicin de las esporas y de las estructuras formadoras de stas. Entre los hongos filamentosos la cantidad y tipo de esporas son muy variables, y estn afectadas por diferentes factores, como el tipo de medio y las condiciones de cultivo. A fin de conseguir unas condiciones ptimas de esporulacin, es de gran importancia ofrecer al hongo las mejores condiciones de crecimiento posibles. Los principales mtodos aplicados para la observacin microscpica de los cultivos son: la observacin en fresco, con una solucin adecuada y las preparaciones en cinta adhesiva. Los cultivos observados segn estos mtodos resultan tiles en la mayora de los casos para identificar las especies, pero en muchas ocasiones no permiten revelar las principales caractersticas morfolgicas de una especie determinada. En estos casos es necesario recurrir a un tipo de preparacin ms compleja, como es la realizacin de microcultivos o cultivos en portaobjetos. Mtodos de observacin de hongos El examen microscpico de muestras para estudio de hongos tiene una gran utilidad y puede o no ser sembradas en medios de cultivo para aislamiento de las especies micticas, ya que este no siempre resulta positivo cuando la observacin directa positiva.

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Mtodo del KOH Este tratamiento tiene por objetivo destruir gran parte de la estructura tisular, manteniendo inalterable a los hongos, lo cual facilita su observacin al microscopio. - Colocar unas gotas de KOH (con o sin tinta Parker) en un portaobjetos - Colocar la muestra en el lquido y mezclar cuidadosamente - Calentar suavemente al mechero sin hervir. La formacin previa de burbujas de gas indica que se aproxima el momento de suspender el calentamiento. - Colocar un cubreobjetos y observar al microscopio con aumento menor (10x) y luego 40x Observacin de cultivos Es importante examinar los cultivos en la medida en que se estn formando porque esto facilita la observacin de sus estructuras reproductivas caractersticas. 1. Suspensin en lactofenol. Colocar gotas de lactofenol en portaobjetos con asa de metal sacar una pequea porcin de la colonia y colocar en el lactofenol. Con dos asas metlicas, separar y extender suavemente la masa micelial y colocar cubreobjetos. Observar, con bajo aumento, cambiando a aumento mayor. Lamentablemente este mtodo no preserva la estructura y posicin de conidias, esporas y similares. Sin embargo, es un mtodo que debe efectuarse. 2. Tcnica del celofn o cinta adhesiva. Cortar un trocito de cinta adhesiva y formar un crculo con el pegamento hacia el exterior. Con una pinza pegar sobre la superficie de la colonia del hongo y levantar. Luego abrir el crculo de cinta y colocarlo sobre una gota de lactofenol en un portaobjetos de tal manera que se pegue al vidrio y observe al microscopio con los aumentos correspondientes. Las levaduras son hongos de tallo unicelular capaces de reproducirse asexuadamente por gemacin o fisin y la mayora de ellas fermentan uno o varios azcares. Su identificacin se basa en criterios fisiolgicos y escasamente en criterios morfolgicos. El estudio morfolgico de las levaduras permite orientar o aproximar hacia el gnero, pero la identificacin definitiva se hace siempre sobre la base de pruebas bioqumicas. Las pruebas de identificacin de levaduras pueden agruparse en dos categoras: Pruebas morfolgicas a) Aspecto de las colonias b) Observacin microscpica de los cultivos c) Presencia de ascosporas

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Pruebas fisiolgicas a) Temperatura mxima de crecimiento b) Crecimiento en presencia de cicloheximida c) Capacidad de utilizacin de diversos compuestos como nica fuente de carbono en condiciones de aerobiosis d) Capacidad de fermentacin de diversos azcares e) Capacidad de utilizacin de diversos compuestos como fuente nica de nitrgeno f) Actividad ureasa g) Capacidad de crecimiento con altas concentraciones de glucosa

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TRABAJO PRACTICO a. Observacin microscpica de hongos filamentosos y levaduras En el laboratorio encontrar una serie de preparaciones de diversos hongos, obsrvelos al microscopio, distinga sus principales caractersticas. b. Observacin macroscpica de cultivos Proceda a observar placas de agar Sabouraud de una muestra de hongo ambiental. Anote sus caractersticas. Tambin proceda a observar una levadura sembrada en agar Sabouraud que encontrar a su disposicin en el laboratorio.

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ACTIVIDAD PRACTICA N7 PARASITOLOGIA Objetivo Reconocer morfologa macro y microscpica de los parsitos de importancia en clnica. CONCEPTOS BSICOS INVOLUCRADOS EN ESTA CLASE PRCTICA Los parsitos son tan antiguos, en el conocimiento del hombre, como su misma existencia. Durante toda la antigedad y hasta mediados del siglo XVIII, la Parasitologa consisti en el conocimiento de parsitos macroscpicos, parte de la sintomatologa clnica y algunas indicaciones teraputicas. Sin embargo se pensaba que estos animales, eran productos naturales del cuerpo humano, como las verrugas. Slo en la poca de Linneo se crey que los parsitos procedan de seres de vida que accidentalmente se instalaban en el organismo humano. Luego con el empleo del microscopio se descubri por primera vez un protozoo intestinal (Leeuwenholk 1632-1723), posiblemente Giardia lamblia, desde las deposiciones. Posteriormente, durante el siglo XIX y XX, en gran parte, como consecuencia de los descubrimientos anteriores, se generaron una serie de investigaciones que llevaron a interesantes nuevos descubrimientos que proporcionaron a la Parasitologa su base cientfica actual. Desde un punto de vista biolgico, el parasitismo es un fenmeno de relacin entre seres vivos. Esta asociacin sera ideal, si todos los asociados gozaran del beneficio, pero en el caso del parasitismo uno de los asociados aparece perjudicado. Un factor importante de conocer es la relacin hospedador parsito Para ello debemos caracterizar los hospedadores: Se denomina hospedador al ser que alberga el parsito y podemos tener: - Hospedador definitivo: Aquel individuo en que el parsito alcanza su madurez sexual - Hospedador intermediario: Aquel individuo en que el parsito debe realizar parte de su desarrollo evolutivo De acuerdo a ubicacin del parsito en el hospedador podemos distinguir: - Si el parsito vive en la piel de su husped se llama Ectoparsito - Si habita en sus rganos internos, sangre o linfa se denomina Endoparsito Segn su relacin con el hospedador podemos encontrar: - Parsito facultativo, microorganismo que est capacitado para tener vida libre - Parasito obligado, microorganismo que debe obligatoriamente vivir asociado a un hospedador - Parsito accidental es aquel microorganismo que invade a un hospedador que no es el adecuado para el desarrollo de su especie

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CICLO VITAL DE UN PARASITO Se entiende por ciclo vital el proceso de desarrollo de un parsito, desde su primera formacin hasta alcanzar su estado adulto con capacidad de reproduccin. El ciclo vital puede ser: - Directo caracterizado porque el elemento o forma infectante del parsito puede pasar fcilmente de un husped a otro por simple contacto - Indirecto, caracterizado porque el elemento o forma infectante necesita un tiempo de maduracin en el medio externo, en condiciones de humedad y temperatura adecuada para poder desarrollarse en otro hospedador o necesita de un hospedador intermediario para completar su desarrollo. Un parsito que tiene un ciclo vital directo de desarrollo puede transmitirse fcilmente de un husped a otro y su infeccin ser ms difundida. En cambio, la necesidad de un husped intermediario, limita el riesgo de infeccin. La profilaxis de las diferentes parasitosis debe considerar diversos factores (ciclo de vida, hospedador, etc); sin embargo, existen otros factores que seguramente son los ms importantes en la mantencin y propagacin de estas enfermedades y que siempre veremos asociadas al parasitismo, ellos son: la ignorancia, la pobreza, los malos hbitos higinicos, la falta de limpieza, entre los ms comunes.

TRABAJO PRACTICO Durante la sesin de laboratorio, estar a su disposicin una serie de muestras de parsitos y sus formas infectantes microscpicas las cuales debe observar, anotar y dibujar caractersticas principales en su cuaderno.

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