PRACTICA N 05 ESTUDIO DE COCOS GRAMPOSITIVOS I. II.

OBJETIVOS: Conocer las caractersticas de cultivo y microscopicas de Staphylococcus Realizar pruebas de identificacin microbiolgica de S. aureus

INTRODUCCIN: Los Staphylococcus son microorganismos esfricos, inmviles, no esporulados Gram positivos, se agrupan en forma de racimos, debido a que su divisin celular se lleva a cabo entre dos planos perpendiculares entre s. La especie patgena para el hombre es el Staphylococcus aureus que se caracteriza por producir COAGULASA, hemolisinas y en cultivo sus colonias exhiben pigmentacn dorada y crecimiento en altas concentraciones de NaCl. Es agente etiolgico de fornculos, abscesos, etc. y toxiinfecciones. DIFERENCIACION DE LAS ESPECIES DE ESTAFILOCOCOS S. aureus S. s. epidermidis saprophyticu s COLOR DE LAS Amarillo-blanco Blanco Blanco COLONIAS Hemlisis en agar sangre + +/Crecimiento anaerobio + + +/Coagulasa + Fermentacin de la + + + glucosa Fermentacin del manitol + Novobiocina Sensible Sensible Resistente

III. MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS MATERIALES: Placas petri con medio agar sangre Lminas porta objeto Colorantes para Gram. Asas de platino Caldo plasma humano
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Caldo nutritivo

PROCEDIMIENTO OBSERVAR FORMA Y AGRUPACIN DE STAPHYLOCOCCUS 1. Hacer coloracin Gram de las colonias de cultivos de aislamiento de flora microbiana 2. Observar al microscopio utilizando objetivo de inmersin, destacando la forma de agrupacin y la coloracin que toma la bacteria. PRUEBA DE CATALASA Colocar una gota de Perxido de Hidrgeno en un porta objetos y agregar una asada de colonia de la cepa en estudio observar de inmediato la reaccin. La presencia de Burbugeo indica una reaccin positiva. (produccin de catalasa) CULTIVO EN AGAR MANITOL (agar diferencial y selectivo de Staphylococcus) 1. Si se observarn cocos gram positivos en racimos de la cepa en estudio, proceder a sembrar en agar manitol salado: Coger una asada de la cepa en estudio y sembrar en Agar Manitol Salado. Incubar por 24 hrs a 37C 3. Observar las caracteristicas de las colonias 4. Si se manifiesta el viraje del medio a un color amarillo (fermenta el manitol), entonces se dice que corresponde a una cepa de Staphylococcus sp. REALIZAR LA PRUEBA DE LA COAGULASA. 1 Con ayuda de un asa bacteriolgica, transfiera una de las colonias a investigar a un tubo estril que contenga caldo infusin cerebro corazn. Incube 18 a 24 horas a 37C hasta observar un aumento de la turbidez en el tubo por crecimiento bacteriano. Alternativamente, puede tomar una colonia grande bien aislada, de una placa de agar no inhibitorio e inocularla directamente. 2. DESARROLLO DEL ENSAYO .1 Con una pipeta estril de 1 mL, agregue 0,5 mL de plasma descongelado a tubos estriles de 12 x 75 mm 2. Con otra pipeta estril de 1 mL, agregue a los tubos dos gotas del caldo en el que cultiv el micro-organismo por 18 a 24 horas. En forma alternativa, puede tomar con el asa una colonia grande bien aislada, de una placa de agar no inhibitorio y agregarla al tubo que
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contiene el plasma. Asegrese que las bacterias efectivamente se resuspendieron en el plasma 3. Mezcle suavemente. 4. Incube en un bao de agua a 37C por 4 a 24 horas.

Hemos sometido el tubo de ensayo a bao amarilla para incubar por 24 horas.

5. Observe si hay coagulacin cada una hora durante las primeras 4 horas, inclinando suavemente el tubo (no agite). 6 Si el resultado es negativo a las 4 horas, vuelva a incubar y observe nuevamente a las 24 horas. Registre los resultados.

Esquematizar sus resultados Resultado garganta:

Resultado de Heces:

Resultado de piel:

Resultado fosas nazales:

Resultados de saliva:

Determine si la cepa en estudio corresponde a un S. aureus, si es que cumple con las caractersticas siguientes: CARACTERISTICAS color de las colonias Hemlisis en agar sangre Coagulasa Fermentacin del manitol Produccin de catalasa S. aureus Amarillo-blanco + + + +

CUESTIONARIO
1. Mencione las caractersticas microbiolgicas que distinguen a los Staphylococcus. Morfolgicamente los Staphylococcus son cocos Gram positivos. Los estafilococos crecen fcilmente sobre casi todos los medios bacteriolgicos, en cultivos su crecimiento es mejor en el medio sal manitol y agar sangre. Es un coco anaerobio facultativo, es decir que puede crecer tanto en condiciones con oxgeno como carente de ste. Tiene importancia mdica principalmente el S. aureus, y en humanos adems de ste, el S. saprophyticus y el S. epidermidis.

Componentes de la pared celular Peptidoglicano Activacin del complemento cidos teicoicos Antifagoctica Protena A Antifagoctica Cpsula mucoide Adherencia Enzimas Coagulasa Formacin de absceso Estafiloquinasas Destruccin del coagulo Hialuronidasa Invasin hstica Lipasas Colonizacin Toxinas Hemolisinas Rotura de la membrana celular Leucocidina Alteracin de la permeabilidad celular de fagocitos Toxina exfoliatina Epidermlisis Toxina del shock txico Shock Enterotoxinas Intoxicacin alimentaria

2. Esquematize la pared celular de Staphylococcus

STAPHYLOCOCCUS

PARED CELULAR

Componentes: Peptidoglucano: es importante en la patogenia de la infeccin. cidos teicoicos: actan como determinantes antignicos. Protena A: acta como un antgeno bacteriano especfico.

3. Qu factores estn involucrados en la hemolisis de la sangre que produce Staphylococcus en placas de agar sangre?

4. Fundamente la prueba de la Coagulasa para S. aureus. La prueba de coagulasa permite identificar al Estafilococos Aureus (coagulasa - positivo) de otros estafilococos (coagulasa-negativos). S. aureus posee dos tipos de coagulasa: a) Una endocoagulasa o coagulasa ligada o clumping factor, que est unida a la pared celular. Esta acta directamen te sobre el fibringeno provocando la formacin de cogu los o grumos cuando se mezcla una suspensin bacteriana con plasma citratado (test en lmina). b) Una exocoagulasa o coagulasa libre que acta mediante la activacin de un factor srico (CRF), formndose un complejo coagulasa-CRF, el cual reacciona con el fibringeno producindose un cogulo de fibrina (test en tubo). Mientras el test en tubo es definitivo, el test en lmina nos sirve como una rpida y econmica tcnica de tamizaje (screening). Entre un 10 a 15% de las cepas de S. aureus se mostrarn negativas en el test en lmina, por lo cual en esos casos se hace necesario realizar un test en tubo. Test en lmina: debe realizarse dentro de los primeros diez segundos. Un test positivo se evidencia por la formacin de grumos. Los test negativos deben ser confirmados por test en tubo. Test en tubo: se observa la formacin de un cogulo total o parcial si el test es positivo. 5. Escriba y explique un Cuadro clinico donde este involucrado S. aureus Miguel tiene 18 aos y es un estudiante de Ingeniera Ambiental. Encontrndose acampando en la Cuidad de Iquitos, percibi una picadura de insecto en regin frontal. La picadura evoluciono en dos das como ppula eritematosa y dolorosa que va en aumento de tamao. Consulta en la Policlnica local donde se le indica una pomada con corticoides. Al da siguiente presenta lesin aumentada de tamao, muy dolorosa, con edema. Consulta en su Mutualista, indicndosele Ampicilina va oral. Al otro da, fiebre, chuchos, malestar general, gran pstula en la regin frontal y adenopatas cervicales. En una nueva consulta se drena abundante pus que se enva a Bacteriologa. En los das siguientes persiste fiebre y malestar general, instalando disnea y taquicardia. Al examen cardiovascular se constata gran soplo sistlico, taquicardia 120/minuto y algunas
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extrasstoles, por lo que es internado. En el ecocardiograma se observan verrucosidades en la mitral, diagnosticndose endocarditis bacteriana. Se realizan tomas para hemocultivos y se inicia tratamiento con Cefuroxime va intravenosa. Todos los cultivos fueron positivos para S. aureus resistente a la Ampicilina y sensible a Cefalosporinas. Como nico antecedente, el paciente presentaba desde la infancia un pequeo soplo que haba sido calificado como "funcional". 1) Cul pudo ser la fuente de esta infeccin? La fuente de infeccin fue la picadura del mosquito en la regin frontal. 2) Qu rol jug la picadura de insecto? El rol que cumple es de agente siendo la piel un medio para la infeccin. 3) Cmo fue avanzando la infeccin en el paciente? - La colonizacin es el paso previo indispensable. Puede preceder a la infeccin en apenas horas (infeccin exgena). - La puerta de entrada generalmente es cutnea. - Tromboflebitis sptica. - Invasin del torrente sanguneo. - Focos profundos: endocarditis, osteomielitis. - Bacteriemia. - Focos metastticos parenquimatosos: pulmonar, renal, cerebral. - Shock sptico. Fallas de grandes sistemas: CID - Muerte 4) Por qu fueron ineficaces los antibiticos? Los antibiticos que se le haban suministrado Miguel como la Ampicilina se mostr muy deficiente ante la S. aureus comportndose de manera resistente ante al antibiotico, mientras que la Cefalosporinas actu de manera eficaz poniendo sensibles a S. aureus evitar mayor contagio.
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5) Cmo llega S. aureus a la vlvula mitral? Estafilococos Aureus llega invadiendo hasta las paredes del endocardio de las vlvulas cardacas, con formacin de verrucosidades por depsito de fibrina y plaquetas. Estafilococos Aureus es el primer agente con rpido progreso hacia la destruccin valvular. 6) El tratamiento instituido fue correcto? Fue correcto aplicar estos importantes frmacos como la penicilina, qinolonas, cefalosporinas no tienen aplicacin alguna en el tratamiento de las infecciones estafiloccicas porque son muy resistentes a los antibiticos.