ATLAS de HISTOLOG IA VEGETAL y ANIMAL

TECNICAS HISTOLOGICAS CUESTIONARIOS RESPUESTAS

Pilar Molist Manuel A. Pombal Manuel Meg as Depto. de Biolog a Funcional y Ciencias de la Salud Facultad de Biolog a Universidad de Vigo
(Versi on: Noviembre 2011)

1.

FIJACION. Respuestas

1) La jaci on sirve para preservar las caracter sticas morfol ogicas y mol eculares de los tejidos. Es cierto. De otra forma los tejidos sufren autolisis y degradaci on por microbios. Adem as, los tratamientos en solventes org anicos o a altas temperaturas durante el procesamiento histol ogicos son muy agresivos con las celulas. 2) Existe un jador universal para cualquier tipo de tejido y de t ecnica. Es falso. Existen numerosos tipos de jadores (alcohol, aldeh dos, oxidos, etc etera) que se emplean seg un lo que queremos observar del tejido y tambi en depende del tipo de tejido que queramos procesar. 3) Entre las caracter sticas que debemos considerar a la hora de elegir un jador est a su velocidad de penetraci on. Es cierto. Esto es especialmente importante cuando la jaci on se hace por inmersi on y no por perfusi on vascular. Por ejemplo, cuando trabajamos con material vegetal o con biopsias animales. 4) El efecto mordiente de los jadores permite una mejor preservaci on de las estructuras lip dicas de los tejidos. Es falso. El efecto mordiente es una propiedad de algunos jadores que permite una mejor tinci on de algunas estructuras tisulares. Con el uso de otros jadores sin efecto mordiente estas estructuras son muy dif ciles de poner de maniesto mediante tinciones generales. 5) Un artefacto durante el proceso de jaci on provoca que se observen mejor ciertas estructuras tisulares. Es falso. Los artefactos son modicaciones que se producen en el tejido durante el proceso de jaci on y que falsean la organizaci on natural del tejido. Por tanto tenemos que tenerlas en cuenta para no describir modicaciones articiales como si fueran caracter sticas propias del tejido. Por ello los jadores suelen prepararse a pH y osmolaridad siol ogicos. 6) Hay jadores que no son sustancias qu micas. Es cierto. Son los denominados m etodos f sicos. En algunas ocasiones se usa calor, microondas o congelaci on para jar los tejidos. Hay que tener en cuenta, sin embargo, los artefactos que estos procesos puedan provocar

en el tejido. 7) La jaci on por perfusi on consiste en sumergir una pieza de tejido en el l quido jador. Es falso. La perfusi on consiste en introducir el jador por el sistema vascular del animal o de un organo concreto. Sumergir el tejido en l quido jador se denomina jaci on por inmersi on. 8) El tiempo de jaci on en la jaci on por perfusi on es mayor que en la que se realiza por inmersi on. Es falso. La rapidez de la jaci on por inmersi on depende de la velocidad de penetraci on del jador y del grosor de la pieza de tejido que queramos jar. Sin embargo, la jaci on por perfusi on es extremadamente r apida y no depende cr ticamente de la velocidad de penetraci on del jador puesto que siempre existen capilares sangu neos a unas pocas micras de cualquier c elulas del organismo. Por tanto, el jador llega muy r apido y a todas las c elulas del organismo, disminuyendo as el tiempo de ajci on. 9) Con la jaci on por inmersi on se pueden jar piezas de tejido mayores que con la jaci on por perfusi on. Es falso. La inmersi on s olo permite jar piezas menores a 0,5 cm de di ametro, aunque puede variar en funci on de la velocidad de penetraci on del jador. Ello es as porque a tama nos mayores de muestras se produce una degradaci on de las c elulas que est an en el interior de la pieza por la tardanza en la llegada del jador. Por perfusi on el jador puede llegar a todas las c elulas del organismo a trav es del sistema vascular y por tanto se puede jar incluso animales enteros. 10) Los jadores se pueden combinar entre s para hacer mezclas jadoras. Es cierto. Es frecuente aprovechar las caracter sticas ajdoras de varias sustancias en una misma soluci on jadora. Por ejemplo, el acido ac etico es bueno para los acidos nucleicos pero preserva mal las prote nas y membranas y por ello se suele combinar con aldeh dos. 11) El jador ideal para los acidos nucleicos es el acido ac etico. Es cierto. 12) El formaldeh do es uno de los jadores m as ampliamente usado.

Es cierto. Es un buen jador para prote nas y l pidos, produce pocos artefactos y sirve como conservante. 13) Los tejidos que se van a procesar para su observaci on con el microscopio electr onico necesitan jarse con alcoholes. Es falso. Los alcoholes preservan muy mal la ultraestructura celular y sobre todo la parte lip dica que es la delimita la ultraestructura celular (membranas celulares). Para la microscop a electr onica se usa una combinaci on de jadores en serie que contienen glutaraldeh do y tetr oxido de osmio. 14) La mezcla de BOUIN contiene acido p crico. Es cierto. Esta mezcla jadora contiene adem as formaldeh do y acido ac etico. Es ideal para observaciones con tinciones generales en secciones obtenidas a partir de inclusiones en parana.

2.

INCLUSION. Respuestas

1) La inclusi on de los tejidos sirve para obtener secciones delgadas ya que endurecen la muestra. Es cierto. Se sigue la regla de que cuanto m as delgada queramos hacer la secci on m as dura debe estar la muestra. 2) La inclusi on es la u nica manera de endurecer las muestras para obtener secciones. Es falso. Con la congelaci on se pueden conseguir endurecer el tejido lo suciente como para conseguir secciones muy delgadas, incluso ultranas. 3) La parana se endurece por solidicaci on. Es cierto. Para initrar la parana en los tejidos hay que colocarla a uno 60 grados cent grados, a los cuales es l quida, y a nadir el tejido durante unas horas para que la parana l quida se inltre en el. Una vez inltrada se lleva temperatura ambiente para que se solidique, con el consiguiente endurecimiento. 4) Las resinas son medios de inclusi on que se endurecen por polimerizaci on. Es cierto. Las resinas tipo epoxy se se consiguen a partir de 2 componentes l quidos, m as un acelerador y un plasticante. A temperatura ambiente son l quidas y tras inltrarse en el tejido se colocan a 60 grados cent grados, produci endose la polimerizaci on. Estas resinas son las que aportan mayor dureza a los tejidos, gracias a la cual se pueden obtener secciones muy delgadas. Otras resinas como el metacrilato polimerizan cuando se someten a luz ultravioleta. 5) Las resinas tipo epoxy y la parana son miscibles en agua. Es falso. Por ello, hay que elimina el agua de los tejidos mediante una deshidrataci on, normalmente alcoh olica. Tambi en es necesario usar un l quido intermiario entre la resina o parana y el alcohol absoluto, que normalemente es el xileno para la parana y el oxido de propileno para las resinas tipo expoxy. Igual ocurre para el metacrilato. Hay otras resinas que son miscibles en agua y para las que no es necesario deshidratar a las muestras de tejido. 6) Las paranas producen tejidos m as duros que las resinas.

Es falso. Las resinas son las que m as endurecen los tejidos, mucho m as que las paranas. Por ello con las paranas se obtienen cortes nos y con las resinas seminos y ultranos. 7) La inclusi on en parana sirve para obtener cortes que se pueden observar con el microscopio electr onico. Es falso. Los cortes obtenidos a partir de tejido incluido en parana son nos y sirven, tras su tinci on, para la observaci on con microscopios opticos o uorescentes. 8) Para observar secciones obtenidas a partir de tejidos incluidos en resina es necesario eliminar previamente la resina. Es falso. Tanto los cortes seminos como los ultranos se pueden te nirse y contrastrarse, respectivamente, para su observaci on con el microscopio optico en el primer caso y con el electr onico en el caso de las secciones ultranas.

3.

CORTE. Respuestas

1) Para observar los tejidos con microscopios opticos debe hacerse sobre secciones obtenidas a partir de dichos tejidos. Es cierto. Ello es porque la luz debe atravesar el tejido y en porciones gruesas de tejido esto no ocurre o la difusi on de la luz impide ver las estructuras con nitidez. 2) Los aparatos para obtener secciones de tejido se denominan microtomos. Es cierto. Hay de diferentes tipos que se usan en funci on del medio de inclusi on, el grosor del corte que queremos obtener o las caracter siticas del tejido que queramos preservar. 3) El microtomo de rotaci on sirve para obtener secciones de material incluido en parana. Es cierto. Con el se obtienen secciones de entre 5 y 20 mum a partir de tejidos incluidos en parana. 4) Para cortar bloques de parana hay que estirarlos previamente con calor. Es falso. Lo que se estira con calor son los cortes obtenidos a partir de bloques de parana. 5) El retallado de los bloques de parana sirve para que las secciones sean m as delgadas. Es falso. El retallado sirve para obtener series de cortes bien orientadas y en tiras rectas, adem as de para facilitar que un corte arrastre al previamente cortada del borde de la cuchilla. 6) Los cortes de parana se depositan sobre portaobjetos recubiertos con una sustancia adherente. Es cierto. Esa sustancia sirve para el tejido no se desprenda del portaobjetos una vez hallamos eliminado la parana. 7) La temperatura de estirado de los cortes de parana debe estar en torno a los 65 grados cent grados. Es falso. Debe estar en torno a los 30-40 grados cent grados. A 60 grados las paranas son l quidas y los cortes se deshar an.

8) El vibratomo sirve para hacer cortes de tejido que no ha sido incluido. Es cierto. Este microtomo sirve para hacer cortes sobre tejido endurecido con jador o a partir de tejido vegetal, en el cual las paredes celulares dan consistencia al tejido. No permite hacer cortes m as nos de unos 30 a 40 mum y las secciones permanecen en otaci on. 9) Cortes en otaci on signica que las secciones no se adhieren a portaobjetos. Es cierto. El procesamiento de estas secciones no supone la adhesi on a un portaobjetos y se puede hacer con aquellas que son relativamente gruesas como las obtenidas con el vibratomo o el microtomo de congelaci on. 10) Los bloques de tejido cortados con un criotomo deben estar previamente jados. Es falso. Aunque es lo recomendable no es necesario, puesto que el proceso de congelaci on endurece sucientemente el tejido como para poder obtener secciones nas con el criostato o m as gruesas con el microtomo de congelaci on. 11) La crioprotecci on es importante para no destrozar el tejido cuando usamos los criotomos. Es cierto. Los crioprotectores, como la sacarosa o el glicerol, se usan para que los cristales que se formen durante la congelaci on no sean grandes y destruyan as al tejido. Aunque no es imprescindible, ayuda a una mejor preservaci on del tejido congelar la pieza de forma muy r apida, por ejemplo usando nitr ogeno l quido. 12) El microtomo de congelaci on hace cortes m as delgados que el criostato. Es falso. Es el criostato con el que se pueden conseguir cortes m as delgados, de unas 5 a 10 mum, mientras que con el microtomo de congelaci on se consiguen cortes por encima de 30 mum. Hoy en d a existen los ultracriotomos que son capaces de obtener secciones de pocas decenas de nanometros para su observaci on en el microscopio electr onico de transmisi on. 13) Los cortes seminos tienen un grosor de unos pocos nanometros. Es falso. Los cortes seminos tienen entre 0.5 y 2 mum. Los cortes del orden de nanometros se denominan ultranos.

14) Con el ultramicrotomo se obtienen cortes seminos y ultranos. Es cierto. El ultramicrotomo es un microtomo de alta precisi on con el que se consiguen cortes muy delgados (desde decenas de nanomentros hasta 1 o 2 mum, a partir de material incluido en resinas. 15) Cuando m as endurecido est a el tejido m as delgados son los cortes que se pueden obtener de el. Es cierto. Es una regla general seg un la cual el grosor del corte est a directamente relacionado con la dureza del material que se corta. Por eso, para obtener secciones ultranas se incluye el tejido en resinas que cuando polimerizan tienen una gran dureza. Otra forma de endurecer el tejido es por congelaci on, sin necesidad de usar resinas. 16) Las cuchillas que usa el ultramicrotomo y el criostato son similares. Es falso. El ultramicrotomo necesita un borde de corte de la cuchilla muy alado, que s olo se consigue con v drio o con diamante. Por el contrario, el criostato usa cuchillas de metal con los m as romos. 17) Las secciones que se obtienen con el ultramicrotomo se pueden procesar unidas a portaobjetos. Es cierto. Pero s olo para el caso de las seccinoes seminas, para el caso de las secciones ultranas se necesita un soporte distinto denominado rejilla. Las rejillas son soportes de metal, normalmente niquel o cobre, sobre las cuales se depositan los cortes ultranos.

4.

TINCION. Respuestas

1) Los colorantes son pigmentos que se adhieren a determinados componentes celulares. Es cierto. 2) La parte del colorante que aporta el color se denomina crom oforo. Es cierto. Los colorantes suelen tener tres componentes: esqueleto incoloro, el crom oforo y el auxocromo, el cual se une al tejido. 3) Un colorante acido ti ne los n ucleos de las c elulas. Es falso. Los colorantes acidos se unen a estructuras b asicas de la c elula, como matriz extracelular o citoplasma. El n ucleo es fundamentalmente acido debido a la abundancia de acido desoxirribonucleico (ADN). 4) La metacromasia signica que tras la uni on del colorante al tejido cambia el color de este. Es cierto. Esto es debido a que algunos colorantes cambian sus propiedades de color cuando interaccionan con los tejidos. 5) La hematoxilina-eosina es una tinci on general formada por un s olo colorante. Es falso. Como su nombre indica esta tinci on tiene dos colorantes: la hematoxilina, un colorante b asico, y la eosina, un colorante acido. La hematoxilina y la eosina ti nen la mayor a de las estructuras tisulares de un color p urpura y rosado, respectivamente. 6) Durante las tinciones generales de tejidos incluidos en parana siempre se ti ne antes de desaparanar las secciones. Es falso. Primero hay que desparanar las secciones puesto que de otra manera los colorantes no podr an entrar en el tejido. 7) Para te n r secciones incluidas en resina no es necesario eliminar dicha resina. Es cierto. Algunos colorantes como el azul de toluidina pueden penetrar en dichas resinas cuando se hace la tinci on a alta temperatura (70- 80 grados cent grados). 8) Los cortes ultranos se contrastran con acetato de uranilo.

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Es cierto. El uranilo se deposita sobre las membranas y otros elementos de la c elula, lo que provoque que los electrones reboten, no incidan en la pantalla uorescente y permita la formaci on de una imagen. Tambi en se a nade citrato de plomo con el mismo prop osito, ayudando al acetato de uranilo. 9) Las reacciones histoqu micas suponen una reacci on qu mica en la que participan mol eculas del propio tejido. Es cierto. 10) La t ecnica de PAS sirve para poner de maniesto los l pidos. Es falso. Sirve para poner de maniesto hidratos de carbono. 11) La histoqu mica enzim atica sirve para descubrir la presencia de ciertos enzimas en los tejidos. Es cierto. Se a naden sustratos espec cos que son procesados por el enzima deseado y el producto de la reacci on es una sustancia coloreada e insoluble, de manera que precipita en el lugar donde se ha producido la reacci on. 12) La histoqu mica enzim atica s olo se puede realizar sobre tejido fresco, no jado. Es falso. Aunque la actividad enzim atica de algunos enzimas se destruya con la jaci on, otras son activas tras la jaci on con jadores convencionales como el paraformaldeh do. De cualquier forma hay que tener en cuenta las caracter sticas de cada enzima a la hora de detectar su presencia mediante histoqu mica. 13) Las lectinas son prote nas que son capaces de reconocer a gl ucidos de manera espec ca. Es cierto. Existen diversas lectinas que se unen de forma espec ca a diferentes az ucares terminales (ver tabla de la p agina de lectinas). 14) Las lectinas, una vez unidas a los az ucares, se pueden observar directamente con el microscopio de uorescencia puesto que tienen autouorescencia. Es falso. Las lectinas no son autouorescentes y por ello se tienen que conjugar con enzimas o con sustancias uorescentes para poder observar su uni on.

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15) La inmunocitoqu mica se basa en el uso de anticuerpos para detectar mol eculas en el tejido. Es cierto. Las inmunoglobulinas son las responsables de reconocer de manera espec ca y con gran anidad a la mol ecula que queremos poner de maniesto en el tejido. 16) Con la inmunocitoqu mica s olo se pueden detectar prote nas. Es falso. Se puede detectar cualquier mol ecula que sea capaz de desencadenar una respuesta inmune y por tanto producir anticuerpos. 17) Los anticuerpos policlonales son capaces de reconocer m as de una parte de la mol ecula que queremos detectar. Es cierto. Una mol ecula tiene diversos lugares que pueden actuar como determinantes antig enicos cuando se inocula para la producci on de anticuerpos. Se activan diversos clones de linfocitos que producen las inmunoglobulinas, por tanto, policlonales. Cuando se utiliza el suero de estas inmunizaciones se est an empleando anticuerpos policlonales que se unir an a diferentes partes de nuestra mol ecula. 18) En la inmunocitoqu mica la uni on de los anticuerpos con las mol eculas del tejido no se puede detectar si no se une un enzima directamente a ese anticuerpo. Es falso. Aunque la uni on de un enzima al primer anticuerpo se usa en inmunocitoqu mica, se denomina t ecnica de detecci on directa, lo m as normal es unir marcadores a un segundo anticuerpo y la enzima est a en un complejo que se une a esos marcadores del anticuerpo secundario, es la inmunocitoqu mica con detecci on indirecta. 19) La inmunouorescencia permite la detecci on de m as de una mol ecula en el mismo tejido. Es cierto. Para ello se usan anticuerpos unidos a uorocromos diferentes que pueden ser discriminados en un microscopio de uorescencia o confocal. 20) Para la inmunouorescencia se usan anticuerpos especiales, distintos a los empleados en la inmunocitoqu mica. Es falso. Se usan los mismos anticuerpos s olo que la mol ecula conjugada con ellos es un uorocromo.

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21) El marcaje inmunouorescente se puede estudiar durante tanto tiempo como el de la inmunocitoqu mica. Es falso. Los uorocromos van perdiendo capacidad de emitir luz visible cuanto m as tiempo se excitan. Ello quiere decir que la se nal que podemos observar va decayendo con el tiempo. La inmunocitoqu mica, sin embargo, produce un precipitado insoluble y coloreado que una vez deshidratado, montado con medios de montaje y cuebierto con un cubre puede durar para siempre (no se gasta con la observaci on). 22) La hibridaci on in situ se emplea para detectar la presencia de ARN mensajero. Es cierto. Esa es una de sus principales usos, pero modicaciones de esta t ecnica sirven para detectar secuencias de ADN en los cromosomas, o caulquier otro tipo de cadena de nucle otidos, como RNA de interferencia, ARNt o ARN de las ribonucleoprote nas. 23) Una sonda empleada para hibridaci on in situ para un determinado ARN mensajero sirve para detectar ese ARN mensajero en cualquier especie. Es falso. Un gen en diferentes especies no tiene una secuencia de nucle otidos id entica y por tanto es necesario producir una sonda para cada especie, ya que la detecci on se basa en la complementariedad de bases. 24) Para la detecci on de la hibridaci on de la sonda con el ARN mensajero se usan siempre anticuerpos contra marcadores presentes en la propia sonda. Es falso. Aunque esto es lo m as frecuente tambi en se pueden marcar directamente la sonda con sustancias uorescentes y, as , tras la hibridaci on se puede observar directamente con un microscopio de uorescencia. 25) La clonaci on es un paso previo a la obtenci on de una sonda para hibridaci on in situ. Es cierto. La clonaci on supone la inserci on de la secuencia de nucle otidos que queremos detectar en pl asmidos y estos en bacterias. Una vez multiplicados, la sonda se obtiene por transcripci on de la secuencia que est a en dichos pl asmidos. N otese que la transcripci on supone la obtenci on de una secuncia, nuestra sonda, complementaria a la secuencia que queremos detectar.

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5.

OBSERVACION. Respuestas

1) Los primeros microscopios opticos se inventaron a principios del siglo XVII. Es verdadero. El microscopio electr onico se invent o mucho despu es, a mediados del siglo XX. 2) El poder de resoluci on y los aumentos de un microscopio son la misma cosa. Es falso. El poder de resoluci on es la capacidad para discriminar dos puntos pr oximos. Es mayor cuanto m as pr oximos est en los puntos. Para el microscopio optico es de 200 mum y viene determinado por el uso de la luz visible. Los aumentos, por otra parte, son el resultado de multiplicar los aumentos que nos proporciana el objetivo por el que nos proporciona el ocular. En el microscopio o ptico es de unos 1000 a 1500 aumentos y dependen de la calidad de las lentes. Pero por m as que consigamos aumentar una imagen con el microscopio optico no podremos aumentar el poder de resoluci on. 3) El aceite de inmersi on se usa con el objetivo de 40 x. Es falso. Se usa con el objetivo de 100x, y en algunos casos con objetivos de 60x. A estos objetivos se les denomina de inmersi on puesto que la imagen que aportan es n tida s olo si en vez del aire entre la muestra y la lente colocamos aceite de inmersi on, que tiene el ndice de refracci on adecuado para estas lentes. 4) El condensador es la fuente emisora de luz en los microscopios opticos. Es falso. Es la l ampara. El condensador sirve para concentrar el haz de luz de la fuente sobre la muestra. 5) El microm etrico es un dispositivo de los microscopios opticos para enfocar la muestra de una manera muy precisa. Es verdadero. Para el enfoque de la muestra en los microscopios opticos se emplean el macrom etricos, para enfocar con objetivos de pocos aumentos, y el microm etrico, para ajustes muy precisos cuando se usan lentes de alta magnicaci on. 6) La microscop a de campo oscuro usa luz polarizada.

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Es falso. Se basa en luz emitida lateralmente que al desviarse en la muestra entra por los objetivos y llega hasta los oculares del microscopio. Las estructuras tisulares que no desv en la luz hacia los objetivos apareceran como zonas oscuras. 7) La microscop a optica de Nomarsky se usa para detectar uor oforos. Es falso. La microscop a de Nomarsky se usa para resaltar estructuras dentro del tejido que se diferencian por su densidad, dando un aspecto de tridimendsionalidad. Se necesitan ltros que polarizen la luz y objetivos especiales. Esto permite que en ausencia de colorantes se puedan observar caracter sticas tisulares. Es muy u til para observar secciones seminas, de unas pocas mum de grosor. 8) La microscop a de uorescencia se usa para poner de maniesto a unas mol eculas denominadas uor oforos. Es cierto. Estas mol eculas, cuando son excitadas con una determinada longitud de onda emiten luz visible, que es la que se obserba por los oculares del microscopio de uorescencia. As , la imagen que se observa es luminosa donde se encuentre el uor oforo y oscura o negra donde no est e presente. 9) Los ltros en los microscopios de uorescencia sirven para estimular selectivamente a diferentes uor oforos. Es cierto. Los ltros sirven para dejar pasar una banda de longitudes de onda, espec ca para cada ltro, que excitar a selectivamente a un determinado tipo de uor oforo para que emita luz visible. Este es el fundamento para poner de maniesto dos o m as uor oforos en un mismo tejido, usar ltros espec cos para cada uno de ellos. 10) La microscop a de uorescencia sirve como tinci on general para la observaci on de los tejidos. Es falso. Salvo contados casos, los tejidos no poseen sustancias uorescentes. Exsiten uor oforos que ti nen n ucleos y pueden usarse para obener una imagen general del tejido, pero no se usa como tinci on cotidiana sino cuando se combina con el uso de otros uor oforos. 11) El microscopio confocal sirve para observar tejidos uorescentes o uorocromos a nadidos al tejido. Es cierto. Es un tipo especial de microscopio de uorescencia que permite una mayor nitidez de observaci on y manejo digital de las im agenes

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uorescentes. 12) La ultraestructura celular se observa con los microscopios electr onicos. Es cierto. Gracias a su alta resoluci on se puede observar las forma y organizaci on de los compartimentos celulares. 13) Los microscopios electr onicos usan lentes opticas para concentrar el haz de electrones. Es falso. Usan lentes magn eticas puesto que lo que hay que concentrar son electrones y no luz visible. Las lentes o pticas se usan en los microscopios opticos. 14) Con el microscopio electr onico de transmisi on se pueden ver las membranas celulares. Es cierto. Los metales pesados se depositan en las membranas y, gracias al alto poder de resoluci on que posee, aparecen como l neas oscuras. Gracias a este tipo de microscopio se pudo observar las caracter sticas morfol ogicas de los org anulos celulares.

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