Prelaboratorio 1. 1.

Mtodos de antibiograma basados en difusin Los mtodos de difusin se basan en la distribucin homognea del antibitico sobre los medios slidos de cultivo. En trminos generales los antibiticos se impregnan en discos de papel que se colocan sobre placas de medio de cultivo en las que previamente se ha extendido la bacteria que se considera. Tanto la cantidad de antibitico como el nmero de bacterias (inculo) deben controlarse cuidadosamente. El antibitico difunde por el agar creando un gradiente de concentracin decreciente segn se aleja del disco. La bacteria si resulta susceptible no crece en las inmediaciones del disco y forma un halo de inhibicin. Dicho halo es ms grande cuanto mayor es el grado de sensibilidad de la cepa al antimicrobiano. Esta tcnica, denominada de disco-difusin es fcil de realizar, barata, aceptada por los organismos de estandarizacin y abierta en el sentido que permite analizar cualquier microorganismo y cualquier antibitico. Incluso puede aplicarse directamente sobre muestras clnicas en infecciones graves como la meningitis. Los discos con antibitico deben conservarse en fri. El inculo para sembrar las placas suele ajustarse por turbidez y debe corresponder con el nivel 0,5 en la escala arbitraria de McFarland. Tras la incubacin se miden los dimetros de los halos de inhibicin y se interpretan los resultados con ayuda de los puntos de corte establecidos internacionalmente para cada microorganismo y para cada antibitico. El principal inconveniente es su carcter slo cualitativo y su limitacin en bacterias anaerobias y de crecimiento lento. Tambin presenta problemas con antibiticos molecularmente grandes que difunden poco sobre el agar. El sistema Epsilon-Test es un ingenioso mtodo de antibiograma por difusin que en lugar de discos utiliza tiras de papel graduadas con valores de CMI e impregnadas con un antibitico en forma de gradiente de concentracin. La interseccin del halo de inhibicin con la tira de papel indica la CMI del microorganismo para dicho antibitico. Mtodos de antibiograma basados en dilucin Son los mtodos clsicos de antibiograma. En trminos generales consisten en fabricar varios tubos de medio de cultivo con diferentes concentraciones del antibitico en cuestin e inocularlos con la cepa que se estudia. Pueden utilizarse medios lquidos o slidos. La CMI corresponde con el tubo de concentracin ms baja que logre inhibir el 90% del crecimiento bacteriano.

En funcin del soporte donde se realizan los sistemas de dilucin se consideran mtodos de macrodilucin con tubos independientes y mtodos de microdilucin que usan placas integradas con mltiples pocillos en cada uno de los cuales se coloca una concentracin diferente de antibitico Los sistemas automatizados de antibiograma se basan en mtodos de microdilucin. Los mtodos de dilucin son en muchos casos los de referencia por su mayor exactitud y por su carcter cuantitativo (CMI). Se utilizan para confirmar resultados de difusin y en los estudios de sinergia y antagonismo antibitico. Son mas caros y ms laboriosos. Tienen ms facilidad para contaminarse y no son tan abiertos como la difusin en cuanto al nmero de antibiticos. Las tcnicas de dilucin no pueden aplicarse directamente sobre muestras clnicas y en ocasiones la interpretacin de resultados es difcil. La lectura del antibiograma se realiza por turbidez si el medio de cultivo es lquido y por recuento de colonias en medios slidos. Una vez obtenida la CMI correspondiente a cada antibitico se interpreta siguiendo los puntos de corte establecidos y la cepa se clasifica como sensible o resistente a efectos clnicos. Sistemas automatizados Los laboratorios grandes con muchas muestras clnicas estn obligados a realizar muchas pruebas de antibiograma y necesitan sistemas automatizados que ahorren tiempo. Aunque existen muchos todos ellos se parecen bastante entre si. La inoculacin, la incubacin y la lectura estn automatizadas. Se basan en mtodos de microdilucin e incluso algunos integran en el mismo panel pruebas bioqumicas de identificacin de modo que ofrecen resultados completos de diagnstico. 2. Se Utiliza el Agar Mueller Hinton porque este cumple con los requerimientos de la Organizacin Mundial de la Salud y est especificado en la FDA. Este medio es el seleccionado por la NCCLS (National Commitee for Clinical Laboratory Standards) para realizar las pruebas de susceptibilidad, por su alta reproducibilidad, su bajo contenido de substancias inhibidoras y el crecimiento satisfactorio que presentan la mayora de los patgenos no fastidiosos. Con este medio se han llevado a cabo una gran cantidad de estudios sobre susceptibilidad antimicrobiana. En este medio la infusin de carne y la peptona de casena proveen la fuente de nitrgeno, vitaminas, carbn y aminocidos. El almidn es agregado para absorber cualquier metabolito txico y el agar es adicionado como agente solidificante.

3. La utilidad de la escala es poder realizar suspensiones bacterianas ajustadas a un patrn, generalmente se suele usar el 0,5 Mc Farland, para esto se toma una muestra de nuestra bacteria y la inoculamos en un tubo con solucin salina, en el momento en que se produzca un poco de turbidez ya estamos en el 0,5 (de forma visual). La finalidad, es establecer una relacin entre una precipitacin qumica y una suspensin bacteriana.

PRELABORATORIO 2

Difusin en agar. Este mtodo, que es el ms frecuentemente usado, es tambin llamado difusin por disco o Kirby-Bauer, En este caso, el microorganismo es inoculado en la superficie de una placa de agar, sobre el cual se colocan discos impregnados con una concentracin conocida del antibitico.. Las placas se incuban por 16-18 horas a 35 C. Durante la incubacin, el antibitico difunde radialmente desde el disco a travs del agar, por lo que su concentracin va disminuyendo a medida que se aleja del disco. En un punto determinado, la concentracin del antibitico en el medio es incapaz de inhibir al germen en estudio. El dimetro del rea de inhibicin alrededor del disco puede ser convertido a las categoras de susceptible, intermedio o resistente (S,I, o R) de acuerdo a las tablas publicadas por el National Committee for Clinical Laboratories Standards. Si las recomendaciones para realizar este mtodo son fielmente seguidas, las categoras se correlacionan muy bien con los resultados de los otros mtodos.
1.

Dilucin en agar. Es considerado el mtodo de referencia . En este mtodo, placas conteniendo una determinada concentracin de un antibitico son inoculadas con el microorganismo en estudio y luego incubadas por 16 a 18 horas. Despus de la incubacin, se examina si el organismo crece o no en cada una de las placas, con lo cual se determina la concentracin inhibitoria mnima (CIM) para el antibitico. Si una cepa de S.aureus crece en una placa que contiene una concentracin de oxalina de 0,06 ug/ml pero no crece en una placa con una concentracin de oxalina 0,l2 ug/ml, significa que la CIM de oxalina que se requiere para inhibir a ese organismo es 0,12 ug/ml. Dilucin en caldo. En este caso, tubos (macrodilucin) o microplacas (microdiluci) contienen concentraciones crecientes de un determinado

antibitico. El organismo en estudio es inoculado en los diferentes tubos o pocillos de la microplaca y la CIM es determinada despus de la incubacin, de la misma forma descrita anteriormente para el mtodo de la dilucin en agar. E-test. Este mtodo ha sido descrito ms recientemente y representa una sofisticada combinacin de los mtodos descritos anteriormente. El E-test es ms simple que otros mtodos para obtener una CIM. Utiliza una tira de plstico que contiene concentraciones crecientes de un determinado antibitico que van desde 0,016 ug/ml hasta 256 ug/ml/ Esta tira se pone sobre una placa de agar que ha sido inoculada con el organismo en estudio. Despus de incubar la placa por 16 a 18 horas, se forma un rea de inhibicin de forma elptica, en la cual la concetracin inhibitoria mnima puede ser leda directamente (ver Figura 1). Este es el mtodo de eleccin para hacer estudios de susceptibilidad en grmenes problemticos o con requerimientos especiales, como por ejemplo Streptococcus pnemoniae, Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae y grmenes anaerbicos.

Figura 1 Representacin esquemtica del mtodo del Etest. La flecha indica la zona donde se lee la Concentracin Inhibitoria Mnima (Reproducida con la autorizacin de AB Biodisk, Solna, Suecia)

Mtodos automatizados. En este momento existen varios sistemas que ofrecen diferentes niveles de automatizacin para el estudio de susceptibilidad. Utilizan una medicin turbidimtrica o fluoromtrica para detectar crecimiento bacteriano en un medio lquido. La mayora de ellos emplea el mtodo de microdilucin y perodos de incubacin menores que los habituales. Estos mtodos son bastante confiables para el estudio de enterobacterias y otros grmenes de crecimiento rpido, pero generalmente no son los adecuados para los de crecimiento lento o con requerimientos especiales.
2. Ciprofloxacina: Es un antibitico del grupo de las fluoroquinolonas con efectos bactericidas. Su modo de accin consiste en paralizar la replicacin bacterial del ADN al unirse con una enzima llamada ADN girasa, que queda bloqueada. La funcin de la ADN girasa es deshacer el super enrollamiento de la doble cadena de ADN, permitiendo que otras enzimas puedan proceder a la replicacin propiamente dicha. La bacteria queda incapacitada para dividirse y finalmente muere sin proliferar.

Cefurexima: Es el nombre de un antibitico del grupo de las cefalosporinas de segunda generacin utilizada en el tratamiento de diferentes infecciones provocadas por bacterias susceptibles a los antibiticos beta-lactmicos, por lo que tienen actividad antimicrobiana en contra de organismos como Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae causante de la gonorrea y Borrelia burgdorferi, causante de la enfermedad de Lyme.

Trimetroprin producen una inhibicin secuencial en dos pasos del metabolismo del folato de algunas bacterias grampositivas y gramnegativas.